Name: Fluxo de trabalho experimental e de análise de dados para nanoindentação de matéria mole (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-01-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 4 s
Description: Aprenda nanoindentação de materiais moles para medir rigidez de hidrogéis e células usando nanoindenter comercial e software Python de código aberto. Este método simplificado permite análise reprodutível de propriedades mecânicas.

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GC e MAGO reconhecem todos os membros do CeMi. O MSS reconhece o apoio através de uma subvenção do programa EPSRC (EP/P001114/1).
GC: software (contribuição para o desenvolvimento de software e algoritmos), análise formal (análise de dados de nanoindentação), validação, Investigação (experimentos de nanoindentação em géis de poliacrilamida), curadoria de dados, redação (rascunho original, revisão e edição), visualização (figuras e gráficos). MAGO: investigação (preparação de amostras de géis e células, experimentos de nanoindentação em células), escrita (rascunho original, revisão e edição), visualização (figuras e gráficos). NA: validação, redação (revisão e edição). IL: software (contribuição para o desenvolvimento de software e algoritmos), validação, escrita (revisão e edição); MV: conceituação, software (design e desenvolvimento de software e algoritmos originais), validação, recursos, redação (rascunho original, revisão e edição), supervisão, administração de projetos, aquisição de financiamento MSS: recursos, redação (revisão e edição), supervisão, administração de projetos, aquisição de financiamento. Todos os autores leram e aprovaram o manuscrito final.

Os autores não têm nada a revelar.

Este protocolo mostra como adquirir de forma robusta dados de nanoindentação por espectroscopia de força usando um nanoindenter de topo de ferrule comercialmente disponível em hidrogéis e células individuais. Além disso, instruções para o uso de um software de código aberto programado em Python compreendendo um fluxo de trabalho preciso para a análise de dados de nanoindentação são fornecidas.
Etapas críticas no protocolo As etapas a seguir foram identificadas como de parti...

O papel fundamental da mecânica na biologia está hoje estabelecido 1,2. De tecidos inteiros a células únicas, as propriedades mecânicas podem informar sobre o estado fisiopatológico do biomaterial investigado 3,4. Por exemplo, o tecido mamário afetado pelo câncer é mais rígido do que o tecido saudável, conceito que é a base do popular teste de palpação5. Notavelmente, foi demonstrado recentemente que a doença do coronavírus 2019 (COVID-19) causada pelo coronavírus 2 da síndrome respiratória aguda grave (SARS-CoV-2) é sublinhada por alterações nas propriedades mecânicas das células sanguíneas, incluindo diminuição da deformabilidade dos eritrócitos e diminuição da rigidez dos linfócitos e neutrófilos em comparação com as células sanguíneas de indivíduos ingênuos SARS-CoV-26.
Em geral, a mecânica das células e dos tecidos está inerentemente entrelaçada: cada tecido possui propriedades mecânicas específicas que influenciam e dependem simultaneamente das células constituintes e da matriz extracelular (MEC)5. Devido a isso, as estratégias para estudar a mecânica em biologia geralmente envolvem substratos de engenharia com estímulos mecânicos fisiologicamente relevantes para elucidar o comportamento celular em resposta a esses estímulos. Por exemplo, o trabalho seminal de Engler e colegas demonstrou que o comprometimento da linhagem de células-tronco mesenquimais é controlado pela elasticidade da matriz, conforme estudado em hidrogéis de poliacrilamida bidimensional (PAAm) macios e rígidos7.
Existem muitas estratégias para caracterizar mecanicamente o biomaterial investigado, variando em escala espacial (ou seja, local a granel) e no modo de deformação (por exemplo, axial vs cisalhamento), consequentemente produzindo diferentes informações, o que necessita de interpretação cuidadosa 3,8,9,10. A mecânica dos biomateriais moles é comumente expressa em termos de rigidez. No entanto, a rigidez depende tanto das propriedades do material quanto da geometria, enquanto os módulos elásticos são propriedades fundamentais de um material e são independentes da geometria do material11. Como tal, diferentes módulos elásticos estão relacionados à rigidez de uma determinada amostra, e cada módulo elástico engloba a resistência do material a um modo específico de deformação (por exemplo, axial versus cisalhamento) sob diferentes condições de contorno (por exemplo, expansão livre vs confinamento)11,12. Experimentos de nanoindentação permitem a quantificação de propriedades mecânicas através do E que está associado à deformação uniaxial (recuo) quando o biomaterial não está confinado lateralmente10,11,12.
O método mais popular para quantificar E de sistemas biológicos em microescala é o AFM13,14,15,16. O AFM é uma ferramenta extremamente poderosa com resolução de força até o nível pN e resolução espacial até a escala sub-nm. Além disso, o AFM oferece extrema flexibilidade em termos de acoplamento com ferramentas ópticas e mecânicas complementares, ampliando suas capacidades de extrair uma riqueza de informações do biomaterial investigado13. Essas características atraentes, no entanto, vêm com uma barreira de entrada representada pela complexidade da configuração experimental. O AFM requer treinamento extensivo antes que os usuários possam adquirir dados robustos, e seu uso para caracterização mecânica diária de materiais biológicos é muitas vezes injustificado, especialmente quando sua força única e resoluções espaciais não são necessárias.
Devido a isso, uma nova classe de nanoindenters ganhou popularidade recentemente devido à sua facilidade de uso, enquanto ainda oferece dados comparáveis ao AFM com resolução de força sub-nN e resolução espacial μm, refletindo forças exercidas e percebidas pelas células em escalas de comprimento relevantes2. Particularmente, os dispositivos de nanoindentação de topo de ferrone baseados na tecnologia de detecção de fibra óptica 17,18 ganharam popularidade entre os pesquisadores ativos no campo da mecanobiologia e além; e uma riqueza de trabalhos relatando as propriedades mecânicas de biomateriais usando esses dispositivos, incluindo células19,20, hidrogéis8,21 e tecidos 22,23 foram publicados. Apesar das capacidades desses sistemas de sondar propriedades mecânicas dinâmicas locais (isto é, módulo de armazenamento e perda), experimentos quase estáticos que produzem E continuam sendo a escolha mais popular 8,19,20,21. Em resumo, os experimentos de nanoindentação quase estática consistem em recuar a amostra com uma velocidade constante até um ponto de ajuste definido por um deslocamento, força ou profundidade máxima de recuo e registrar tanto a força quanto a posição vertical do cantilever nas chamadas curvas força-distância (F-z). As curvas F-z são então convertidas em curvas de indentação de força (F-δ) através da identificação do ponto de contato (CP) e equipadas com um modelo de mecânica de contato apropriado (geralmente o modelo de Hertz13) para calcular E.
Embora a operação de nanoindenters de topo de ferrrule se assemelhe a medições de AFM, existem especificidades que valem a pena considerar. Neste trabalho, um guia passo-a-passo para adquirir robustamente curvas F-z de células e hidrogéis que imitam tecidos usando um nanoindenter de topo de ferrule comercialmente disponível é fornecido, a fim de incentivar a padronização de procedimentos experimentais entre grupos de pesquisa usando este e outros dispositivos similares. Além disso, conselhos sobre a melhor forma de preparar amostras e células de hidrogel para realizar experimentos de nanoindentação são dados, juntamente com dicas de solução de problemas ao longo do caminho experimental.
Além disso, grande parte da variabilidade nos resultados de nanoindentação (ou seja, E e sua distribuição) depende do procedimento específico usado para analisar os dados, que não é trivial. Para resolver esse problema, instruções para o uso de um software de código aberto recém-desenvolvido programado em Python e equipado com uma interface gráfica de usuário (GUI) amigável para análise em lote de curvas F-z são fornecidas. O software permite a triagem rápida de dados, a filtragem de dados, a computação do CP através de diferentes procedimentos numéricos, a computação convencional de E, bem como uma análise mais avançada chamada espectros de elasticidade24, permitindo estimar o módulo de Young em massa da célula, o módulo de Young do córtex de actina e a espessura do córtex de actina. O software pode ser baixado gratuitamente do GitHub e pode ser facilmente adaptado para analisar dados originários de outros sistemas, adicionando um analisador de dados apropriado. Ressalta-se que este protocolo pode ser utilizado para outros dispositivos de nanoindentação de topo de ferrule, e outros dispositivos de nanoindentação em geral, desde que algumas etapas sejam adaptadas de acordo com as diretrizes específicas do instrumento. O protocolo está resumido esquematicamente na Figura 1.

<table><tbody><tr><td>Lamínulas de 12 mm</td><td>VWR</td><td>631-1577P</td><td></td></tr><tr><td>Placas de cultura tratadas com células de 35 mm</td><td>Greiner CELLSTAR</td><td>627160</td><td></td></tr><tr><td>Acrilamida</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4058</td><td></td></tr><tr><td>Acrilsilano</td><td>Alfa Aesar</td><td>L16400</td><td></td></tr><tr><td>Persulfato de amônio</td><td>Merk</td><td>7727-54-0</td><td></td></tr><tr><td>Bisacrilamida</td><td>Merk</td><td>110-26-9</td><td></td></tr><tr><td>Nanoindentador Chiaro</td><td>Optics 11 Life</td><td></td><td>&nbsp; sem número de catálogo</td></tr><tr><td>Etanol</td><td></td><td></td><td>geral</td></tr><tr><td>Soro fetal bovino</td><td>Gibco</td><td>16140071</td><td></td></tr><tr><td>Glicose elevada DMEM</td><td>Gibco</td><td>11995065</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td></td><td></td><td>geral</td></tr><tr><td>Kimwipe</td><td>Kimberly Clark</td><td>21905-026</td><td></td></tr><tr><td>Lâminas de vidro para microscópio</td><td>VWR</td><td>631-1550P</td><td></td></tr><tr><td>Sistema MilliQ</td><td>Merk Millipore</td><td>ZR0Q008WW</td><td></td></tr><tr><td>OP1550 Interferômetro</td><td>Optics11 Life</td><td></td><td>sem número de catálogo</td></tr><tr><td>Óptica 11 Sonda de vida (k = 0,02-0,005 N/m, R = 3-3,5 um)</td><td>Óptica 11 Vida</td><td></td><td>sem número de catálogo</td></tr><tr><td>Óptica 11 Sonda de vida (k = 0,46-0,5 N/m, R = 50-55 um)</td><td>Óptica 11 Vida</td><td></td><td>sem número de catálogo</td></tr><tr><td>Penicilina/Estreptomicina</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>RainX repelente de chuva RainX</td><td></td><td>26012</td><td></td></tr><tr><td>Placas de Petri padrão (90 mm)</td><td>Thermo Scientific</td><td>101RTIRR</td><td></td></tr><tr><td>Tetrametiletilenodiamina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>110-18-9</td><td></td></tr><tr><td>Dessecador de vácuo</td><td>Thermo Scientific</td><td>531-0250</td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Software de aquisição de dados (v 3.4.1)</td><td>Optics 11 Life</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GitHub Desktop (opcional)</td><td>Microsoft</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Python 3</td><td>Python Software Foundation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Visual Studio Code (opcional)</td><td>Microsoft</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

fluxo de trabalho experimental e de análise de dados para nanoindentação de matéria mole

Experimental and Data Analysis Workflow for Soft Matter Nanoindentation

Nanoindentação refere-se a uma classe de técnicas experimentais em que uma sonda de força micrométrica é usada para quantificar as propriedades mecânicas locais de biomateriais e células moles. Esta abordagem ganhou um papel central nos campos da mecanobiologia, design de biomateriais e engenharia de tecidos, para obter uma caracterização mecânica adequada de materiais moles com uma resolução comparável ao tamanho de células individuais (μm). A estratégia mais popular para adquirir tais dados experimentais é empregar um microscópio de força atômica (AFM); enquanto este instrumento oferece uma resolução sem precedentes em força (até pN) e espaço (sub-nm), sua usabilidade é muitas vezes limitada por sua complexidade que impede medições rotineiras de indicadores integrais de propriedades mecânicas, como o Módulo de Young (E). Uma nova geração de nanoindenters, como aqueles baseados na tecnologia de detecção de fibra óptica, ganhou recentemente popularidade por sua facilidade de integração, permitindo aplicar forças sub-nN com resolução espacial μm, portanto, sendo adequado para sondar propriedades mecânicas locais de hidrogéis e células.
Neste protocolo, um guia passo-a-passo detalhando o procedimento experimental para adquirir dados de nanoindentação em hidrogéis e células usando um nanoindenter de detecção de fibra óptica ferrule-top comercialmente disponível é apresentado. Considerando que algumas etapas são específicas para o instrumento aqui utilizado, o protocolo proposto pode ser tomado como um guia para outros dispositivos de nanoindentação, desde que algumas etapas sejam adaptadas de acordo com as diretrizes do fabricante. Além disso, um novo software Python de código aberto equipado com uma interface gráfica de usuário amigável para a análise de dados de nanoindentação é apresentado, o que permite a triagem de curvas incorretamente adquiridas, filtragem de dados, computação do ponto de contato através de diferentes procedimentos numéricos, a computação convencional de E, bem como uma análise mais avançada particularmente adequada para dados de nanoindentação de célula única.

Seguindo o protocolo, obtém-se um conjunto de curvas F-z. O conjunto de dados provavelmente conterá boas curvas e curvas a serem descartadas antes de continuar com a análise. Em geral, as curvas devem ser descartadas se sua forma for diferente da mostrada na Figura 4A. A Figura 5AI mostra um conjunto de dados de ~100 curvas obtidas em um hidrogel PAAm macio de E 0,8 KPa35 esperado carregado na GUI do NanoPrepare. A maior...

O protocolo apresenta um fluxo de trabalho completo para experimentos de nanoindentação de materiais moles, incluindo hidrogéis e células. Primeiro, as etapas experimentais para adquirir dados de espectroscopia de força são detalhadas; em seguida, a análise de tais dados é detalhada através de um software Python de código aberto recém-desenvolvido, que é gratuito para download no GitHub.

Fluxo de trabalho experimental e de análise de dados para nanoindentação de matéria mole

Nanoindentation refers to a class of experimental techniques where a micrometric force probe is used to quantify the local mechanical properties of soft ...

Este protocolo mostra um guia passo-a-passo para medir a rigidez de hidrogéis e células usando um nanoindenter comercialmente disponível e também apresenta um software de código aberto para analisar de forma reprodutível os dados adquiridos. O protocolo nos permite obter dados semelhantes a microscopia de força atômica, no entanto, em uma fração da complexidade. Portanto, este protocolo será útil para cientistas interessados em estudar propriedades mecânicas de amostras saudáveis e doentes, mas também acreditamos que será de aplicabilidade mais ampla no contexto da nanoindentação para materiais moles.Depois de ligar o instrumento e montar a sonda selecionada para o experimento, comece a calibrar a sonda. Clique em Inicializar na janela principal do software. No Menu de calibração exibido, insira os detalhes da sonda nas caixas de entrada.Em seguida, encha uma placa de Petri grossa de vidro com um fundo plano com o mesmo meio que a placa de amostra e combine a temperatura do meio com a da amostra. Em seguida, coloque o prato de calibração sob a sonda. Para calibração em líquido, pré-molhe a sonda com uma gota de etanol a 70% ou isopropanol com a extremidade da pipeta em contacto leve com a arruga de vidro, de modo a que a gota deslize sobre o cantilever e a ponta esférica.Em seguida, deslize manualmente o braço do nanoindenter para baixo até que a sonda esteja totalmente submersa, mas ainda longe do fundo da placa de Petri. Aguarde cinco minutos para permitir que as condições de equilíbrio sejam alcançadas no líquido. Em seguida, no menu Inicializar do software, clique em Scan Wavelength.A tela do interferômetro mostrará uma barra de progresso. Verifique se a varredura óptica foi bem-sucedida navegando até o painel Varredura de comprimento de onda na caixa do interferômetro. Em seguida, no menu Inicializar, clique em Localizar superfície para abaixar progressivamente a sonda.A sonda para de se mover quando entra em contato com a placa de Petri de vidro. Quando a sonda estiver em contato com a superfície, mova a sonda para baixo em um micrômetro usando o botão de seta y para baixo na janela principal do software. Observe o sinal verde na janela ao vivo para mudanças na linha de base a cada passo de um micrômetro.Em seguida, clique em Calibrar no menu Inicializar. Quando a calibração estiver concluída, verifique os fatores de calibração antigos e novos na janela pop-up exibida. Se o novo fator de calibração estiver na faixa correta, conforme explicado no manuscrito, clique em Usar Novo Fator.Em seguida, suba o piezo em 500 micrômetros. Em seguida, verifique se o círculo de demodulação foi calibrado corretamente navegando até a guia Demodulação na área de trabalho do interferômetro. Toque suavemente na mesa óptica ou no nanoindenter para induzir ruído suficiente.Um círculo branco de pontos de dados discretos deve cobrir aproximadamente o círculo vermelho. Carregue a placa de Petri que contém a amostra no estágio do microscópio e mova manualmente a sonda do nanoindenter para uma posição desejada acima da amostra. Deslize a sonda em solução, tomando o cuidado de deixar um a dois milímetros entre a sonda e a superfície da amostra.Aguarde cinco minutos para que a sonda se equilibre em solução. Concentre-se na sonda com o microscópio óptico. Para medir o módulo de materiais macios de Young, clique em Configurar experimento.Adicione uma etapa Localizar superfície e um único recuo no controle de deslocamento para determinar parâmetros experimentais a serem usados posteriormente para a varredura automática da matriz. Se o recuo único for bem-sucedido, configure uma varredura de matriz contendo 50 a 100 pontos espaçados em 10 a 100 micrômetros. Depois de garantir que a caixa Localizar Superfície Automaticamente esteja marcada, clique em Usar Posição do Palco para iniciar a varredura da matriz a partir da posição do estágio atual.Configure o perfil de varredura de matriz no controle de deslocamento. Deixe o número de segmentos para cinco e use o perfil de deslocamento padrão. Se necessário, altere o perfil de deslocamento e o tempo para cada segmento inclinado.Não exceda as taxas de deformação superiores a 10 micrómetros por segundo. Salve o experimento configurado no caminho do experimento desejado. Clique em Executar experimento e aguarde que ele seja concluído.Quando todos os dados forem adquiridos, limpe a sonda e desligue o instrumento conforme descrito no texto. Para triagem de curvas de deslocamento de força e produção de conjunto de dados limpos no formato JSON, prepare o lançamento. py a partir da linha de comando no computador do laboratório.Selecione o formato de dados Optics11 na lista suspensa. Se os dados não forem carregados corretamente, reinicie a interface gráfica do usuário e selecione Optics11 Old. Em seguida, clique em Carregar pasta e selecione uma pasta contendo os dados a serem analisados.Limpe o conjunto de dados usando as guias presentes à direita da interface gráfica do usuário. Em seguida, clique em Salvar JSON e insira um nome apropriado para o conjunto de dados limpo. Envie o arquivo JSON para o computador onde o software NanoAnalysis foi instalado, se diferente do computador atual.Inicie o nano. py a partir da linha de comando. No canto superior esquerdo da interface gráfica do usuário, clique em Carregar experimento e selecione o arquivo JSON.Isso preencherá a lista de arquivos e o gráfico de curvas brutas mostrando o conjunto de dados em termos de curvas de deslocamento de força. Na caixa Estatísticas, marque os valores dos três parâmetros, N ativado, N falhou e N excluído. Para visualizar uma curva específica com mais detalhes, clique na curva.Isso irá destacá-lo em verde e mostrá-lo no gráfico da curva atual. Uma vez que uma única curva tenha sido selecionada, os parâmetros R e k serão preenchidos na caixa Estatísticas. Depois que o conjunto de dados tiver sido limpo, filtre qualquer ruído nas curvas usando os filtros implementados na caixa Filtragem.Em seguida, inspecione as curvas filtradas no gráfico de curva atual. A curva filtrada está em preto, enquanto a versão não filtrada é verde. Para encontrar o ponto de contacto, a partir da caixa Ponto de Contacto, escolha um de uma série de procedimentos numéricos que foram implementados no software.Ajuste os parâmetros do algoritmo para se adequar ao conjunto de dados para que o ponto de contato esteja localizado corretamente, conforme explicado no manuscrito. Para ver onde o ponto de contato foi encontrado em uma única curva, selecione a curva clicando nela. Em seguida, clique em Inspecionar.Verifique a janela pop-up que aparece para identificar onde o ponto de contato foi localizado. Em seguida, clique em Análise Hertz. Isso gerará três gráficos.Dados de recuo da força de verificação para cada curva no conjunto de dados, juntamente com o ajuste médio de Hertz mostrado em vermelho. Em seguida, verifique a curva de recuo de força média com uma banda de erro mostrando um desvio padrão, juntamente com o ajuste médio de Hertz mostrado em vermelho. Em seguida, verifique o gráfico de dispersão do módulo de Young originado do ajuste do modelo de Hertz a cada curva individual.Inspecione a caixa Resultados para a média calculada do módulo de Young e seu desvio padrão, e certifique-se de que eles são razoáveis para o experimento dado. Em seguida, na caixa Salvar, clique em Hertz. Na janela pop-up, digite o nome do arquivo e o diretório e clique em Salvar.Um arquivo tsv será criado. Abra o arquivo tsv em qualquer software adicional para análise estatística e plotagem adicional. Para obter dados de nanoindentação celular, clique em Análise de espectros de elasticidade.Inspecione os dois gráficos produzidos, a saber, o módulo de Young em função da profundidade de recuo para cada curva e o módulo médio de Young em função do recuo ajustado por um modelo de bicamada. Quando a análise estiver concluída, clique em ES na caixa Salvar. Isso exportará um arquivo tsv no diretório especificado, que pode ser aberto e plotado em qualquer outro software de escolha.Um experimento bem-sucedido resulta no segmento de aproximação de uma curva de deslocamento de força, tendo uma linha de base clara e plana, uma região de transição e uma região inclinada. As curvas que mostram alterações desta forma são facilmente removidas do conjunto de dados usando o NanoPrepare. Curvas médias de força-indentação, juntamente com o modelo médio de Hertz para um hidrogel de poliacrilamida macia e um hidrogel rígido, são mostradas aqui.Plotando valores individuais do módulo de Young, a média esperada do módulo de Young foi recuperada para ambos os hidrogéis. Para experimentos de nanoindentação celular, a curva média de força-indentação e o modelo Hertz médio correspondente demonstram que o modelo de Hertz não captura totalmente a evolução da força com o aumento da profundidade de recuo para experimentos de nanoindentação celular. Os espectros de elasticidade média ajustados até um recuo de 200 nanômetros são demonstrados aqui.Os espectros de elasticidade média começam a aumentar a uma profundidade de recuo de 200 nanômetros, indicando a contribuição de um substrato para o módulo aparente de Young sondado. Devido a isso, 200 nanômetros foram escolhidos como a faixa de ajuste para o modelo Hertz e bicamada. O ajuste do modelo de bicamada permite extrair mais informações sobre o estado mecânico da célula, incluindo a espessura do córtex de actina celular, o módulo do córtex de actina celular e o módulo de volume celular, conforme explicado no texto principal.Uma comparação direta entre o modelo de Hertz e a abordagem dos espectros de elasticidade em termos de distribuição do módulo de Young revela distribuições sobrepostas com médias comparáveis, demonstrando a viabilidade da abordagem dos espectros de elasticidade. Localizar com precisão o ponto de contato e manter os parâmetros do algoritmo escolhidos consistentes entre os conjuntos de dados que se deseja comparar é fundamental para obter comparações confiáveis entre as amostras. O método é de aplicabilidade geral para quantificar as propriedades elásticas locais de amostras biológicas, incluindo esferoides, organoides, tecidos e, em geral, toda a matéria mole.

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