Eficiente SARS-CoV-2 Quantitative Reverse Transcriptase PCR Saliva Diagnostic Strategy utilizando robôs de pipetação de código aberto

Desenvolvemos um teste de diagnóstico e fluxo de trabalho COVID 19 de baixo custo, baseado em saliva, que é fácil de implementar e escalar para aplicações de triagem comunitária em larga escala. Aqui usamos robôs de manuseio líquido de código aberto, termocicladores padrão e software para realizar testes diretos de saliva sem extração ou buffers de estabilização, enquanto ainda fornecemos resultados diagnósticos precisos. Devido aos simples fluxos de trabalho paralelos automatizados, o sistema pode ser dimensionado para realizar milhares de testes diariamente com requisitos mínimos de equipamentos, espaço e pessoal.

Além de Kylie King, Rachel Ham, nossa supervisora de laboratório clínico e Austin Smothers, nossa coordenadora de educação, ajudarão a demonstrar o procedimento Comece descontaminando o exterior dos tubos de coleta de saliva com 70% de etanol e transferindo-os para o laboratório para testes. Registo a chegada da amostra escaneando cada código de barras da amostra na planilha de admissão diária. Aqueça as amostras de varredura por 30 minutos em um forno Celsius de 95 graus e, em seguida, remova as amostras usando luvas resistentes ao calor.

Abra as planilhas diárias de carregamento de amostras para cada robô de carregamento de amostras na estação de atribuição de amostras. Em seguida, atribua 188 amostras para cada placa de 384 poços. Rotular bandejas com nome da placa, data e número do trimestre.

Escaneie as amostras para entrar na planilha de carregamento da amostra. Na estação de carregamento de amostras, forque dois conjuntos completos de oito racks impressos em 3D, correspondentes à colocação do convés no robô. Uncap quarter one tubos e colocá-los em racks impressos em 3D, começando com a posição A1 no rack um.

Encha cada rack da esquerda para a direita e de cima para baixo. Continue este padrão de carregamento no rack dois, em seguida, proceder para racks quatro e cinco. Coloque racks de amostra carregados em um, dois, quatro, cinco, sete, oito, 10, 11.

Coloque dicas P20 nos decks três e nove. Para simplificar o processo de configuração, carregue materiais de trás para frente no robô. As placas de mix mestre são produzidas em um robô dedicado e armazenadas a quatro graus Celsius.

Uma placa é usada de cada vez e é rotulada com nome da placa, e uma lâmina afiada é usada para cortar uma linha na folha ao redor dos poços de controle. Coloque a placa de mistura mestre no convés seis e retire a tampa da folha, deixando para trás o pequeno retângulo cobrindo os poços de controle. Descubra as caixas de ponta e feche o robô.

Inicialize o protocolo operacional Python personalizado clicando em iniciar a execução através do aplicativo de desktop robô. Cada trimestre leva 24,5 minutos para carregar na placa. Defina um temporizador como um lembrete.

Enquanto o robô está em execução, uncap e carregar dois tubos de amostra no segundo conjunto de racks impressos em 3D. Quando o robô pausar, remova os racks do trimestre um e substitua-os pelos racks do trimestre dois e clique em retomar a execução no aplicativo de desktop. Recapitule os tubos de amostra de um quarto e armazene-os em uma geladeira de quatro graus Celsius enquanto aguarda resultados.

Repita este processo de carregamento para os quartos três e quatro. Transfira a placa carregada para um armário de bio segurança. Para minimizar a contaminação, mantenha a placa coberta durante a transferência.

Reúna as amostras repetidas e atribua-as como as últimas amostras no quarto trimestre. Numerar as amostras, digitalizar os códigos de barras e inserir o local original da amostra e o resultado na planilha de carregamento da amostra. Transfira as amostras repetidas para o armário de bio segurança.

Não carregue os tubos de amostra repetido nos racks de carregamento do robô. Pipeta dois microliters de cada amostra repetida para os poços corretos. Use a pipeta designada para adicionar amostras de pacientes.

Mantenha os poços de controle cobertos com papel alumínio, adicionando amostras para minimizar a contaminação. Retire a tampa da folha sobre os poços de controle usando fórceps. Pipeta dois microliters de amostras positivas confirmadas de pacientes nos poços M23 e M24.

Pipeta dois microliters de água livre de nuclease para poços N23 a N24 e dois microliters de 200 cópias por microliter misturaram controle positivo para Wells O23 a O24. Deixe os poços P23 a P24 vazios para monitorar a qualidade do lote master mix. Cubra a placa com uma vedação opticamente clara e use o rolo aplicador para aderir ao selo a todos os poços.

Vórtice a placa a 2.500 RPM por 30 segundos para misturar bem, em seguida, centrifugar a placa a 500 vezes G por um minuto. Selecione o programa de protocolo no software termociclador e salve o protocolo para placas futuras. Coloque a placa selada no termociclador e execute o protocolo.

Exporte os valores da TC e copie os valores na planilha de carregamento da amostra. Para um controle positivo, verifique se pelo menos um controle positivo produz valores de TC entre 22 e 28 para as sondas P1 e N1. Alternativamente, os conhecidos poços de amostra positiva produzem valores P1 e N1 CT inferiores a 33 nas sondas P1 e N1.

Para controle negativo, verifique se não há valores de CT N1 ou P1 em nenhum dos dois poços de controle negativos. Confirme se os valores ct têm curvas de amplificação válidas antes de invalidar a placa. Se p1 produzir um resultado de CT menor que 33, considere o bem válido e prossiga para o resultado de N1. Se P1 produzir um resultado de CT maior ou igual a 33 ou nenhum valor de TC, considere o bem como inválido.

Se n1 produz um resultado de CT menor que 33, avalie o bem como sim. Se n1 não produzir um valor de tomografia, avalie o bem como não. Se n1 produz um valor ct maior ou igual a 33, avalie o bem como nenhuma estrela.

Confirme se todos os valores do N1 CT estão associados a uma curva de amplificação real. Se um valor de TC para N1 não tem curva de amplificação, o poço é não. Identifique as amostras repetidas, rotule-as com um número de amostra interna e tipo de amostra e devolva-as ao fluxo de trabalho de carregamento.

As imagens representativas mostram a detecção RTQ PCR do RNA sintético N1 ou SARS CoV-2 e do DNA sintético P1 ou HSRPP30. As curvas padrão foram traçadas com desvios padrão para determinar o alcance da detecção precisa usando esta combinação de primer do teste. Os valores médios da TC obtidos nas respectivas diluições foram traçados contra a quantidade estimada de RNA sintético e DNA sintético.

Em ambos os casos, as curvas lineares apresentaram bons coeficientes de correlação em uma ampla gama de concentrações de cópias genéticas. Os valores de TC N1 obtidos a partir de amostras únicas usando o robô e o carregamento manual de amostras foram transpostos para determinar a variabilidade do ensaio inter entre o carregamento manual e o robô. A relação linear entre os métodos manual e automatizado produziu um alto coeficiente de correlação indicando que ambos os métodos são funcionalmente equivalentes.

A variabilidade intra ensaio também foi determinada utilizando-se valores replicativos de N1 CT transpostos obtidos tanto do robô quanto do carregamento manual da amostra. A avaliação dos métodos de tratamento térmico para redução da viscosidade na saliva é mostrada aqui. A saliva negativa SARS CoV-2 foi coletada de uma única fonte e as alíquotas foram tratadas a calor por zero minutos, 30 minutos ou 60 minutos a 95 graus Celsius.

Os valores p1 ct de réplicas técnicas de cada condição foram traçados para determinar a variabilidade entre os métodos de tratamento. Ambos os métodos de tratamento térmico de 30 minutos e 60 minutos produziram uma redução significativa da variabilidade amostral em comparação com o não controle do tratamento. Não houve diferença significativa entre tratamentos de 30 minutos e 60 minutos.

Por isso, foi implementado o método de tratamento térmico de 30 minutos para reduzir o tempo de processamento. Use técnica asséptica adequada para minimizar a contaminação das placas de teste, especialmente ao carregar amostras e controles manuais. Evite atravessar o prato com as mãos ou mangas.

Após a produção dos resultados clínicos, as amostras podem ser descartadas em resíduos de risco biológico ou podem ser salvas para análises posteriores, como sequenciamento de genomas inteiros para determinar cepas específicas. Esta técnica permite testes comunitários em larga escala, o que nos permite investigar os efeitos da cobertura de testes e a propagação não sintomática de Covid 19.