Um método de perfusão transcárvia alimentado pela gravidade para análise histológica do sistema nervoso central do rato

Este protocolo fornece um método simples de perfusão fixativa em camundongos que permitirá o estudo histológico dos tecidos CNS sem investimento significativo. A principal vantagem do método de perfusão da gravidade apresentado aqui é que o aparelho de profusão pode ser construído com componentes facilmente disponíveis. Demonstrando o procedimento estará Arnav Rana, um estudante de doutorado do laboratório do Dr. Xin Jie Chen.

Para começar, usando uma lâmina afiada, corte os canudos internos de duas garrafas de lavagem de 500 mililitros, cortando-as para o lado interno do parafuso na tampa. Corte um buraco quadrado de quatro por quatro centímetros no fundo de cada garrafa tampão, em seguida, corte outro pequeno buraco no fundo de cada garrafa para permitir a passagem de uma micro espátula de aço inoxidável dobrado. Em seguida, crie uma dobra em forma de S nas espátulas de micros para que possam ser usadas como ganchos para pendurar as garrafas tampão.

Insira as micro espátulas dobradas nas aberturas apropriadas nas garrafas tampão. Em seguida, conecte firmemente dois tubos de 25 centímetros de comprimento com as saídas externas de palha da garrafa e junte as extremidades desses tubos juntamente com o conector Y, em seguida, junte-se ao tubo de 2 metros de comprimento para a extremidade livre do conector Y. Depois de remover o êmbolo de uma seringa de 1 mililitro, corte a seringa aproximadamente 6 centímetros de distância da ponta, primeiro marcando o plástico com uma lâmina de barbear e, em seguida, estalando bruscamente o plástico da seringa.

Insira a face cortada da seringa na extremidade livre do tubo plástico a uma profundidade suficiente e garanta uma vedação apertada. Em seguida, rotule uma garrafa tampão como PFA e a outra como PBS. Meça aproximadamente 1/3 do comprimento da abertura da garrafa e desenhe uma linha em torno da circunferência da garrafa neste momento para denotar o nível de enchimento adequado das soluções perfusadas.

Depois de endireitar um grande clipe de papel, crie um loop que possa caber em torno da circunferência da tubulação e coloque este laço ao redor da tubulação, apenas proximal à seringa, em seguida, coloque um bloco de isopor de tamanho apropriado na bandeja de vidro, coloque as extremidades do clipe de papel no bloco de isopor para afixar o tubo e usar uma toalha de papel, levantar a parte frontal da bandeja de vidro em aproximadamente 2 centímetros. Depois de enxaguar um béquer de 1 litro com água destilada, encha-o com aproximadamente 800 mililitros de 18 miliohms de água de grau molecular-biologia. Aqueça o béquer em um micro-ondas por três minutos ou até que a temperatura da água atinja 65 graus Celsius, em seguida, coloque-o em um aquecimento ou uma placa de agitação mantida em um capô de fumaça.

Em seguida, enxágue uma haste de agitação com água destilada e coloque-a no béquer. Inicie o agitador e gire a placa quente em fogo médio, garantindo que a temperatura da água não vá acima de 70 graus Celsius. Depois de usar uma máscara cirúrgica, luvas e jaleco, meça 40 gramas de pó PFA e adicione-o na água aquecida, em seguida, usando uma pipeta de transferência, adicione algumas gotas de hidróxido de sódio de 5 molares à solução.

Deixe o pó dissolver-se completamente. Se o pó não tiver totalmente dissolvido, adicione mais hidróxido de sódio conforme necessário. Uma vez que todo o PFA tenha quase dissolvido, pare a agitação e o aquecimento e adicione imediatamente 100 mililitros de PBS 10x, em seguida, use a água de 18 milohms molecular-biologia-grau para completar o béquer à marca de 1 litro.

Cubra o béquer com plástico e coloque-o em um congelador de menos 20 graus Celsius até que a solução atinja a temperatura ambiente. Depois de calibrar um medidor de pH usando padrões apropriados, meça o pH da solução enquanto o béquer estiver em uma placa de agitação. Adicione ácido clorídrico até que o pH atinja 7,4.

Se o pH estiver muito baixo, adicione hidróxido de sódio de 5 molares para aumentar o pH. Em seguida, conecte um frasco de vácuo ao aspirador e coloque um funil Buchner de cerâmica limpa com papel filtro no frasco. Depois de ligar o vácuo, molhe o papel filtro usando uma pipeta de transferência preenchida com a solução 4% PFA e, em seguida, despeje lentamente a solução sobre o papel do filtro até que toda a solução tenha sido filtrada.

Após a filtragem, armazene a solução em um recipiente protegido por luz a 4 graus Celsius até o uso. No capô da fumaça, coloque um bloco de dissecação de isopor em uma bandeja de vidro. Certifique-se de que o bloco de dissecação tem de cinco a seis agulhas curtas para conter o rato durante a cirurgia e duas agulhas longas para suportar a tubulação de perfusão.

Em seguida, enxágue o aparelho de perfusão com água destilada. Depois de toda a água ter drenado, pendure as garrafas de profusão um metro acima do animal para serem perfundidas, em seguida, prepare 1x PBS não estéril usando 10x PBS diluído com biologia molecular-grau-água. Fixar a linha principal do aparelho de perfusão usando um hemostat e, em seguida, fixar a linha PFA com outro hemostat.

Depois de encher o recipiente tampão com PBS, coloque a extremidade da seringa do aparelho de perfusão em um béquer para coletar o tampão de resíduos e remova o hemostat ocluíndo a linha principal. Enquanto o PBS flui através da linha, toque vigorosamente nas paredes do tubo para remover o ar preso. Uma vez que todo o ar tenha sido removido do buffer e das linhas principais, oclui o fluxo colocando um hemostat na linha principal.

Em seguida, remova o hemostat da linha PFA, permitindo que o PBS flua de forma retrógrada até a garrafa PFA enquanto toca quaisquer bolhas na linha PFA. Continue a permitir que o PBS entre na linha PFA até que possa ser visto logo acima da abertura da garrafa, em seguida, oclua a linha PFA com um hemostat para parar o fluxo de PBS para a garrafa PFA. Em seguida, conecte a agulha de infusão de borboleta à seringa de perfusão e abra o hemosta da linha principal para lavar PBS através da linha e remover bolhas da seringa de perfusão.

Depois que as bolhas tiverem sido removidas, feche o hemostat da linha principal. Certifique-se de que a garrafa PBS está agora aproximadamente 1/3 cheia de PBS. Se necessário, lave o PBS através da linha principal ou encha mais PBS no frasco tampão até 1/3 de sua capacidade total.

Uma vez que todas as bolhas tenham sido removidas das linhas PBS, PFA e principal, encha a garrafa PFA com solução PFA de 4% à temperatura ambiente até a marca preta na garrafa. Em seguida, prepare-se para a cirurgia de não sobrevivência limpando primeiro os instrumentos necessários com água e depois com 70% de etanol. Depois de fixar um rato C57 preto 6J anestoizado no bloco de isopor, comece a cirurgia levantando a pele abdominal com fórceps de pele e cortando a parede abdominal com uma tesoura grande.

Continue o corte abdominal superiormente em direção ao fígado, em seguida, desprende o fígado da parede abdominal anterior e continue a incisão inicial superiormente em direção ao diafragma. Quando a incisão chegar ao diafragma, usando uma tesoura de dissecação fina, faça um furo no diafragma e corte as costelas do lado direito do rato aproximadamente a meio caminho da axila direita, em seguida, faça uma incisão semelhante, mas mais longa através do lado esquerdo do diafragma quase todo o caminho até a axilla esquerda. Reflita a parede do peito e fixe-a no bloco de isopor.

Depois de identificar o ventrículo esquerdo, usando fórceps finos, mantenha o coração estável com pressão de luz, em seguida, abra o hemostata da linha principal para permitir que o PBS flua através da agulha e imediatamente perfurar o ventrículo esquerdo com a agulha. Certifique-se de que a agulha está inserida não mais do que 0,5 centímetros no ventrículo. Em seguida, descanse a tubulação de borboleta em um X feito no isopor com duas agulhas grandes de calibre 18.

Identifique a veia cava inferior quando ela sai do fígado e transecte-a usando uma tesoura de dissecação fina. Continue a perfusão pbs até que o líquido que flui para fora da veia cava inferior esteja livre de sangue, em seguida, trabalhando rapidamente, ocluir a linha PBS com um hemostat e abrir a linha PFA. Deixe o PFA perfundir por alguns minutos até que a cauda comece a enrolar.

Quando a cauda começar a enrolar, comece um temporizador de 50 minutos. Após 50 minutos, oclua a linha principal com um hemostat e retire a agulha do ventrículo esquerdo. Em seguida, coloque o mouse em um recipiente rotulado de solução PFA a 4 graus Celsius durante a noite.

A perfusão de alta qualidade é indicada pela ausência de sangue no fígado, medula espinhal e estruturas profundas do sistema nervoso central. O sangue observado no cérebro está localizado entre o crânio e a dura-secção e, portanto, não é problemático ou sugestivo de má qualidade de perfusão. A detecção de alfa-sinucleína após este método de perfusão mostra que a alfa-sinucleína fosforilada acumula-se significativamente mais alto em camundongos sintomáticos de 15,5 meses de idade em relação a camundongos assintomáticos de sete meses de idade que expressam alfa-sinucleína A53T humana.

Este resultado é consistente com relatórios que descrevem um enriquecimento da citopatologia nos chifres anteriores da medula espinhal e no cérebro médio desses camundongos. É importante que nenhum órgão abdominal seja cortado ao acessar a cavidade torácica. Além disso, a agulha de perfusão não deve ser colocada muito profundamente dentro do ventrículo esquerdo.