Name: Aplicações de interferência de RNA na barata americana (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-12-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 32 s
Description: Aprenda técnicas de interferência de RNA para estudar a barata americana, explorando mecanismos moleculares de comportamento e regeneração. Este método permite o silenciamento gênico em organismos não modelo.

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Este trabalho foi apoiado pela Fundação Nacional de Ciência Natural da China (Grant No. 32070500, 31620103917, 31330072, e 31572325 à C.R., Sh.L.), pela Fundação de Ciência Natural da Província de Guangdong (Grant No. 2021B1515020044 e 2020A1515011267 a C.R.), pelo Departamento de Ciência e Tecnologia da Província de Guangdong (Grant No. 2019B090905003 e 2019A0102006), pelo Departamento de Ciência e Tecnologia de Guangzhou (Grant No. 202102020110), pelo Shenzhen Science and Technology Program (Grant No. KQTD20180411143628272 para Sh.L.).

A linha de P. americana foi inicialmente fornecida pelo Dr. Huiling Hao. Esta espécie tem sido mantida com endogamia por 30 anos9.
1. Incubação e alimentação de P. americana
<ol><li>Colete oothecae fresco (imediatamente pós-colocação de ovos) de P. americana e incubar na incubadora escura a 25 °C e 60% de umidade por ~25 dias. Em seguida, aumente a temperatura e a umidade para 30 °C e 75% 3 dias antes do eclosão.</li>
	<li>Use uma peneira com abertura de 4 mm para separar as ninfas eclodidas da oothecae.</li>
	<li>Mantenha as ninfas em recipientes cilíndricos (12 cm de diâmetro e 10 cm de altura) no escuro a 28 °C, 70% de umidade. Escove a borda interna dos recipientes com vaselina para evitar que as baratas escapem. Fornecer comida de rato, água e abrigo (bandejas de ovos). Preste atenção à atividade das ninfas e limpe regularmente as fezes e detritos.</li>
</ol>2. Seleção das ninfas em instar adequada
<ol><li>Use um tubo de vidro para escolher o P. americana recém-moldado (branco na cor do corpo). Mantenha-os em novos recipientes e aguarde o estágio correto para o tratamento. NOTA: Após ~19 dias sob as condições de alimentação acima, as ninfasnas instars 3 estarão disponíveis para injeção. A cor das baratas recém-moldadas é branca, e as estrelas são esclarecidas por tempos de fusão.</li>
</ol>3. Preparação do fragmento de alvo com promotores T7
<ol><li>Usando o cDNA de P. americana como modelo, projetamos primers emparelhados para executar PCR para obter fragmento de DNA de 300-800 bp do genealvo 9. Em seguida, clone o fragmento PCR em um vetor pTOPO (ver Tabela de Materiais) para sequenciamento.</li>
	<li>Usando o DNA do fragmento de destino como modelo, sintetize um novo par de primers com sequência de promotores T7 (5'-GGATCCTACGACTCACTATAGG-3') nos terminais de 5' e realize outra rodada de PCR para obter o fragmento de destino com promotores T7 em cada lado9.</li>
</ol>4. Transcrição e síntese de dsRNA in vitro
<ol><li>Adicione 10 μL de tampão T7 2X, 2 μL do Enzima Mix, T7 Express (ver Tabela de Materiais) e 2 μg de produto PCR (obtido na etapa 3.2) no sistema de reação e somar o volume total a 20 μL com ddH2O. Misture suavemente de cabeça para baixo manualmente e incubar a 37 °C por 30 min e 70 °C por 10 min, e, em seguida, esfriar lentamente até a temperatura ambiente.</li>
	<li>Diluir solução RNase A (4 μg/μL) com ddH2O a uma razão de 1:200. Em seguida, adicione 1 μL de DNase RNase-Free RNase (1 U/μL) e 1 μL de solução RNase A diluída ao sistema (ver Tabela de Materiais). NOTA: Agora, o volume de um único sistema é de 22 μL.</li>
	<li>Incubar a 37 °C por 30 min. Em seguida, adicione 10% do volume total (ao realizar reações N simultaneamente, o volume total é N x 22 μL) de acetato de sódio e três volumes do volume total de isopropanol.</li>
	<li>Misture suavemente de cabeça para baixo manualmente, coloque no gelo por 5 minutos e centrífuga a 13.000 x g por 10 min a 4 °C.</li>
	<li>Retire o supernatante com uma pipeta, lave o resíduo com 75% de etanol (com 25% de pirocarbonato de ditila (DEPC) água tratada e, em seguida, centrífuga a 13.000 x g por 5 min a 4 °C.</li>
	<li>Remova o supernatante novamente. Seque a pelota por 15 minutos em temperatura ambiente. Use ~100 μL de água DEPC para dissolver dsRNA e, em seguida, dilua o dsRNA para os 2 μg/μL finais. NOTA: O dsRNA pode ser armazenado a -80 °C por 6 meses.</li>
</ol>5. Carregar a solução dsRNA na seringa
<ol><li>Configure o programa na bomba de micro injeção (ver Tabela de Materiais) com antecedência para garantir que o volume de cada injeção seja consistente. Antes de usar a seringa, limpe a seringa preenchendo-a com água DEPC 8-10 vezes.</li>
	<li>Instale a seringa de 10 μL na bomba de micro injeção, inicie a bomba e encha a seringa com 10 μL de solução dsRNA (preparada na etapa 4.6). Injete 1 μL do dsRNA em uma ninfa instar 3rd (ver passo 2) e certifique-se de que ele não vaze para o corpo.</li>
</ol>6. Injetando dsRNA para P. americana
<ol><li>Anestesiar as baratas com uma concentração aumentada de CO2 em um recipiente até que as baratas não se movam mais, e então proceda imediatamente com a injeção.</li>
	<li>Pegue delicadamente a barata com pinças, e entregue a barata em direção à agulha com a mão. Em seguida, insira a agulha através da lacuna entre dois somitas abdominais horizontalmente contra a epiderme. Sobre a profundidade de inserção, quanto mais rasa, melhor.</li>
	<li>Então, injete a solução dsRNA na barata. Finalmente, puxe a ponta da agulha. Certifique-se de que a ponta da agulha está o mais próxima possível da epiderme para evitar danificar órgãos internos. NOTA: A injeção deve ser feita sob um microscópio de dissecção.</li>
	<li>Coloque as baratas injetadas em recipientes limpos de bioensaio. Espere cerca de 10-20 minutos para deixá-los se recuperar dos efeitos de CO2 . Rotule os recipientes com a data de injeção, tipo e dose de dsRNA e idade do P. americana.</li>
	<li>Coloque as baratas injetadas em um ambiente escuro a 28 °C, 70% de umidade, forneça água, ração e abrigo, e observe possíveis alterações no fenótipo das baratas regularmente.</li>
</ol>7. Confirmação de knockdown e análise fenotípica
<ol><li>Avalie a eficiência da RNAi utilizando quaisquer técnicas de biologia molecular disponíveis, como PCR quantitativo em tempo real (qRT-PCR) e mancha ocidental. Para procedimentos detalhados de qRT-PCR e de manchas ocidentais, consulte Referências 1,12.</li>
	<li>Para observar e analisar fenótipos relacionados à RNAi, utilize o microscópio adequado para animais vivos. NOTA: O RNAi pode afetar a morfologia, o comportamento, a fusão, a regeneração dos membros e outras atividades fisiológicas das baratas. A frequência específica do fenótipo é calculada de acordo com condições específicas.</li>
</ol>

<ol><li>Miller, S. C., Miyata, K., Brown, S. J., Tomoyasu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+systemic+RNA+interference+in+the+red+flour+beetle+Tribolium+castaneum%3A+Parameters+affecting+the+efficiency+of+RNAi%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Dissecting systemic RNA interference in the red flour beetle Tribolium castaneum: Parameters affecting the efficiency of RNAi.</a> PloS One. 7 (10), 47431(2012).</li>
<li>Fire, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potent+and+specific+genetic+interference+by+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).</li>
<li>Ambesajir, A., Kaushik, A., Kaushik, J. J., Petros, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+interference%3A+A+futuristic+tool+and+its+therapeutic+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Saudi+Journal+of+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">RNA interference: A futuristic tool and its therapeutic applications.</a> Saudi Journal of Biological Sciences. 19 (4), 395-403 (2012).</li>
<li>Younis, A., Siddique, M. I., Kim, C. K., Lim, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+interference+%28RNAi%29+induced+gene+silencing%3A+A+promising+approach+of+hi-tech+plant+breeding%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">RNA interference (RNAi) induced gene silencing: A promising approach of hi-tech plant breeding.</a> International Journal of Biological Sciences. 10 (10), 1150-1158 (2014).</li>
<li>Bellés, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beyond+Drosophila%3A+RNAi+in+vivo+and+functional+genomics+in+insects%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Entomology%22%5BJournal%5D)">Beyond Drosophila: RNAi in vivo and functional genomics in insects.</a> Annual Review of Entomology. 55, 111-128 (2010).</li>
<li>French, A. S., Meisner, S., Liu, H., Weckström, M., Torkkeli, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome+analysis+and+RNA+interference+of+cockroach+phototransduction+indicate+three+opsins+and+suggest+a+major+role+for+TRPL+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Transcriptome analysis and RNA interference of cockroach phototransduction indicate three opsins and suggest a major role for TRPL channels.</a> Frontiers in Physiology. 6, 207(2015).</li>
<li>Hennenfent, A., Liu, H., Torkkeli, P. H., French, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+interference+supports+a+role+for+Nanchung-Inactive+in+mechanotransduction+by+the+cockroach%2C+Periplaneta+americana%2C+tactile+spine%5BTitle%5D)+AND+%22Invertebrate+Neuroscience%3A+IN%22%5BJournal%5D)">RNA interference supports a role for Nanchung-Inactive in mechanotransduction by the cockroach, Periplaneta americana, tactile spine.</a> Invertebrate Neuroscience: IN. 20 (1), 1(2020).</li>
<li>Immonen, E. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EAG+channels+expressed+in+microvillar+photoreceptors+are+unsuited+to+diurnal+vision%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">EAG channels expressed in microvillar photoreceptors are unsuited to diurnal vision.</a> The Journal of Physiology. 595 (16), 5465-5479 (2017).</li>
<li>Li, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genomic+and+functional+landscapes+of+developmental+plasticity+in+the+American+cockroach%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">The genomic and functional landscapes of developmental plasticity in the American cockroach.</a> Nature Communications. 9 (1), 1008(2018).</li>
<li>Zhao, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Grainy+head+signaling+regulates+epithelium+development+and+ecdysis+in+Blattella+germanica%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Science%22%5BJournal%5D)">Grainy head signaling regulates epithelium development and ecdysis in Blattella germanica.</a> Insect Science. 28 (2), 485-494 (2021).</li>
<li>Lozano, J., Belles, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conserved+repressive+function+of+Kr%C3%BCppel+homolog+1+on+insect+metamorphosis+in+hemimetabolous+and+holometabolous+species%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Conserved repressive function of Krüppel homolog 1 on insect metamorphosis in hemimetabolous and holometabolous species.</a> Scientific Reports. 1, 163(2011).</li>
<li>Philip, B. N., Tomoyasu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+knockdown+analysis+by+double-stranded+RNA+injection%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology+%28Clifton%2C+N.+J%29%22%5BJournal%5D)">Gene knockdown analysis by double-stranded RNA injection.</a> Methods in Molecular Biology (Clifton, N. J). 772, 471-497 (2011).</li>
<li>Zheng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR+interference-based+specific+and+efficient+gene+inactivation+in+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">CRISPR interference-based specific and efficient gene inactivation in the brain.</a> Nature Neuroscience. 21 (3), 447-454 (2018).</li>
<li>Garbutt, J. S., Bellés, X., Richards, E. H., Reynolds, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persistence+of+double-stranded+RNA+in+insect+hemolymph+as+a+potential+determiner+of+RNA+interference+success%3A+Evidence+from+Manduca+sexta+and+Blattella+germanica%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Insect+Physiology%22%5BJournal%5D)">Persistence of double-stranded RNA in insect hemolymph as a potential determiner of RNA interference success: Evidence from Manduca sexta and Blattella germanica.</a> Journal of Insect Physiology. 59 (2), 171-178 (2013).</li>
<li>Parrish, S., Fleenor, J., Xu, S., Mello, C., Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+anatomy+of+a+dsRNA+trigger%3A+differential+requirement+for+the+two+trigger+strands+in+RNA+interference%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Functional anatomy of a dsRNA trigger: differential requirement for the two trigger strands in RNA interference.</a> Molecular Cell. 6 (5), 1077-1087 (2000).</li>
<li>Lemonds, T. R., Liu, J., Popadić, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+contribution+of+the+melanin+pathway+to+overall+body+pigmentation+during+ontogenesis+of+Periplaneta+americana%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Science%22%5BJournal%5D)">The contribution of the melanin pathway to overall body pigmentation during ontogenesis of Periplaneta americana.</a> Insect Science. 23 (4), 513-519 (2016).</li>
<li>Jackson, A. L., Linsley, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noise+amidst+the+silence%3A+Off-target+effects+of+siRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Genetics%3A+TIG%22%5BJournal%5D)">Noise amidst the silence: Off-target effects of siRNAs.</a> Trends in Genetics: TIG. 20 (11), 521-524 (2004).</li>
<li>Patel, M., Peter, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+DISE-inducing+shRNAs+by+monitoring+cellular+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle+%28Georgetown%2C+Tex%29%22%5BJournal%5D)">Identification of DISE-inducing shRNAs by monitoring cellular responses.</a> Cell Cycle (Georgetown, Tex). 17 (4), 506-514 (2018).</li>
<li>Ventós-Alfonso, A., Ylla, G., Montañes, J. C., Belles, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNMT1+promotes+genome+methylation+and+early+embryo+development+in+cockroaches%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">DNMT1 promotes genome methylation and early embryo development in cockroaches.</a> iScience. 23 (12), 101778(2020).</li>
<li>Wang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variation+in+RNAi+efficacy+among+insect+species+is+attributable+to+dsRNA+degradation+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochemistry+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Variation in RNAi efficacy among insect species is attributable to dsRNA degradation in vivo.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 77, 1-9 (2016).</li>
<li>Bi, F., Liu, N., Small Fan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((interfering+RNA%3A+A+new+tool+for+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">interfering RNA: A new tool for gene therapy.</a> Current Gene Therapy. 3 (5), 411-417 (2003).</li>
</ol>

Os autores declaram que não têm conflitos de interesse.

Este relatório descreveu uma estratégia metodológica passo a passo da RNAi em P. americana; note-se que também pode ser aplicado a outras baratas (Blattella germanica, por exemplo) e muitos outros insetos com pequenas alterações. No entanto, a eficiência de silenciamento genético da RNAi nem sempre é alta o suficiente, com uma desvantagem óbvia em comparação com a estratégia de nocaute genético13. O seguinte efeito residual do nível genético pode interferir com os fenótipos reais...

A interferência de RNA (RNAi), um mecanismo evolutivamente conservado, gradualmente se torna uma ferramenta essencial de reversão genética para inibir a expressão genética em muitos organismos1, uma vez que Andrew Fire e Craig Mello2 desenvolveram a estratégia de silêncio genético mediado por duplar (dsRNA). dsRNA é cortado em fragmentos de 21-23 nucleotídeos, pequenas RNAs interferentes (siRNAs), pela enzima Dicer em células para ativar a via RNAi. Em seguida, siRNAs são incorporadas ao complexo de silenciamento induzido pelo RNA (RISC), que casa o mRNA alvo, causa decote mRNA e, finalmente, resulta na perda da função genética 3,4,5. Entre as espécies de insetos, muitos experimentos sistêmicos rnai foram relatados até agora em muitas ordens de insetos, como Orthoptera, Isoptera, Hemiptera, Coleoptera, Neuroptera, Diptera, Hymenoptera, Lepidoptera e Blattodea 5,6,7,8.
As baratas (Blattaria) são uma família essencial de insetos em estudos de desenvolvimento e metamórficos com seus ciclos de crescimento rápido, forte adaptabilidade ao meio ambiente e alta plasticidadede desenvolvimento 9. Antes de descobrir que a RNAi era compatível com baratas, pesquisas anteriores focavam apenas na prevenção e controle de baratas devido à escassez de técnicas de manipulação genética em baratas. A estrutura única da ootheca da barata tornou desafiador realizar o nocaute genético baseado em injeção de embriões com o sistema CRISPR-Cas9. Além disso, a maioria dos tecidos em baratas (como P. americana) apresenta robusta resposta sistêmica RNAi, permitindo a rápida geração de fenótipos disfuncionais injetando um ou mais dsRNAs 9,10,11. Essas características fizeram da RNAi uma técnica indispensável em pesquisa funcional genética em P. americana.
Embora tenha sido relatado o uso de RNAi em pesquisa genética funcional em P. americana , não foi relatada nenhuma descrição detalhada ou passo a passo. Este relatório fornece uma diretriz operacional passo a passo para rnai em P. americana, útil para o estudo da função genética em outras baratas. Além disso, este guia não se limita a Blattodea e pode ser aplicado a muitos outros insetos com pequenas modificações.

<table><tbody><tr><td>701 N 10 &micro; L Syr (26s / 51/2)</td> <td>Hamilton</td><td>PN: 80300</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora</td> de <td>injeção Ningbo Jiangnan Instrument Factory</td><td>RXZ-380A-LED</td><td>Para incubação e alimentação de baratas</td></tr><tr><td>Bomba de microinjeção</td><td>Alcott Biotechnology</td><td>ALC-IP600</td><td>Injeção</td></tr><tr><td>pTOPO-Blunt Cloning Kit</td><td>Aidlab Biotechnology</td><td>CV16</td><td>para clonagem</td></tr><tr><td>de genes quantitativos Sistemas de PCR em tempo real</td><td>Bio-Rad</td><td>CFX Connect</td><td>Para análise de qRT-PCR</td></tr><tr><td>T7 RiboMAX Express RNAi System</td><td>Promega</td><td>P1700</td><td>Para síntese de dsRNA, que contém Rnase A Solution (4 &mu; g/&mu; L), Acetato de Sódio, 3,0M (pH 5,2), Mistura de Enzimas, T7 Express, Água Livre de Nuclease, Tampão Express T7 2x, Cicladores Térmicos DNase Livres de RNase RQ1</td></tr><tr><td></td><td>Bio-Rad</td><td>S1000</td><td>Para amplificação de DNA</td></tr></tbody></table>

aplicações de interferência de rna na barata americana

Applications of RNA Interference in American Cockroach

Baratas, uma praga sanitária, são espécies essenciais em estudos de desenvolvimento de insetos e metamórficos devido à sua fácil alimentação e características hemimetabólicas. Ao todo com sequências de genomas bem anotadas, essas vantagens fizeram da barata americana Periplaneta americana, um importante modelo de insetos hemimetados. Limitado pela escassez de estratégia de nocaute, o knockdown genético baseado em RNA eficaz (RNAi) torna-se uma técnica indispensável na pesquisa genética funcional da P. americana. O presente protocolo descreve as técnicas de operação RNAi em P. americana. O protocolo inclui (1) seleção do P. americana em estágios de desenvolvimento adequados, (2) preparação para a configuração da injeção, (3) injeção de dsRNA e (4) detecção de eficiência de knockdown genético. RNAi é uma poderosa ferramenta genética reversa em P. americana. A maioria dos tecidos P. americanas são sensíveis ao dsRNA extracelular. Sua simplicidade permite que os pesquisadores obtenham rapidamente fenótipos disfuncionais sob uma ou múltiplas injeções de dsRNA, permitindo que os pesquisadores usem melhor o P. americana para estudos de desenvolvimento e metamórficos.

A figura 1 mostra uma injeção bem sucedida. A seringa de microinjeção com uma agulha de micro diâmetro deve ser colocada horizontalmente no propulsor (Figura 1A). A agulha é inserida através da lacuna entre duas somitas abdominais horizontalmente contra a epiderme (Figura 1B). Certifique-se de que o líquido vai para o abdômen P. americana . O ângulo muito íngreme da agulha danificará os órgãos internos (<strong cla...

O presente protocolo descreve as diretrizes passo a passo para as técnicas de operação rnai em P. americana.

Aplicações de interferência de RNA na barata americana

Cockroaches, a sanitary pest, are essential species in insect developmental and metamorphic studies due to their easy feeding and hemimetabolous ...

O protocolo fornece uma maneira simples de estudar baratas americanas. Uma praga sanitária comum e um inseto benéfico para a medicina tradicional chinesa. Ajudará a explorar os mecanismos moleculares de múltiplas atividades de vida de baratas americanas derrubando genes específicos.A principal vantagem desta tecnologia é que ela pode derrubar genes em baratas americanas ou outros insetos similares que não são adequados para a edição de genes. Essa tecnologia pode ser usada para explorar vários campos, como a regulação genética e epigenética, processo de desenvolvimento de tecidos, regeneração de apêndices, comportamento de acasalamento e outros lados interessantes da barata americana. Esta tecnologia é fácil de operar e versátil.Sugerimos manter os animais saudáveis durante o tratamento de injeção de DSRA. Acredito que os novatos podem facilmente dominar essa técnica depois de várias sessões de treino. Para começar, separe as ninfas eclodidas da oothecae com uma peneira de abertura de quatro milímetros.Escolha o P.americana recém-maltado branco com um tubo de vidro. Coloque o P.americana em novos recipientes e aguarde o estágio correto para o tratamento. No sistema de reação, adicione 10 microliters de tampão T7 2X, 2 microliters do T7 Express Enzima Mix e dois microgramas de produto PCR.Finalmente, compõem o volume total para 20 microliters com água dupla destilada. Misture suavemente de cabeça para baixo manualmente e incubar a 37 graus Celsius por 30 minutos, depois 70 graus Celsius por 10 minutos. Diluir 4 microgramas por microliter RNase Uma solução com água DEPC a uma razão de 1 a 200.Em seguida, adicione 1 microliter de uma unidade por microliter RQ1 RNase Free Dnase e 1 microliter de solução RNase A diluída ao sistema. Incubar a 37 graus Celsius por 30 minutos. Em seguida, adicione 10% do volume total de acetato de sódio e três volumes do volume total de isopropanol.Misture suavemente de cabeça para baixo manualmente, em seguida, coloque no gelo por cinco minutos e centrífuga a 13.000 g por 10 minutos a 4 graus Celsius. Remova o supernatante com uma pipeta. Em seguida, lave o resíduo com 75% de etanol, com 25% de água tratada DEPC, depois centrífuga a 13.000 g por 5 minutos a 4 graus Celsius.Retire o supernasce novamente, o ar seque a pelota por 15 minutos em temperatura ambiente. Em seguida, dissolva o RNA duplo encalhado com cerca de 100 microlitres de água DEPC e dilui-o para a concentração final de 2 microgramas por microliter. Configure o programa na bomba de microinjeção para garantir que o volume de cada injeção seja consistente.Em seguida, limpe a seringa enchendo-a com água DEPC 8 a 10 vezes. Instale a seringa de 10 microliter na bomba de micro injeção. Em seguida, inicie a bomba e encha a seringa com 10 microliters de solução RNA duplamente encalhada.Anestesiar as baratas com dióxido de carbono, depois pegá-las suavemente com pinças e entregar a barata em direção à agulha à mão. Em seguida, insira a agulha através da lacuna entre dois somitas abdominais horizontalmente contra a epiderme. Injete a solução de RNA duplamente encalhada na barata garantindo que a ponta da agulha esteja o mais próxima possível da epiderme para evitar danificar órgãos internos.Finalmente, puxe a ponta da agulha. Coloque as baratas injetadas em recipientes limpos de bioensaio. Espere cerca de 10 a 20 minutos para deixá-los se recuperar dos efeitos do dióxido de carbono.Rotule os recipientes com a data de injeção, tipo e dose de RNA duplo encalhado e idade do P.americana. Ddc ou DOPA decarboxilase e Dpp ou genes decapentagáicos foram selecionados como dois exemplos para observar o fenótipo das baratas malteadas após injeção dupla de RNA encalhada e dsMocK que não tem alvo nos animais foi tomado como um controle negativo. A eficiência rnai foi detectada pelo QRT PCR.Os genes foram significativamente derrubados com um valor P inferior a 0,01 para dsDdc e menos de 0,05 para dsDpp. P.americana com genes Ddc knockdown teve a epiderme branca devido à melanização bloqueada. No experimento com injeções de dsDpp, o RNAi interrompeu a regeneração dos membros.Os insetos devem ser saudáveis e injetados sem danos. Esta tecnologia fornece uma maneira simples de explorar funções genéticas para insetos que não podem ser editados por genes, como barata americana.

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Aqui, descrevemos um processo para a inibição da função do gene em vectores mosquitos doença através do uso de quitosano / interferindo nanopartículas de RNA que são ingeridos pelas larvas.

A quitosana / RNA de interferência Nanoparticle Mediated silenciamento gênico na Doença Vector Mosquito Larvas

A interferência de RNA (RNAi) é uma ferramenta extremamente valiosa para descobrir a função do gene. No entanto, a capacidade de direcionar genes usando RNAi durante os estágios pré-adultos é limitada no principal vetor da malária humana, Anopheles gambiae. Descrevemos um protocolo de RNAi para reduzir a função do gene por meio de injeção direta durante o desenvolvimento da pupa.

RNAi gatilho para o interior<em&gt; Anopheles gambiae</em&gt; As pupas

Aqui, apresentamos os protocolos de criação de um besouro intermediário de germes, Dermestes maculatus (D. maculatus) no laboratório. Também compartilhamos protocolos de RNAi embrionário e parental e métodos para análise de fenótipos embrionárias para estudar a função de genes nesta espécie.

Criação e Double-stranded mediada por RNA silenciamento de genes na Esconder Beetle, Dermestes maculatus

Este manuscrito demonstra o esgotamento de expressão gênica no intestino da barata alemão através da ingestão oral de RNA double-stranded encapsulada em lipossomas.

Uso prático da interferência do RNA: Oral entrega de RNA Double-stranded em lipossomas transportadoras para baratas

Este artigo demonstra novas técnicas desenvolvidas para entrega oral de RNA double-stranded (dsRNA) através dos tecidos vasculares das plantas para o RNA de interferência (RNAi) na seiva do floema alimentação de insetos.

Métodos de entrega Double-stranded RNA Oral para induzir a interferência do RNA no floema e insetos Hemipteran planta-sap-alimentação

Este protocolo descreve uma metodologia de microinjeção que temos padronizado e utilizado por vários anos para entregar quantidades específicas de ácidos nucleicos diretamente a hemolinfa de mosquitos e moscas domésticas. Este protocolo resulta em mortalidade de injeção mínima e permite medições de dose correlacionado de fecundidade.

Reprodutível dsRNA Microinjection e Bioassay de oviposição em mosquitos e moscas domésticas

A interferência de RNA é uma técnica amplamente aplicável e poderosa para manipular a expressão genética em estágios específicos de desenvolvimento. Aqui, descrevemos os passos necessários para a implementação dessa técnica no besouro de mergulho aquático Thermonectus marmoratus, desde a aquisição de sequências genéticas até o knockdown de genes que afetam a estrutura ou o comportamento.

Interferência de RNA em besouros aquáticos como uma poderosa ferramenta para manipular a expressão genética em pontos de tempo específicos de desenvolvimento

A administração oral do dsRNA produzido por bactérias, um método de entrega para interferência de RNA (RNAi) que é rotineiramente utilizado em caenorhabditis elegans, foi aplicada com sucesso aqui em mosquitos adultos. Nosso método permite estudos robustos de genética reversa e estudos de vetores de bloqueio de transmissão sem o uso de injeção.

Administração eficaz de interferência oral de RNA (RNAi) para mosquitos anofeeles gâmbias adultos

Aqui, introduzimos um método de imersão detalhado da interferência de RNA em Bursaphelenchus xylophilus para facilitar o estudo das funções genéticas.

Aplicação de interferência de RNA no Nematode pinewood, Bursaphelenchus xylophilus

A manipulação de RNA de interferência (RNAi) apresenta um formidável desafio em muitas espécies de parasitoides com tamanho diminuto, como as vespas Trichogramma . Este estudo delineou um método RNAi eficiente em Trichogramma denrolimi. A presente metodologia fornece um modelo robusto para investigar a regulação gênica em vespas Trichogramma .

Interferência de RNA no parasitoide de ovos, Trichogramma dendrolimi Matsumura

Aprenda técnicas de interferência de RNA para estudar a barata americana, explorando mecanismos moleculares de comportamento e regeneração. Este método permite o silenciamento gênico em organismos não modelo.

Aplicações de interferência de RNA na barata americana

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