Name: Eficiente SARS-CoV-2 Quantitative Reverse Transcriptase PCR Saliva Diagnostic Strategy utilizando robôs de pipetação de código aberto (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 11 s
Description: Aprenda a realizar diagnóstico de COVID-19 por RT-qPCR em saliva usando robôs de pipetação de código aberto. Este método automatizado permite milhares de testes diários sem extração de RNA.

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Os autores agradecem à administração, equipe médica e funcionários do laboratório clínico da Clemson no Reddi Lab, que ajudaram a implementar e gerenciar os testes sars-cov-2. Agradecemos ao Dr. Phillip Buckhaults e à Dra. Agradecemos a muitos alunos, professores e funcionários pela assistência na coleta de amostras. Obrigado aos alunos do Creative Inquiry pela coleta de dados de curva padrão. O financiamento deste estudo foi recebido do subsídio dos Institutos Nacionais de Saúde P20GM121342 (concedido à DD e à LGP), ao Departamento Atlético de Clemson, ao Vice-Presidente de Pesquisa da Universidade Clemson e ao Comitê de Revisão de Títulos Conjuntos da Carolina do Sul.

Todas as pesquisas foram realizadas em conformidade com os Conselhos de Revisão Institucional da Universidade Clemson e prisma (Prisma Health IRB # Pro00099491, 1º de julho de 2020).
1. Configuração de robô de manuseio líquido de código aberto
<ol><li>Instale módulos de filtro de ar particulado de alta eficiência (HEPA) (ver Tabela de Materiais) na parte superior de cada robô de manuseio líquido de acordo com as instruções do fabricante.</li>
	<li>Conecte uma pipeta P20 de 8 canais ao suporte esquerdo do robô de preparação da placa de mixagem mestre, de acordo com as instruções do fabricante.</li>
	<li>Conecte uma pipeta P20 ao suporte direito do robô de carregamento de amostras conforme as instruções do fabricante.</li>
	<li>Baixe os scripts python personalizados (Arquivo Suplementar 1 e Arquivo Suplementar 2) nos computadores apropriados.</li>
	<li>Abra o TigerSaliva Full 384 Loading.py no aplicativo de desktop no computador robô de carregamento de amostras. Clique em Calibrar e configure tanto a pipeta quanto o programa de acordo com as instruções do software.</li>
	<li>Abra 12 Plates.py completos no aplicativo de desktop no computador robô master mix. Clique em Calibrar e configure tanto a pipeta quanto o programa de acordo com as instruções do software.</li>
	<li>Imprima racks de amostra personalizados com uma impressora tridimensional de modelagem de deposição fundida (3D) usando um arquivo CAD (Computer-aided Design, design aided design, design aided) (https://www.myminifactory.com/object/3d-print-141363). Imprima 16 racks por robô de carregamento de amostras, para dois conjuntos de oito racks.</li>
</ol>2. Preparação de 20x multiplex N1+P1 sonda/primer mix
<ol><li>Prepare um lote de 20x multiplex N1+P1 probe/primer mix (volume total de 20 mL, Tabela 1) em um tubo cônico de 50 mL em um ambiente estéril longe de amostras sintéticas sars-cov-2 ou pacientes.</li>
	<li>Alíquota de 1,6 mL da mistura usando uma pipeta sorológica em tubos de centrífugas estéreis de 2,0 mL e etiquetar adequadamente.</li>
	<li>Armazene alíquotas em um congelador de -20 °C até estar pronto para usar.</li>
</ol>3. Preparação de mistura de controle positiva
NOTA: A mistura de controle positiva não deve ser feita no mesmo ambiente estéril que a mistura de sonda/primer ou outros componentes de mixagem mestre. Deve-se utilizar um recipiente separado de água sem nuclease.
<ol><li>Diluir SARS-CoV-2 RNA sintético (N1) de 1.000.000 cópias genéticas/μL (cpμ) a 10.000 cpμ adicionando 10 μL de solução de estoque a 990 μL de água sem nuclease. Alíquota de 25 μL de 10.000 cpμ em tubos estéreis de 0,2 mL e etiqueta apropriadamente. Armazene alíquotas nãousadas a -80°C. NOTA: O RNA sintético deve ser armazenado a -80°C para evitar a degradação.</li>
	<li>Diluir Hs_RPP30 DNA sintético (P1) de 200.000 cpμ a 10.000 cpμ adicionando 50 μL de solução de estoque a 950 μL de água sem nuclease. Alíquota de 25 μL de 10.000 cpμ em tubos estéreis de 0,2 mL e etiqueta apropriadamente. Armazene alíquotas nãousadas a -80°C.</li>
	<li>Diluir cada componente a uma concentração final de 200 cpμ adicionando 20 μL de SARS-CoV-2 e Hs_RPP30 estoques de 10.000 cpμ para 960 μL de água sem nuclease, para um total de 1000 μL. Aliquot 20 μL de controle positivo misto de 200 cpμ em tubos de 0,2 mL e etiqueta apropriadamente. Armazene alíquotas a -80°C até ficar pronto para uso.</li>
</ol>4. Preparação de placas de mixagem mestre
NOTA: Faça mistura mestre em um ambiente estéril longe de amostras sintéticas de RNA SARS-CoV-2 ou pacientes. Todos os componentes devem ser completamente descongelados antes de adicionar à mistura; sem o degelo adequado, as concentrações podem estar incorretas. O descongelamento inadequado é indicado pela presença de gelo ou cor irregular de reagentes. Guarde em um bloco congelador enquanto prepara a mistura.
<ol><li>Prepare um lote de mix mestre multiplex (volume total de 48 mL, Tabela 2) em um tubo cônico de 50 mL.</li>
	<li>Homogeneize a mistura girando o tubo em 3x. Não misture por tubulação para cima e para baixo ou vórtice, pois isso danificará a enzima.</li>
	<li>Encha as colunas 1-4 de um reservatório de poços estéreis de 96 poços profundos, transferindo 1,48 mL de mistura mestre em cada poço. Um cônico de 50 mL preenche quatro colunas, o suficiente para 12 placas.</li>
	<li>Cubra o reservatório do poço profundo com um selo de papel alumínio e coloque-o no dedicado robô de manuseio líquido master mix. Coloque o reservatório de poços profundos cheios no deck 10, coloque seis placas vazias de 384 poços nos decks 1-6, e a caixa de ponta P20 no deck 11. Descubra a placa do poço profundo e caixas de ponta e feche o robô.</li>
	<li>Inicialize o protocolo operacional Python personalizado clicando em Iniciar Run no aplicativo de desktop robô.</li>
	<li>Depois de 40 min, a corrida fará uma pausa. Cubra as 384 placas de poço preenchidas com vedações de papel alumínio enquanto elas permanecem no robô e pressione para baixo com o rolo para garantir a adesão. Rotule a borda de cada placa com um identificador de lote.</li>
	<li>Coloque seis novas placas vazias de 384 poços nos decks 1-6 e retome o protocolo de funcionamento clicando em Retomar Run. Após a execução ser concluída, cubra o conjunto final de 384 placas com selos de papel alumínio.</li>
	<li>Pipeta 2 μL da mistura principal restante em colunas 1-3 e 22-24 de uma placa vazia de 384 poços para controle de qualidade em lote. Vedação com uma vedação opticamente clara e executada no termociclador (seção 10.1-10.2). Se algum poço tiver valores de ciclo de limiar N1 (Ct) ou se mais de 10 poços tiverem valores P1 Ct, o lote está contaminado e não pode ser utilizado.</li>
	<li>Armazene as placas de mixagem mestre preparadas a 4 °C e use-as dentro de 7 dias após a preparação.</li>
</ol>5. Coleta de amostras, ingestão e tratamento térmico
<ol><li>Instrua os participantes a evitar comer, beber, fumar ou conduzir a higiene dental 30 minutos antes da coleta de saliva. Instrua os participantes a coletar pelo menos 1 mL de saliva que naturalmente se agrupa na boca e depositá-la em um tubo cônico estéril de 50 mL sem conservantes, em seguida, tampar o tubo (Arquivo Suplementar 3).</li>
	<li>Descontaminar o exterior dos tubos de coleta de saliva com 70% de etanol ou desinfetar lenços umedecidos e transferi-los para o laboratório para testes.</li>
	<li>Registo a chegada da amostra escaneando cada código de barras da amostra na planilha de admissão diária (Arquivo Suplementar 4).</li>
	<li>Trate as amostras escaneadas por 30 minutos em um forno de 95 °C. Remova amostras usando luvas resistentes ao calor. NOTA: As amostras não tratadas são estáveis à temperatura ambiente (23 °C) por até 72 h. Uma vez tratadas pelo calor, as amostras devem ser armazenadas a 4 °C, se não forem processadas imediatamente.</li>
</ol>6. Atribuição da amostra
<ol><li>Abra as planilhas diárias de carregamento de amostras para cada robô de carregamento de amostras (Arquivo Suplementar 5) no computador na estação de atribuição de amostras.</li>
	<li>Atribuir 188 amostras a cada placa de 384 poços da seguinte forma: Amostras 1-48 são consideradas no quarto trimestre, amostras 49-96 são consideradas quarto 2, amostras 97-144 são consideradas 3º trimestre e amostras 145-188 são consideradas quarto 4. A amostra é analisada em duplicata.</li>
	<li>Rotular bandejas com nome da placa, data e número do trimestre. Escaneie as amostras para entrar na planilha de carregamento da amostra. NOTA: As amostras das placas anteriores podem precisar ser executadas manualmente, conforme definido na Figura 3. Consulte as seções 8.1-8.3 para atribuição manual da amostra e instruções de carregamento.</li>
</ol>7. Robôs de carregamento de amostras operacionais
<ol><li>Na estação de carregamento de amostras, forque dois conjuntos completos de oito racks impressos em 3D correspondentes à colocação do convés no robô.</li>
	<li>Uncap quarter 1 tubos e coloque em racks impressos em 3D, começando com a posição A1 no rack 1. Encha cada rack da esquerda para a direita e de cima para baixo. Continue este padrão de carregamento no rack 2 e, em seguida, prossiga para racks 4 e 5 (consulte a Figura 2C). NOTA: Os racks não são numerados consecutivamente devido aos parâmetros do programa robô.</li>
	<li>Coloque racks de amostra carregados no 1, 2, 4, 5, 7, 8, 10, 11. Coloque dicas P20 nos decks 3 e 9. Para simplificar o processo de configuração, carregue materiais de trás para frente no robô.</li>
	<li>Pegue uma placa de mistura mestre pré-feita a partir dos 4 °C, rotule-a com o nome da placa e use uma lâmina afiada para cortar uma linha na folha ao redor dos poços de controle (N23/24, O23/24 e P23/24).</li>
	<li>Coloque a placa de mistura mestre no deck 6 e retire a tampa da folha, deixando para trás o pequeno retângulo cobrindo os poços de controle. Descubra as caixas de ponta e feche o robô.</li>
	<li>Inicialize o protocolo operacional Python personalizado clicando em Iniciar Run através do aplicativo de desktop robô. Cada trimestre leva 24,5 min para carregar na placa; definir um temporizador como um lembrete.</li>
	<li>Enquanto o robô está em execução, tubos de amostra de uncap e load quarter 2 no segundo conjunto de racks impressos em 3D, conforme descrito na seção 7.2.</li>
	<li>Quando o robô pausar, remova os racks do quarto 1 e substitua-os por racks de trimestre 2. Clique em Retomar o executa no aplicativo de desktop.</li>
	<li>Recapitulando tubos de amostra do trimestre 1 e armazene-os em uma geladeira de 4 °C enquanto aguarda resultados. Repita este processo de carregamento para os trimestres 3 e 4.</li>
	<li>Transfira a placa carregada para um armário de biossegurança. Para minimizar a contaminação, mantenha a placa coberta durante a transferência.</li>
</ol>8. Carregamento manual de amostras
NOTA: Realize uma única execução manual em amostras repetidas (N1 Rerun ou Rerun, consulte Figura 3) em caso de carregamento robótico inadequado.
<ol><li>Reúna quaisquer amostras repetidas e atribua-as como as últimas amostras no quarto trimestre (ver seção 6.2). Amostras numé somadas, digitalizam os códigos de barras e digitam o local original da amostra e resultam na planilha de carregamento da amostra.</li>
	<li>Transfira amostras repetidas para o armário de biossegurança. Não carregue tubos de amostra repetidos nos racks de carregamento do robô.</li>
	<li>Pipeta 2 μL de cada amostra repetida para os poços corretos após o diagrama de layout da placa (Arquivo Suplementar 6). Use uma pipeta designada para adicionar amostras de pacientes. Mantenha os poços de controle cobertos com papel alumínio, adicionando amostras para minimizar a contaminação.</li>
</ol>9. Adição de controles às placas de teste
<ol><li>Retire a tampa da folha sobre os poços de controle usando fórceps.</li>
	<li>Pipeta 2 μL de água sem nuclease (sem controle de modelo) para poços N23-N24 e 2 μL de controle positivo misto de 200 cpμ (consulte a seção 3) aos poços O23-O24. Pipeta 2 μL de um controle amostral positivo confirmado em poços M23-M24 como um controle adicional. Deixe os poços P23-P24 vazios para monitorar a qualidade do lote master mix.</li>
	<li>Cubra a placa com uma vedação opticamente clara e use o rolo aplicador para aderir ao selo a todos os poços. Vórtice a placa a 2500 rpm por 30 segundos para misturar bem. Centrifugar a placa a 500 x g por 1 min.</li>
</ol>10. Executando RT-qPCR
<ol><li>Crie um programa de protocolo no software termocicr de acordo com as condições descritas (Tabela 3). Guarde o protocolo para placas futuras. Coloque a placa selada no termociclador e execute o protocolo.</li>
	<li>Exportar valores ct como um arquivo .xslx e copiar os valores na planilha de carregamento de amostra (Arquivo Suplementar 5). NOTA: Estas folhas foram projetadas sob medida para arquivos de saída ct do software do fabricante e podem precisar de modificações para aceitar outros formatos.</li>
</ol>11. Determinando a validade da placa
<ol><li>Validar tanto o controle positivo quanto/ou amostras positivas conhecidas e o controle negativo para considerar os resultados da placa como válidos. Avalie os poços de controle com os seguintes critérios.<ol>
<li>Para um controle positivo, verifique se pelo menos um poço de controle positivo (O23/O24) produz valores ct entre 22-28 para as sondas P1 e N1. Alternativamente, os conhecidos poços de amostra positiva (M23/M24) produzem valores P1 e N1 Ct <33 nas sondas P1 e N1.</li>
		<li>Para controle negativo, verifique se não há valores de N1 ou P1 Ct em nenhum dos dois poços de controle negativo (N23/N24). Confirme se os valores da TC têm curvas de amplificação válidas antes de invalidar a placa.</li>
	</ol>
</li>
</ol>12. Interpretação dos resultados amostrais
<ol><li>Determine o resultado do paciente após o diagrama (Figura 3) e informe amostras resolvidas.<ol>
<li>Avalie o resultado P1 como VÁLIDO ou INVÁLIDO. Se a P1 produzir um resultado de Ct <33, considere o bem VÁLIDO e prossiga para o resultado de N1. Se p1 produzir um resultado de Ct >=33 ou nenhum valor de TC, considere o bem INVÁLIDO.<ol>
<li>Avalie o Resultado N1 como SIM, NÃO ou NÃO*. Se n1 produz um resultado de Ct <33, o poço é SIM. Se n1 não produzir um valor ct, o poço é NÃO. Se o N1 produzir um Ct >=33, o poço é NO*. Confirme se todos os valores do N1 Ct estão associados a uma curva de amplificação real. Se um valor ct para N1 não tem curva de amplificação, o poço é NÃO.</li>
			<li>Identifique amostras repetidas (N1 Rerun ou Rerun), rotule-as com um número de amostra interna e tipo de amostra e devolva-as ao fluxo de trabalho de carregamento (seção 8.1-8.3).</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>13. Limpeza laboratorial
<ol><li>Robôs de manuseio líquido<ol>
<li>Limpe todos os lados com desinfetante de nível intermediário. Não use etanol, pois vai degradar o plástico.</li>
		<li>Limpe suavemente a ponta da pipeta e a lixeira com um álcool (70% de etanol ou 100% isopropanol) limpe. Limpe o teclado e o mouse.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Armário de biossegurança<ol>
<li>Limpe todas as superfícies com desinfetante de nível intermediário. Ligue a luz UV por 15 minutos.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

Os autores não têm nada a revelar. O ensaio descrito no protocolo está no SalivaDirect EUA arquivado pela Yale School of Public Health.

O ensaio descrito no protocolo foi avaliado por um estudo de validação independente. Verificou-se que o ensaio tinha especificidade de 98,9% (1,1% falso positivo) e sensibilidade de 90,0% (10,0% falso negativo) quando avaliados contra cotonetes nasofaríngeos emparelhados tomados ao mesmo tempo (n =837; 817 negativos, 20 positivos). É importante ressaltar que três participantes que testaram positivo com TigerSaliva e negativo com cotonete nasofaríngeo foram retestados com cotonetes 48 h depois e retornaram resultados positivos, indicando que o TigerSaliva pode ser capaz de detectar infecções pelo SARS-CoV-2 mais cedo no curso da doença.
Simulamos amostras positivas de saliva por meio da saliva livre de vírus (tratada com calor e não tratada pelo calor) com concentrações conhecidas de RNA sintético SARS-CoV-2 e realizamos uma diluição de 10 vezes para determinar o limite de tomografia computadorizada na saliva. O gene N1 não foi detectável abaixo de 10.000 cópias genéticas (aproximadamente Ct = 28) em amostras simuladas positivas. Suspeitamos que isso seja devido à degradação da RNase ou outros fatores de confusão. No entanto, a interação de RNases saliva com RNA sintético nu é provavelmente diferente da interação com partículas virais, mesmo depois de terem sido desnaturadas pelo calor. Amostras positivas de saliva foram identificadas com o Ct >30 e laboratórios externos obtiveram dados de sequência genética SARS-CoV-2 dessas amostras. Especulamos que as proteínas virais fornecem proteção contra a degradação do RNA em amostras de saliva de pacientes.
O passo mais crítico no protocolo é a implementação da automação para preparação de mix master e processamento de amostras de saliva (seções 4 e 7, respectivamente). Isso permite a sobreposição de processos de tarefas, o que reduz drasticamente o tempo de retorno. Outro passo crítico é a interpretação do resultado clínico (seções 11 e 12). A criação de categorias intermediárias de resultados (Reprise e Reprise N1) também minimizou a ocorrência de resultados inconclusivos.
Demonstramos que a variação entre métodos manuais e automatizados de carregamento de amostras de saliva é insignificante (Figura 5A) e que a automação pode melhorar a reprodutibilidade da detecção sars-cov-2 (Figura 5B). A automação deve ser favorecida para facilitar os testes ao projetar e expandir laboratórios clínicos25. O fluxo de trabalho de laboratório é melhorado com a implementação de tarefas automatizadas por robôs26. Os recursos de código aberto dos robôs de manuseio líquido permitem a implementação de scripting personalizado para design de protocolo. Isso faz dos robôs de manuseio líquido um sistema barato e altamente modificável em comparação com os métodos tradicionais de automação clínica. É também uma estratégia ideal para executar tarefas laboratoriais altamente repetitivas. O alto nível de personalização do sistema traduz-se na liberdade de alterar labware (por exemplo, tubos de coleta, pontas de pipeta ou placas de 384 poços) em caso de escassez. Portanto, a automação usando robôs de manuseio líquido é viável tanto para vigilância e pesquisa em larga escala quanto em pequena escala.
Uma grande vantagem dessa estratégia de teste é um tempo de reviravolta muito menor em relação a outros laboratórios clínicos. A utilização de robôs automatizados de manuseio de líquidos desempenha um papel fundamental na redução do tempo de retorno, mas o uso simultâneo de robôs e termociclos também é fundamental para maximizar a eficiência dos testes. Um robô e um termociclador devem ser operados como um par, onde ambas as máquinas são usadas em conjunto para carregamento ininterrupto de amostras e análise de resultados de amostras. Uma vez estabelecido um fluxo constante de amostras atribuídas, todos os pares de máquinas podem ser operados simultaneamente. O uso constante e simultâneo de robôs e termociclistas aumenta drasticamente a capacidade e a eficiência dos testes, o que é crucial para acomodar o alto volume de testes.
Em contraste com outros protocolos SARS-CoV-2 RT-qPCR estabelecidos, incluímos um passo de touchdown no protocolo termociclador para melhorar o ressarcimento dos conjuntos de sonda e primer para os genes-alvo27, reduzindo o risco de amplificação falha. Os resultados demonstraram que o touchdown melhorou a detecção de amostras positivas sem correr o risco de perda de ligação específica de primer (Tabela 4). Determinamos que uma ampla gama de cópias de RNA SARS-CoV-2 (Figura 4A) e Hs_RPP30 cópias de DNA (Figura 4B) podem ser detectadas simultaneamente pelo ensaio RT-qPCR.
Uma limitação dos robôs de manuseio líquido é a possibilidade de contaminação cruzada de amostras positivas durante a transferência de saliva. A saliva é um fluido viscoelástico28 e pode amarrar poços adjacentes após ser dispensado da ponta da pipeta. Além disso, a heterogeneidade da saliva29 pode causar distribuição desigual de partículas virais ao longo da amostra. Isso aumenta a possibilidade de falsos positivos e negativos, exigindo a designação de amostras de N1 Rerun e Rerun. No entanto, 14,1% das amostras inicialmente designadas como N1 Rerun foram resolvidas como positivas para SARS-CoV-2 e eram mais de 30 vezes mais propensas do que as amostras de rerun para resolver como positivas após o novo teste. Consequentemente, diferenciar a reprise de N1 (Figura 3) permitiu uma separação mais precisa de amostras potencialmente positivas, aumentando a sensibilidade e a especificidade do nosso ensaio diagnóstico. Outros parâmetros resultantes para o teste de saliva diagnóstica não fizeram essa distinção12,14,24,30,31.
Amostras de saliva podem ser difíceis de pipeta devido à heterogeneidade e viscosidade32. O tratamento térmico desnatura adequadamente as proteínas na biomatrix saliva, reduzindo a viscosidade e eliminando a necessidade de reagentes de extração de RNA9, que eram escassos durante os estágios iniciais da pandemia10. O tratamento térmico prolongado também inativa os vírus33 que permitem o processamento laboratorial em níveis mais baixos de biossegurança. Consequentemente, foi implementada uma extração de RNA baseada no calor (descrita na seção 5.4) para diminuir a viscosidade por meio da desinaturação da proteína (Figura 6). Com base nos resultados, postulamos que o tratamento térmico também pode homogeneizar amostras de saliva, além de desnaturar a biomatrix proteica. Outros grupos combinaram tratamento térmico e proteinase K para aumentar a homogeneidade9,14,34. Optamos por não implementar esta etapa, pois pode desnaturar proteínas virion a uma taxa que deixa o RNA viral exposto à degradação do calor35. Além disso, a diluição amostral com proteinase K pode mascarar amostras positivas contendo menos partículas virais, diminuindo assim a sensibilidade. Além disso, os resultados do ensaio foram comparados a um ensaio SARS-CoV-2 baseado em saliva comercialmente disponível (Logix Smart COVID-19) que usa extração de RNA de contas magnéticas (Tabela 5). Verificou-se que o ensaio atual foi mais adequado para detectar amostras positivas fracas em comparação com o ensaio comercialmente disponível.
É difícil quantificar o número de cópia do vírus na saliva usando apenas RT-qPCR, porque o qPCR é semi-quantitativo. Há variação inerente entre os valores da TC que se origina de limitações técnicas. O número da cópia genética pode ser determinado a partir de valores ct (Figura 4) e é aproximadamente equivalente ao número de cópia viral. Uma solução possível para determinar o número de cópia viral em amostras de saliva é o ddPCR, que fornece quantificação dura de cópias genéticas na reação. No entanto, acreditamos que é adequado fornecer resultados qualitativos aos médicos e o conteúdo relativo viral pode ser comparado entre amostras processadas com nossos métodos.
Apesar de algumas limitações que surgem ao usar saliva, o ensaio SARS-CoV-2 por RT-qPCR baseado em saliva prova ser um método eficaz para detecção rápida e confiável de RNA viral em qualquer escala de testes. Isso é especialmente verdade quando juntamente com a utilização de sistemas de manuseio líquido de código aberto. Essa abordagem de teste pode ser modificada para detectar outras sequências de ácido nucleico relevantes para diagnósticos, como agentes de doenças infecciosas, marcadores de doenças ou outros vírus. Isso torna o ensaio aplicável tanto para os esforços clínicos quanto de diagnóstico de pesquisa.

Coronavírus-2 associado à síndrome respiratória aguda grave (SARS-CoV-2), um novo coronavírus, surgiu no final de 2019 e rapidamente se espalhou por toda a população global1. A infecção pelo SARS-CoV-2 causa a doença coronavírus 2019 (COVID-19), doença altamente contagiosa com sintomas respiratórios e inflamatórios potencialmente graves. A alta transmissibilidade aliada à baixa mortalidade indicou que o vírus se espalharia rapidamente pelas populações e exigiria um aumento dos testes diagnósticos2,3. As recomendações de saúde pública incentivaram a triagem populacional em larga escala para isolar os casos e, posteriormente, reduzir as taxas de transmissão4,5,6. Além disso, modelos de vigilância populacional revelaram que o aumento da frequência de testes e a diminuição do tempo de notificação tiveram um efeito maior na redução da transmissão do que no aumento da sensibilidade ao teste7. Isso é provável porque indivíduos infectados poderiam ser colocados em quarentena mais cedo, quebrando assim cadeias de infecção.
O padrão original de teste de amplificação de ácido nucleico (NAAT) era cotonetes nasofaríngeos (NP) processados por RT-qPCR8. No entanto, complicações surgem com essa forma de testes para populações muito grandes, como aumento do custo relativo e pressão exacerbada da cadeia de suprimentos9,10. Além disso, tanto a coleta de espécimes quanto o processamento de métodos comuns de NAAT (incluindo cotonetes NP, cotonetes orofaríngeos, cotonetes de turbinas médias e cotonetes nasais) dependem de equipamentos especializados, reagentes e pessoal médico9,10.
Um substituto adequado para testes de NP swab RT-qPCR é o teste baseado em saliva, que é uma ferramenta de diagnóstico precisa para detecção SARS-CoV-211,12,13,14. A realização direta de RT-qPCR em amostras de saliva produz sensibilidade e especificidade semelhantes aos cotonetes NP15. Uma grande vantagem que o teste de saliva tem sobre o teste de swab NP é que ele permite a auto-coleta de amostras16. Isso minimiza a necessidade de pessoal médico e maximiza a facilidade de coleta de amostras para os pacientes por serem menos invasivos que os cotonetes de PN. Além disso, uma vez que as amostras de saliva não requerem buffers para remover a amostra de um cotonete (como no caso de amostras de NP), os testes à base de saliva podem utilizar diretamente a extração de ácido ribonucleico baseado no calor (RNA), o que diminui os custos de teste removendo a necessidade de buffers adicionais, mídia de transporte e/ou reagentes de extração de RNA14,17.
O Laboratório de Pesquisa e Educação em Diagnóstico e Intervenção de Doenças da Universidade Clemson (REDDI) foi criado para atender às necessidades da universidade para testes e vigilância covid-19. Em populações fechadas, incluindo universidades, testes frequentes de vigilância aliados ao distanciamento social produziram os desfechos mais favoráveis nos modelos epidemiológicos da prevalência da doença18. Os protocolos CONSOLIDADOS CDC 2019-nCOV RT-qPCR19 e SalivaDirect14 foram adaptados, e a automação foi utilizada no fluxo de trabalho clínico para diminuir o custo e melhorar o tempo de retorno. Grupos anteriores haviam usado robôs de manuseio líquido de código aberto para etapas de extração de RNA SARS-CoV-2 2, mas maximizamos o uso dos robôs para preparar placas de teste e carregar espécimes22. Aqui, mostramos que o protocolo adaptado e a utilização de sistemas de manuseio líquido de código aberto (Figura 1) permitem a RT-qPCR rápida e precisa baseada em saliva e é uma estratégia eficaz para a vigilância em saúde pública em larga escala.

<table><tbody><tr><td>100% EtOH Fisher</td><td>scientific</td><td>22-032-601</td><td></td></tr><tr><td>20 uL Pontas de Pipeta Filtradas</td><td>Opentrons</td><td>20uL pontas</td><td></td>2mL</tr><tr><td>Tubos de Microcentrífuga</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-666-313</td><td>Produto alternativo pode ser usado</td></tr><tr><td>Placa PCR de Tatu, 384 poços, claro, poços brancos</td><td>Thermo Scientific</td><td>AB3384</td><td>Produto alternativo pode ser usado</td></tr><tr><td>Celltreat 2mL 96 placas de poço profundo</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-828-743</td><td>Para preparação de mastermix</td></tr><tr><td>Folhas de vedação de PCR transparente</td><td>Thermo Scientific</td><td>AB0558</td><td>Produto alternativo pode ser usado</td></tr><tr><td>Água tratada DPEC</td><td>Ambion (Thermo Scientific)</td> <td>AM9916</td><td></td></tr><tr><td>Flip Cap 50 mL Tubos cônicos</td><td>VWR</td><td>75845-210</td><td>para coleta de amostras</td></tr><tr><td>Folhas</td> <td>de vedação de PCR de folhaThermo Scientific</td><td>AB0626</td><td>Para armazenamento de placas mastermix, o produto alternativo pode ser usado</td></tr><tr><td>HS_RPP30 DNA sintético</td><td>Tecnologias de DNA integradas</td><td>299788131</td><td>controle positivo P1</td></tr><tr><td>Sonda tampão Luna Reação em uma etapa</td><td>New England Biolabs</td><td>M3006B</td><td></td></tr><tr><td>Luna WarmStart RT Enzyme Mix</td><td>New England Biolabs</td><td>M3002B</td><td></td></tr><tr><td>nCOV_N1 Forward Primer, 100 nmol</td><td>Tecnologias integradas de DNA</td><td>10006830</td><td></td></tr><tr><td>nCOV_N1 Probe Aliquot, 50 nmol</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>10006832</td><td>Probe pode ser sintetizado por outros fornecedores com fluóforos SYBR ou FAM</td></tr><tr><td>nCOV_N1 Reverse Primer, 100 nmol</td><td>Integrated DNA</td> Technologies <td>10006831</td><td></td></tr><tr><td>Opentron Módulo de filtro HEPA</td><td>Opentrons</td><td>N/A</td><td>Não é necessário, mas é útil para reduzir contaminação</td></tr><tr><td>Acessório multicanal Opentron, P20</td><td>Opentrons</td><td>999-00005</td><td>Para preparação de mastermix</td></tr><tr><td>Robô de manuseio de líquidos Opentron OT-2</td><td>Opentrons</td><td>Acessório de pipeta OT-2</td><td></td></tr><tr><td>Opentron, P20</td><td>Opentrons</td><td>999-0000215</td><td>Para carregamento de amostras</td></tr><tr><td>Forno</td><td>Memmert</td><td>UF450 PLUS 208V-3PH</td><td></td></tr><tr><td>Tubos PCR (rnase, dnase free)</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-230-225</td><td>Para alíquotas de controles positivos e negativos</td></tr><tr><td>Bloco de resfriamento de alumínio PolarSafe, 15 poços (tubos de 1,5/2,0 mL)</td><td>VWR</td><td>10808-952</td><td></td></tr><tr><td>Bloco de resfriamento de alumínio PolarSaf, 24 poços (tubos de 0,5mL)</td><td>VWR</td><td>10808-956</td><td></td></tr><tr><td>Sonda RNAse P (ATTO 647), 50 nmol</td><td>Tecnologias de DNA integradas</td><td>10007062</td><td>Sonda pode ser sintetizada por outros fornecedores com Cy5 fluoróforo</td></tr><tr><td>RNAse P Forward Primer, 100nmol</td><td>Integrated DNA</td> Technologies <td>10006836</td><td></td></tr><tr><td>RNAse P Reverse Primer, 100 nmol</td><td>Integrated DNA</td> Technologies <td>10006837</td><td></td></tr><tr><td>Sars-CoV-2 Controle de RNA sintético 2</td><td>Twist Biosciences</td><td>102024 / 103907 / 103909</td><td>N1 Scanners de controle positivo</td></tr><tr><td></td><td>Código</td><td>CR1500</td><td>Necessário apenas ao aumentar a escala</td></tr><tr><td>Pequeno Capuz Filtrado HEPA</td><td>Erlab</td><td>Captair Bio 321</td><td>Para preparação de mastermix</td></tr><tr><td>Termociclador CFX384 Touch</td><td>Biorad</td><td>CFX384 Touch</td><td>Modelos alternativos podem ser usados, por exemplo, CFX384 Opus</td></tr><tr><td>X-acto Conjunto de Facas</td><td>Grampos</td><td>N/A</td><td>Para cortar a folha para manter os poços de controle cobertos</td></tr></tbody></table>

eficiente sars-cov-2 quantitative reverse transcriptase pcr saliva diagnostic strategy utilizando robôs de pipetação de código aberto

Efficient SARS-CoV-2 Quantitative Reverse Transcriptase PCR Saliva Diagnostic Strategy utilizing Open-Source Pipetting Robots

O surgimento da recente crise global de saúde SARS-CoV-2 introduziu desafios fundamentais para a pesquisa epidemiológica e testes clínicos. Caracterizada por uma alta taxa de transmissão e baixa mortalidade, a pandemia COVID-19 necessitava de testes diagnósticos precisos e eficientes, particularmente em populações fechadas, como universidades residenciais. A disponibilidade inicial de testes de ácido nucleico, como cotonetes nasofaríngeos, foi limitada devido à pressão da cadeia de suprimentos, o que também atrasou o relato dos resultados dos testes. O teste de reação em cadeia de polimerase quantitativa baseado em saliva (RT-qPCR) mostrou-se comparável em sensibilidade e especificidade a outros métodos de teste, e a coleta de saliva é menos fisicamente invasiva aos participantes. Consequentemente, desenvolvemos um ensaio diagnóstico multiplex RT-qPCR para vigilância populacional da Universidade Clemson e da comunidade circundante. O ensaio utilizou robôs de manuseio líquido de código aberto e termociclistas em vez de sistemas complexos de automação clínica para otimizar o fluxo de trabalho e a flexibilidade do sistema. A automação do RT-qPCR baseado em saliva permite a detecção rápida e precisa de uma ampla gama de concentrações de RNA virais para demandas de testes em grande e pequena escala. A média de retorno para o sistema automatizado foi de < 9h para 95% das amostras e < 24h para 99% das amostras. O custo para um único teste foi de US$ 2,80 quando todos os reagentes foram comprados em quantidades a granel.

O protocolo descreve um método de diagnóstico SARS-CoV-2 que utiliza a automação de código aberto para realizar testes moleculares RT-qPCR de amostras de saliva. Essa abordagem escalável pode ser aplicada à vigilância clínica em saúde pública, bem como ao aumento da capacidade de laboratórios universitários menores.

Eficiente SARS-CoV-2 Quantitative Reverse Transcriptase PCR Saliva Diagnostic Strategy utilizando robôs de pipetação de código aberto

The emergence of the recent SARS-CoV-2 global health crisis introduced key challenges for epidemiological research and clinical testing. Characterized by ...

Desenvolvemos um teste de diagnóstico e fluxo de trabalho COVID 19 de baixo custo, baseado em saliva, que é fácil de implementar e escalar para aplicações de triagem comunitária em larga escala. Aqui usamos robôs de manuseio líquido de código aberto, termocicladores padrão e software para realizar testes diretos de saliva sem extração ou buffers de estabilização, enquanto ainda fornecemos resultados diagnósticos precisos. Devido aos simples fluxos de trabalho paralelos automatizados, o sistema pode ser dimensionado para realizar milhares de testes diariamente com requisitos mínimos de equipamentos, espaço e pessoal.Além de Kylie King, Rachel Ham, nossa supervisora de laboratório clínico e Austin Smothers, nossa coordenadora de educação, ajudarão a demonstrar o procedimento Comece descontaminando o exterior dos tubos de coleta de saliva com 70% de etanol e transferindo-os para o laboratório para testes. Registo a chegada da amostra escaneando cada código de barras da amostra na planilha de admissão diária. Aqueça as amostras de varredura por 30 minutos em um forno Celsius de 95 graus e, em seguida, remova as amostras usando luvas resistentes ao calor.Abra as planilhas diárias de carregamento de amostras para cada robô de carregamento de amostras na estação de atribuição de amostras. Em seguida, atribua 188 amostras para cada placa de 384 poços. Rotular bandejas com nome da placa, data e número do trimestre.Escaneie as amostras para entrar na planilha de carregamento da amostra. Na estação de carregamento de amostras, forque dois conjuntos completos de oito racks impressos em 3D, correspondentes à colocação do convés no robô. Uncap quarter one tubos e colocá-los em racks impressos em 3D, começando com a posição A1 no rack um.Encha cada rack da esquerda para a direita e de cima para baixo. Continue este padrão de carregamento no rack dois, em seguida, proceder para racks quatro e cinco. Coloque racks de amostra carregados em um, dois, quatro, cinco, sete, oito, 10, 11.Coloque dicas P20 nos decks três e nove. Para simplificar o processo de configuração, carregue materiais de trás para frente no robô. As placas de mix mestre são produzidas em um robô dedicado e armazenadas a quatro graus Celsius.Uma placa é usada de cada vez e é rotulada com nome da placa, e uma lâmina afiada é usada para cortar uma linha na folha ao redor dos poços de controle. Coloque a placa de mistura mestre no convés seis e retire a tampa da folha, deixando para trás o pequeno retângulo cobrindo os poços de controle. Descubra as caixas de ponta e feche o robô.Inicialize o protocolo operacional Python personalizado clicando em iniciar a execução através do aplicativo de desktop robô. Cada trimestre leva 24,5 minutos para carregar na placa. Defina um temporizador como um lembrete.Enquanto o robô está em execução, uncap e carregar dois tubos de amostra no segundo conjunto de racks impressos em 3D. Quando o robô pausar, remova os racks do trimestre um e substitua-os pelos racks do trimestre dois e clique em retomar a execução no aplicativo de desktop. Recapitule os tubos de amostra de um quarto e armazene-os em uma geladeira de quatro graus Celsius enquanto aguarda resultados.Repita este processo de carregamento para os quartos três e quatro. Transfira a placa carregada para um armário de bio segurança. Para minimizar a contaminação, mantenha a placa coberta durante a transferência.Reúna as amostras repetidas e atribua-as como as últimas amostras no quarto trimestre. Numerar as amostras, digitalizar os códigos de barras e inserir o local original da amostra e o resultado na planilha de carregamento da amostra. Transfira as amostras repetidas para o armário de bio segurança.Não carregue os tubos de amostra repetido nos racks de carregamento do robô. Pipeta dois microliters de cada amostra repetida para os poços corretos. Use a pipeta designada para adicionar amostras de pacientes.Mantenha os poços de controle cobertos com papel alumínio, adicionando amostras para minimizar a contaminação. Retire a tampa da folha sobre os poços de controle usando fórceps. Pipeta dois microliters de amostras positivas confirmadas de pacientes nos poços M23 e M24.Pipeta dois microliters de água livre de nuclease para poços N23 a N24 e dois microliters de 200 cópias por microliter misturaram controle positivo para Wells O23 a O24. Deixe os poços P23 a P24 vazios para monitorar a qualidade do lote master mix. Cubra a placa com uma vedação opticamente clara e use o rolo aplicador para aderir ao selo a todos os poços.Vórtice a placa a 2.500 RPM por 30 segundos para misturar bem, em seguida, centrifugar a placa a 500 vezes G por um minuto. Selecione o programa de protocolo no software termociclador e salve o protocolo para placas futuras. Coloque a placa selada no termociclador e execute o protocolo.Exporte os valores da TC e copie os valores na planilha de carregamento da amostra. Para um controle positivo, verifique se pelo menos um controle positivo produz valores de TC entre 22 e 28 para as sondas P1 e N1. Alternativamente, os conhecidos poços de amostra positiva produzem valores P1 e N1 CT inferiores a 33 nas sondas P1 e N1.Para controle negativo, verifique se não há valores de CT N1 ou P1 em nenhum dos dois poços de controle negativos. Confirme se os valores ct têm curvas de amplificação válidas antes de invalidar a placa. Se p1 produzir um resultado de CT menor que 33, considere o bem válido e prossiga para o resultado de N1. Se P1 produzir um resultado de CT maior ou igual a 33 ou nenhum valor de TC, considere o bem como inválido.Se n1 produz um resultado de CT menor que 33, avalie o bem como sim. Se n1 não produzir um valor de tomografia, avalie o bem como não. Se n1 produz um valor ct maior ou igual a 33, avalie o bem como nenhuma estrela.Confirme se todos os valores do N1 CT estão associados a uma curva de amplificação real. Se um valor de TC para N1 não tem curva de amplificação, o poço é não. Identifique as amostras repetidas, rotule-as com um número de amostra interna e tipo de amostra e devolva-as ao fluxo de trabalho de carregamento.As imagens representativas mostram a detecção RTQ PCR do RNA sintético N1 ou SARS CoV-2 e do DNA sintético P1 ou HSRPP30. As curvas padrão foram traçadas com desvios padrão para determinar o alcance da detecção precisa usando esta combinação de primer do teste. Os valores médios da TC obtidos nas respectivas diluições foram traçados contra a quantidade estimada de RNA sintético e DNA sintético.Em ambos os casos, as curvas lineares apresentaram bons coeficientes de correlação em uma ampla gama de concentrações de cópias genéticas. Os valores de TC N1 obtidos a partir de amostras únicas usando o robô e o carregamento manual de amostras foram transpostos para determinar a variabilidade do ensaio inter entre o carregamento manual e o robô. A relação linear entre os métodos manual e automatizado produziu um alto coeficiente de correlação indicando que ambos os métodos são funcionalmente equivalentes.A variabilidade intra ensaio também foi determinada utilizando-se valores replicativos de N1 CT transpostos obtidos tanto do robô quanto do carregamento manual da amostra. A avaliação dos métodos de tratamento térmico para redução da viscosidade na saliva é mostrada aqui. A saliva negativa SARS CoV-2 foi coletada de uma única fonte e as alíquotas foram tratadas a calor por zero minutos, 30 minutos ou 60 minutos a 95 graus Celsius.Os valores p1 ct de réplicas técnicas de cada condição foram traçados para determinar a variabilidade entre os métodos de tratamento. Ambos os métodos de tratamento térmico de 30 minutos e 60 minutos produziram uma redução significativa da variabilidade amostral em comparação com o não controle do tratamento. Não houve diferença significativa entre tratamentos de 30 minutos e 60 minutos.Por isso, foi implementado o método de tratamento térmico de 30 minutos para reduzir o tempo de processamento. Use técnica asséptica adequada para minimizar a contaminação das placas de teste, especialmente ao carregar amostras e controles manuais. Evite atravessar o prato com as mãos ou mangas.Após a produção dos resultados clínicos, as amostras podem ser descartadas em resíduos de risco biológico ou podem ser salvas para análises posteriores, como sequenciamento de genomas inteiros para determinar cepas específicas. Esta técnica permite testes comunitários em larga escala, o que nos permite investigar os efeitos da cobertura de testes e a propagação não sintomática de Covid 19.

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Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

TruTip é uma tecnologia de extracção de ácido nucleico simples, onde uma matriz de ligação poroso monolítico é inserida uma ponta de pipeta. Por conseguinte, a preparação da amostra é de formato compatível com os instrumentos de manipulação mais líquidos, e pode ser usado para muitos médio para aplicações clínicas de alto rendimento e tipos de amostras.

Alto rendimento, extração automatizada de DNA e RNA de amostras clínicas utilizando a Tecnologia TruTip em Robots Liquid Handling comuns

Este trabalho resume as etapas no desenvolvimento de ensaios diferentes para a detecção de SARS-CoV-2 usando um sistema ddPCR de duas cores. As etapas são elaboradas e notas foram incluídas sobre como melhorar os ensaios e o desempenho do experimento. Estes ensaios podem ser usados para aplicações SARS-CoV-2 RT-ddPCR.

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Um projeto de ciência cidadã foi projetado para recrutar residentes de San Diego para coletar amostras ambientais para sars-cov-2. Uma plataforma multilíngue baseada na Web foi criada para envio de dados usando uma interface de dispositivo móvel fácil de usar. Um sistema de gerenciamento de informações laboratorial facilitou a coleta de milhares de amostras geograficamente diversas com rastreamento de resultados em tempo real.

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Este protocolo visa quantificar o ARN SARS-CoV-2 em amostras de águas residuais e ar a serem usadas para estudos epidemiológicos baseados em águas residuais e avaliar o risco de exposição ao SARS-CoV-2 em aerossóis interiores e exteriores. Este protocolo igualmente descreve uma aproximação do sequenciamento longo do modelo do amplicon tiled para a caracterização do genoma inteiro SARS-CoV-2.

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Aqui, fornecemos um protocolo completo para padronizar e implementar o método de detecção do vírus SARS-CoV-2 em amostras humanas por amplificação isotérmica mediada por loop de transcrição reversa (RT-LAMP). Este método, feito em 60 min, pode ser adaptado a qualquer laboratório ou ponto de atendimento a baixo custo e usando equipamentos baratos.

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