Mancha rápida de Golgi para Visualização da Coluna Dendrítica no Hipocampo e Córtex Pré-Frontal
3 de dezembro de 2021
O protocolo descreve uma modificação do método golgi rápido, que pode ser adaptado a qualquer parte do sistema nervoso, para colorir neurônios no hipocampo e córtex pré-frontal medial do rato.
Embora relativamente simples, a técnica de impregnação de Golgi tem alguns passos complicados e a falha em fazê-las corretamente resulta em células que são impróprias para análise. Esta técnica fornece rotulagem rápida e reprodutível de neurônios impregnados de Golgi. Além disso, o pequeno erro padrão da média permite a comparação entre experimentos.
A parte mais desafiadora sobre esta técnica é cortar as seções de criostat, porque há uma consistência e fixação incomuns, e, portanto, levá-las no slide flat é um pouco de um desafio que requer prática. Primeiro, coloque uma pequena quantidade de tecido médio em um mandril criostat pré-frio. Monte os blocos cerebrais em mandris criostates descongelando um lado do bloco ligeiramente em uma mão enluvada e colocando-o no meio de tecido.
Use um spray de congelamento na faca e no bloco. Use a placa anti-rolo ou a escova para manter a seção plana durante o corte. Corte seções de 100 micrômetros em um criostat a menos 22 graus Celsius.
Degelo montar, se possível, usando um slide de temperatura ambiente e rapidamente se opor a ele para a seção. Alternativamente, mantenha slides no criostat, então eles estão congelando. Transfira a seção com fórceps frios ou uma escova de tinta fria e, em seguida, descongele a montagem.
Monte três a quatro seções coronais em subsídios. Limpe a faca com lenços de papel entre as fatias. Se a faca precisar de mais limpeza, use 100% de etanol e seque antes de cortar a próxima fatia.
Coloque slides em racks, espaçados o suficiente para permitir o acesso à solução às seções. Coloque seções em água destilada duas vezes por quatro minutos antes de colocá-las na solução de impregnação de Golgi por 10 minutos. Separe os deslizamentos de cobertura para garantir que apenas um deslizamento de cobertura seja colocado nas seções.
Cubra os slides de vidro com uma quantidade generosa de meio de montagem antes de colocar um deslizamento de tampa de vidro no slide. Uma vez que a tampa escorregou, lâminas secas sinalizadas em qualquer papel não poroso por três a cinco dias, movendo-os ligeiramente, especialmente após o primeiro dia para evitar furar. Posteriormente transfira os slides para porta-slides e, idealmente, deslizes secos por pelo menos três semanas antes de examiná-los.
Para analisar a densidade da coluna vertebral dendrítica em neurônios piramidários tanto do córtex pré-frontal medial quanto da região ca1 do hipocampo, meça o comprimento dendrático utilizando-se no programa de análise de imagem. Conte as espinhas dos dendritos usando um contador de mãos e registe o comprimento e o número de lombadas. Para análise, escolha neurônios com corpos celulares e dendritos enquanto impregnados, e dendritos que sejam contínuos e distinguíveis das células adjacentes.
A figura mostra exemplos de células impregnadas de Golgi na região do CA1 do hipocampo é mostrado em baixa e alta potência. A figura ilustra um experimento no qual a densidade da coluna dendrítica basal foi aumentada em células piramidas em ratos adolescentes machos e fêmeas após enriquecimento ambiental em CA1 e o córtex pré-frontal medial. É desafiador manter as seções frias o suficiente ao cortar e usamos uma grande quantidade de spray de congelamento para fazer isso.
E, posteriormente, é difícil colocar as seções nos slides e tê-las secas. Esta técnica é usada para examinar características neuroanatomômicas. Pode ser usado sozinho ou em combinação com outros métodos de rastreamento neuroanatomômico.
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Visão Geral
Este estudo descreve um método Golgi rápido modificado para coloração de neurônios especificamente no hipocampo e no córtex pré-frontal medial de ratos. A técnica permite a marcação eficaz de neurônios, possibilitando a análise de características neuroanatômicas.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Neuroanatomia
- Biologia Celular
Antecedentes
- A técnica de impregnação pelo método de Golgi é um método bem estabelecido para coloração de neurônios.
- A aplicação permite a investigação da estrutura dendrítica e da densidade de espinhos.
- O método pode ser adaptado a diversas regiões do sistema nervoso.
- Existem desafios no corte de secções em criostatos devido à consistência do tecido.
Objetivo do Estudo
- Aprimorar o método de Golgi existente para uma melhor marcação neuronal.
- Investigar a densidade de espinhos dendríticos em regiões cerebrais específicas.
- Explorar os efeitos de fatores ambientais sobre a morfologia neuronal.
Métodos Utilizados
- Técnica de impregnação Golgi rápida em tecidos cerebrais de rato.
- Alta precisão no corte de secções criostáticas de 100 micrômetros.
- Técnicas de descongelamento para montagem correta das secções sobre lâminas.
- Incubação em solução de Golgi para coloração eficaz de neurônios.
- A análise envolveu a medição do comprimento dendrítico e a contagem de espinhos utilizando software de análise de imagens.
Resultados Principais
- A técnica resultou em marcação reprodutível de neurônios adequada para análise.
- Evidências mostraram aumento na densidade de espinhos em neurônios piramidais após enriquecimento ambiental.
- Observou-se a identificação bem-sucedida de alterações na densidade de espinhos dendríticos basais em ratos adolescentes de ambos os sexos.
Conclusões
- Este estudo valida o método Golgi modificado como uma abordagem confiável para análise neuroanatômica.
- Os avanços na densidade de espinhos dendríticos contribuem para a compreensão da plasticidade neuronal.
- Aplicações futuras podem incluir a avaliação de influências ambientais na morfologia cerebral.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Este método rápido de coloração Golgi fornece uma abordagem reprodutível e de baixa variabilidade para a visualização da densidade de espinhos dendríticos em regiões cerebrais-chave relevantes para modelos de doenças neuropsiquiátricas. Ao permitir a quantificação consistente de estruturas sinápticas no hipocampo e no córtex pré-frontal, a técnica apoia a validação de alvos e a redução de riscos mecanicistas em programas de descoberta de fármacos para o SNC. Sua compatibilidade com o armazenamento de tecidos congelados e a mínima variabilidade entre experimentos aumentam a confiabilidade do ensaio em estudos pré-clínicos longitudinais.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas relacionadas à plasticidade sináptica e à morfologia dendrítica em circuitos neurais relevantes para doenças.
- Valor Operacional: Fornece medidas padronizadas e quantitativas de densidade de espinhos por 10 µm de dendrito, permitindo comparações confiáveis entre experimentos.
- Valor Preditivo: Apoia a redução de riscos biológicos ao associar a neuroanatomia estrutural a desfechos funcionais em modelos de enriquecimento ambiental e farmacológicos.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Prontidão do ensaio: Produz neurônios consistentemente bem impregnados com mínimo resíduo de fundo, permitindo visualização e contagem confiáveis das espinhas dendríticas.
- Reprodutibilidade: Demonstra desvios extremamente pequenos na densidade de espinhas entre experimentos, favorecendo a precisão do ensaio e o poder estatístico.
- Escalabilidade: Permite o acúmulo de tecido cerebral e armazenamento congelado até o processamento, facilitando o processamento em lotes e a eficiência do fluxo de trabalho em pipelines de descoberta.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Relevância para Doenças: Aplicável às regiões do hipocampo e córtex pré-frontal implicadas em modelos de cognição, depressão e esquizofrenia.
- Continuidade Tradutiva: Permite a análise da densidade de espinhos como leitura alinhada a biomarcadores para avaliar os efeitos de compostos sobre a estrutura neuronal.
- Redução de Riscos Mecanísticos: Relaciona alterações estruturais (por exemplo, aumento da densidade de espinhos após enriquecimento ambiental) com a plasticidade funcional, reforçando a confiança no alvo em programas do SNC.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se insere no continuum de descoberta, desde a validação inicial do alvo até a triagem fenotípica pré-clínica, especialmente para programas voltados para o SNC que avaliam neuroplasticidade e integridade sináptica.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses sobre a estrutura dendrítica e a densidade de espinhos como indicadores da saúde sináptica e da conectividade neuronal.
- Triagem: Fornece resultados quantitativos e reprodutíveis (contagem de espinhos por 10 µm de dendrito) adequados para análise de alto conteúdo e comparação de efeitos de compostos.
- Análises: Permite a comparação estatística da densidade de espinhos entre condições utilizando análise de imagem e contagem manual, com baixo erro padrão da média, aumentando a confiabilidade dos dados.
- Pesquisa Translacional: Alinha-se à validação pré-clínica ao fornecer indicadores estruturais que se correlacionam com resultados funcionais em modelos de aprendizado e memória.
- Reutilização Empresarial: Representa uma plataforma neuroanatômica padronizada e reutilizável, aplicável a diversas regiões cerebrais e modelos de doenças.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva na validação de alvos ao reduzir a ambiguidade mecanicista nas avaliações da plasticidade sináptica.
- Valor Operacional: Melhora a reprodutibilidade e a padronização por meio de impregnação consistente, baixo fundo e mínima variância entre experimentos.
- Valor Estratégico: Aprimora decisões de avançar/não avançar ao fornecer dados neuroanatômicos confiáveis para priorizar compostos com efeitos demonstráveis sobre a estrutura dendrítica.
- Impacto no Portfólio: Permite o avanço ajustado ao risco ao quantificar biomarcadores estruturais do SNC associados a desfechos cognitivos e comportamentais.
Considerações de Implementação
- Exige experiência em corte com criostato e manipulação de tecidos para manter a planicidade e integridade das seções durante o corte a -22°C.
- Depende de técnicas adequadas de montagem por descongelamento e do uso de placa antirrolamento ou pincel para prevenir danos às seções durante a transferência para lâminas.
- Necessita de tempos padronizados de coloração (10 min na solução de Golgi) e aplicação de meio de montagem para garantir marcação neuronal consistente.
- Envolve períodos prolongados de secagem (3–5 dias inicialmente, seguidos por ≥3 semanas) antes da obtenção de imagens, exigindo planejamento prévio do cronograma do fluxo de trabalho.
- Requer pessoal treinado para contagem precisa de espinhos dendríticos e medição de comprimento, utilizando ferramentas de análise de imagem e contadores manuais.
Perguntas Frequentes sobre Biofármacos
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:48
Sectioning of Brain Tissues and Mounting
2:04
Staining and Dehydration of Brain Tissue
3:06
Determination of Dendritic Spine Density
3:48
Results: Observation of Hippocampus and Effect of Environmental Enrichment on CA1 and mPFC
4:23
Conclusion
