Mancha rápida de Golgi para Visualização da Coluna Dendrítica no Hipocampo e Córtex Pré-Frontal

Embora relativamente simples, a técnica de impregnação de Golgi tem alguns passos complicados e a falha em fazê-las corretamente resulta em células que são impróprias para análise. Esta técnica fornece rotulagem rápida e reprodutível de neurônios impregnados de Golgi. Além disso, o pequeno erro padrão da média permite a comparação entre experimentos.

A parte mais desafiadora sobre esta técnica é cortar as seções de criostat, porque há uma consistência e fixação incomuns, e, portanto, levá-las no slide flat é um pouco de um desafio que requer prática. Primeiro, coloque uma pequena quantidade de tecido médio em um mandril criostat pré-frio. Monte os blocos cerebrais em mandris criostates descongelando um lado do bloco ligeiramente em uma mão enluvada e colocando-o no meio de tecido.

Use um spray de congelamento na faca e no bloco. Use a placa anti-rolo ou a escova para manter a seção plana durante o corte. Corte seções de 100 micrômetros em um criostat a menos 22 graus Celsius.

Degelo montar, se possível, usando um slide de temperatura ambiente e rapidamente se opor a ele para a seção. Alternativamente, mantenha slides no criostat, então eles estão congelando. Transfira a seção com fórceps frios ou uma escova de tinta fria e, em seguida, descongele a montagem.

Monte três a quatro seções coronais em subsídios. Limpe a faca com lenços de papel entre as fatias. Se a faca precisar de mais limpeza, use 100% de etanol e seque antes de cortar a próxima fatia.

Coloque slides em racks, espaçados o suficiente para permitir o acesso à solução às seções. Coloque seções em água destilada duas vezes por quatro minutos antes de colocá-las na solução de impregnação de Golgi por 10 minutos. Separe os deslizamentos de cobertura para garantir que apenas um deslizamento de cobertura seja colocado nas seções.

Cubra os slides de vidro com uma quantidade generosa de meio de montagem antes de colocar um deslizamento de tampa de vidro no slide. Uma vez que a tampa escorregou, lâminas secas sinalizadas em qualquer papel não poroso por três a cinco dias, movendo-os ligeiramente, especialmente após o primeiro dia para evitar furar. Posteriormente transfira os slides para porta-slides e, idealmente, deslizes secos por pelo menos três semanas antes de examiná-los.

Para analisar a densidade da coluna vertebral dendrítica em neurônios piramidários tanto do córtex pré-frontal medial quanto da região ca1 do hipocampo, meça o comprimento dendrático utilizando-se no programa de análise de imagem. Conte as espinhas dos dendritos usando um contador de mãos e registe o comprimento e o número de lombadas. Para análise, escolha neurônios com corpos celulares e dendritos enquanto impregnados, e dendritos que sejam contínuos e distinguíveis das células adjacentes.

A figura mostra exemplos de células impregnadas de Golgi na região do CA1 do hipocampo é mostrado em baixa e alta potência. A figura ilustra um experimento no qual a densidade da coluna dendrítica basal foi aumentada em células piramidas em ratos adolescentes machos e fêmeas após enriquecimento ambiental em CA1 e o córtex pré-frontal medial. É desafiador manter as seções frias o suficiente ao cortar e usamos uma grande quantidade de spray de congelamento para fazer isso.

E, posteriormente, é difícil colocar as seções nos slides e tê-las secas. Esta técnica é usada para examinar características neuroanatomômicas. Pode ser usado sozinho ou em combinação com outros métodos de rastreamento neuroanatomômico.