Name: Mancha rápida de Golgi para Visualização da Coluna Dendrítica no Hipocampo e Córtex Pré-Frontal (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-12-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 58 s
Description: Aprenda a técnica de impregnação rápida de Golgi para visualização de neurônios no hipocampo e córtex pré-frontal de ratos. Este método permite analisar a densidade de espinhos dendríticos e a morfologia neuronal com alta reprodutibilidade.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Este trabalho foi apoiado pela Sacred Heart University Undergraduate Research InitiativeGrants.

Todos os procedimentos experimentais são aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade do Coração Sagrado e estão de acordo com o Guia do NIH para o Cuidado e Uso de Animais.
1. Isolamento e infiltração do tecido cerebral
<ol><li>Soluções Pré-x A e B do kit de coloração Golgi 24 horas antes de usar e manter em garrafas escuras e/ou no escuro. Faça aproximadamente 80 mL de mistura de solução A e B que é suficiente para mudar a solução após 24 horas. Guarde garrafas herméticas. NOTA: A perfusão com soro fisiológico ou paraformaldeído não é necessária.</li>
	<li>Sacrifique ratos por guilhotina após eutanásia de dióxido de carbono e remova cérebros em segundos. Enxágüe cérebros em soro fisiológico, se necessário, mas não é necessário.<ol>
<li>Coloque o cérebro, córtex para baixo para que o hipotálamo seja visível porque os cortes são feitos anteriores e posteriores a ele, em uma superfície não porosa. Corte em um bloco anterior (contém o córtex pré-frontal) e posterior (contém o hipocampo) como mostrado na Figura 1.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Coloque blocos nas soluções pré-misturadas de A e B, certificando-se de que elas estejam bem imersas na solução. Certifique-se de que o volume das soluções A e B seja suficiente para imergir os blocos. Armazene blocos em garrafas marrons ou garrafas limpas cobertas com papel alumínio (para manter a luz fora) no escuro à temperatura ambiente.</li>
	<li>Substitua a solução após 24 horas e mantenha no escuro por mais 13 dias em temperatura ambiente. NOTA: Se usado com cérebros de camundongos, não há necessidade de bloquear, e todo o cérebro pode ser colocado na solução. Se as áreas cerebrais de coloração, que são diferentes em tamanho, o tempo nas soluções A e B pode ter que ser determinado por tentativa e erro.</li>
	<li>Após duas semanas o tecido é bem infiltrado com as soluções A e B, transfira os blocos para a solução crioprotetora (solução C no kit de coloração golgi), e deixe-os por 48-72 h a 4 °C. NOTA: Após a proteção crioproteção, os blocos podem ser congelados até um processamento adicional. Além disso, note que todas as soluções do kit são coletadas e descartadas como resíduos perigosos.</li>
	<li>Congele o cérebro, cortex para baixo, em um deslizamento de vidro em gelo seco. Uma vez congelado, corte o criostat ou armazene a -80 °C até seção usando um criostat. NOTA: Não congele em nitrogênio líquido, pois isso produz rachaduras no tecido.</li>
</ol>2. Secção de tecidos cerebrais
<ol><li>Coloque uma pequena quantidade de tecido médio em um mandril criostat pré-resfriado. Monte blocos em mandris criostates descongelando um lado do bloco ligeiramente na mão (luvas) e colocando-o no meio de tecido. NOTA: Não é necessário incorporar o tecido. O bloco que contém o hipocampo é um pouco mais fácil de cortar do que o bloco com o córtex pré-frontal porque este último é anterior ao caloso corpus e as duas metades são separadas.</li>
	<li>Corte seções de 100 μm em um criostat a -22 °C e monte em lâminas subcoradas. Podem ser utilizadas seções de até 150 μm de espessura. Tente montar 3-4 seções coronais por slide à medida que isso diminui o número de slides que requerem processamento. Use uma das seguintes técnicas para manter as seções congeladas até que elas entrem no slide. NOTA: Estas seções não são fixas da maneira usual e, portanto, tendem a derreter rapidamente. Deixe as seções derreterem no slide. Se eles começarem a derreter antes de serem colocados no escorregador, é impossível fazê-los ficar lisos no slide. Existem várias técnicas para fazer isso.<ol>
<li>Use um spray de congelamento na faca e no bloco. Dependendo da temperatura e umidade na sala, isso pode ser necessário para cada seção. Use a placa antiroll ou um pincel para manter a seção plana durante o corte. NOTA: Certifique-se de ter spray de congelamento suficiente. Várias latas podem ser usadas ao cortar 20 blocos.</li>
		<li>Degelo montar, se possível, usando um slide de temperatura ambiente e rapidamente aponha-lo à seção. Com a prática, pode-se montar várias seções ao mesmo tempo. Se isso não funcionar, mantenha slides no criostat para que estejam muito frios e transfira a seção com fórceps frios ou um pincel frio e, em seguida, descongele o suporte.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Limpe a faca com lenços de papel entre as fatias. Se a faca precisar de mais limpeza, use 100% de etanol (EtOH) e deixe secar antes de cortar a próxima fatia.</li>
	<li>Uma vez montado no slide, coloque o slide plano em bandejas de slides de papelão e deixe que as seções sequem à temperatura ambiente (por várias horas a um máximo de 48 h) no escuro. Não cubra a bandeja de slides. Certifique-se de que as seções estão completamente secas antes da impregnação de Golgi. Guarde plana, no escuro, em bandejas de slides até a impregnação de Golgi. NOTA: A secagem das seções não causa nenhum dano.</li>
</ol>3. Coloração e desidratação do tecido cerebral
<ol><li>Realizar coloração em pratos de coloração de vidro. Misture as soluções D e E imediatamente antes da coloração. De acordo com o protocolo, adicione uma parte da solução D, uma parte da solução E e duas partes de água destilada. Para pratos de coloração de vidro, faça uma solução de 200 mL para submergir completamente as seções. Para os frascos Koplin, isso requer menos volume.</li>
	<li>Coloque slides em racks espaçados o suficiente para permitir o acesso à solução às seções.</li>
	<li>Coloque seções em água destilada por 4 min (2x) antes de colocá-las na solução de coloração de impregnação de Golgi por 10 minutos. Altere a solução de coloração a cada 70 seções. Troque a água destilada quando ficar amarela. NOTA: O tempo para a etapa de coloração é crítico. Muito curto não permite coloração suficiente e causas muito longas sobre a coloração, tornando os dendritos difíceis de separar ao fazer análise. Uma vez fora da solução de coloração, o tempo é menos crítico.</li>
	<li>Desidratar as seções da seguinte forma: 70% EtOH (5 min), 95% EtOH (5 min; 2x), 100% EtOH (5 min; 2x), agente de compensação (5 min; 3x). Mude todas as soluções com frequência, especialmente o EtOH 100% e o agente de compensação para garantir que as seções permaneçam anidros. NOTA: Não é necessário passar por uma etapa de 50% de EtOH. A contra-retenção não é necessária para visualização celular porque a impregnação de Golgi fornece contraste suficiente. O uso de outros agentes de compensação não funcionou tão bem quanto o utilizado aqui (ver Tabela de materiais).</li>
	<li>Tampas com tampas de vidro que têm 60 mm de comprimento com uma quantidade generosa de meio de montagem. Certifique-se de que há.o menor número possível de bolhas de ar. Se necessário, remova cuidadosamente e refaça o deslizamento (pode ser feito até semanas depois). Faça isso muito lentamente para não danificar a seção (pode ser feito por causa da grande quantidade de meio de montagem). NOTA: Uma grande quantidade de meio de montagem é um pouco confusa, mas ainda é necessária, pois o meio de montagem suficiente deve ser usado para cobrir as seções grossas de 100 μm.</li>
	<li>Para garantir que apenas uma mancha de cobertura seja colocada nas seções, separe as tampas antes do processo.</li>
	<li>Uma vez que a tampa escorregou, desliza seco em qualquer papel não poroso por 3-5 dias, movendo-os ligeiramente, especialmente após o primeiro dia, para evitar furar. Após 3-5 dias transfira os slides para porta-slides e, idealmente, lâminas secas por pelo menos 3 semanas antes de examiná-los. Mantenha os slides planos para diminuir a possibilidade de formação de bolhas de ar.</li>
</ol>4. Determinação da densidade da coluna vertebral dendrítica
<ol><li>Para análise da densidade da coluna vertebral dendrítica em neurônios piramidais tanto do mPFC quanto da região do CA1 do hipocampo, examine os dendritos basais secundários mais laterais e os dendritos apical terciários mais laterais, conforme descrito na etapa 4.1.1 (Figura 2).<ol>
<li>Escolha um dendrito, meça o comprimento do dendrito usando um programa de análise de imagem, conte as espinhas nos dendritos usando um contador de mãos e registe tanto o comprimento quanto o número de colunas.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Estude e analise seis células por região (mPFC, CA1) por cérebro. Quantifique um mínimo de seis cérebros por grupo como descrito anteriormente 7,8. Escolha neurônios que atendam aos seguintes critérios de análise: corpos celulares e dendritos estão bem impregnados; dendritos são distinguíveis das células adjacentes e são contínuos.</li>
	<li>Conte as espinhas a 1000x (imersão em óleo) por contagem manual com um microscópio leve e meça o comprimento dendrático usando um programa de análise de imagem. Calcule a densidade da coluna dividindo o número da coluna pelo comprimento do dendrite e expresse dados como o número de colunas/ 10 μm dendrite. NOTA: Existem métodos muito mais sofisticados para diferenciar subtipos da coluna vertebral e arquitetura dendrítica que podem ser usados, mas a contagem manual com um microscópio leve em 1000x pode dar um resultado rápido que pode então determinar se uma investigação mais aprofundada é necessária. Embora todos os esforços sejam feitos para amostrar consistentemente dendritos semelhantes, há variações na espessura que podem afetar a contagem.</li>
</ol>

<ol><li>Pannese, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Golgi+Stain%3A+invention%2C+diffusion+and+impact+on+neurosciences%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+History+of+the+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">The Golgi Stain: invention, diffusion and impact on neurosciences.</a> Journal of the History of the Neurosciences. 8 (2), 132-140 (1999).</li>
<li>Bentivoglio, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Original+Histological+Slides+of+Camillo+Golgi+and+His+Discoveries+on+Neuronal+Structure%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroanatomy%22%5BJournal%5D)">The Original Histological Slides of Camillo Golgi and His Discoveries on Neuronal Structure.</a> Frontiers in Neuroanatomy. 13, 3(2019).</li>
<li>Swanson, L. W., Newman, E., Araque, A., Dubinsky, J. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSwanson%2C+LW+%22The+Beautiful+Brain%3A+The+Drawings+of+Santiago+Ramon+y+Cajal%22">The Beautiful Brain: The Drawings of Santiago Ramon y Cajal</a>. , Abrams. 208(2017).</li>
<li>Dall'Oglio, A., Ferme, D., Brusco, J., Moreira, J. E., Rasia-Filho, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+%26%2334%3Bsingle-section%26%2334%3B+Golgi+method+adapted+for+formalin-fixed+human+brain+and+light+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">The &#34;single-section&#34; Golgi method adapted for formalin-fixed human brain and light microscopy.</a> Journal of Neuroscience Methods. 189 (1), 51-55 (2010).</li>
<li>Gabbott, P. L., Somogyi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+%27single%27+section+Golgi-impregnation+procedure%3A+methodological+description%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">The 'single' section Golgi-impregnation procedure: methodological description.</a> Journal of Neuroscience Methods. 11 (4), 221-230 (1984).</li>
<li>Gould, E., Frankfurt, M., Westlind-Danielsson, A., McEwen, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developing+forebrain+astrocytes+are+sensitive+to+thyroid+hormone%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Developing forebrain astrocytes are sensitive to thyroid hormone.</a> Glia. 3 (4), 283-292 (1990).</li>
<li>Gould, E., Woolley, C. S., Frankfurt, M., McEwen, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gonadal+steroids+regulate+dendritic+spine+density+in+hippocampal+pyramidal+cells+in+adulthood%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Gonadal steroids regulate dendritic spine density in hippocampal pyramidal cells in adulthood.</a> Journal of Neuroscience. 10 (4), 1286-1291 (1990).</li>
<li>Woolley, C. S., Gould, E., Frankfurt, M., McEwen, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Naturally+occurring+fluctuation+in+dendritic+spine+density+on+adult+hippocampal+pyramidal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Naturally occurring fluctuation in dendritic spine density on adult hippocampal pyramidal neurons.</a> Journal of Neuroscience. 10 (12), 4035-4039 (1990).</li>
<li>Frankfurt, M., Salas-Ramirez, K., Friedman, E., Luine, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cocaine+alters+dendritic+spine+density+in+cortical+and+subcortical+brain+regions+of+the+postpartum+and+virgin+female+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Synapse%22%5BJournal%5D)">Cocaine alters dendritic spine density in cortical and subcortical brain regions of the postpartum and virgin female rat.</a> Synapse. 65 (9), 955-961 (2011).</li>
<li>Frankfurt, M., Luine, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+evolving+role+of+dendritic+spines+and+memory%3A+Interaction%28s%29+with+estradiol%5BTitle%5D)+AND+%22Hormones+Behavior%22%5BJournal%5D)">The evolving role of dendritic spines and memory: Interaction(s) with estradiol.</a> Hormones Behavior. 74, 28-36 (2015).</li>
<li>Bowman, R. E., Luine, V., Khandaker, H., Villafane, J. J., Frankfurt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adolescent+bisphenol-A+exposure+decreases+dendritic+spine+density%3A+role+of+sex+and+age%5BTitle%5D)+AND+%22Synapse%22%5BJournal%5D)">Adolescent bisphenol-A exposure decreases dendritic spine density: role of sex and age.</a> Synapse. 68 (11), 498-507 (2014).</li>
<li>Bowman, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bisphenol-A+exposure+during+adolescence+leads+to+enduring+alterations+in+cognition+and+dendritic+spine+density+in+adult+male+and+female+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Hormones+Behavior%22%5BJournal%5D)">Bisphenol-A exposure during adolescence leads to enduring alterations in cognition and dendritic spine density in adult male and female rats.</a> Hormones Behavior. 69, 89-97 (2015).</li>
<li>Eilam-Stock, T., Serrano, P., Frankfurt, M., Luine, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bisphenol-A+impairs+memory+and+reduces+dendritic+spine+density+in+adult+male+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Behavioral+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Bisphenol-A impairs memory and reduces dendritic spine density in adult male rats.</a> Behavioral Neuroscience. 126 (1), 175-185 (2012).</li>
<li>Inagaki, T., Frankfurt, M., Luine, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estrogen-induced+memory+enhancements+are+blocked+by+acute+bisphenol+A+in+adult+female+rats%3A+role+of+dendritic+spines%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Estrogen-induced memory enhancements are blocked by acute bisphenol A in adult female rats: role of dendritic spines.</a> Endocrinology. 153 (7), 3357-3367 (2012).</li>
<li>Jacome, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gonadal+Hormones+Rapidly+Enhance+Spatial+Memory+and+Increase+Hippocampal+Spine+Density+in+Male+Rats%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Gonadal Hormones Rapidly Enhance Spatial Memory and Increase Hippocampal Spine Density in Male Rats.</a> Endocrinology. 157 (4), 1357-1362 (2016).</li>
<li>Frankfurt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bisphenol-A%3A+a+plastic+manufacturing+compound+disrupts+critical+brain+structures+and+impairs+memory%5BTitle%5D)+AND+%22Research+Features%22%5BJournal%5D)">Bisphenol-A: a plastic manufacturing compound disrupts critical brain structures and impairs memory.</a> Research Features. , https://researchfeatures.com/wp-content/uploads/2021/05/Maya-Frankfurt.pdf (2021).</li>
<li>Wallace, M., Luine, V., Arellanos, A., Frankfurt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ovariectomized+rats+show+decreased+recognition+memory+and+spine+density+in+the+hippocampus+and+prefrontal+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Ovariectomized rats show decreased recognition memory and spine density in the hippocampus and prefrontal cortex.</a> Brain Research. 1126 (1), 176-182 (2006).</li>
<li>Wallace, M., Frankfurt, M., Arellanos, A., Inagaki, T., Luine, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+recognition+memory+and+decreased+prefrontal+cortex+spine+density+in+aged+female+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+New+York+Academy+of+Science%22%5BJournal%5D)">Impaired recognition memory and decreased prefrontal cortex spine density in aged female rats.</a> Annals of the New York Academy of Science. 1097, 54-57 (2007).</li>
<li>Bowman, R. E., Hagedorn, J., Madden, E., Frankfurt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+adolescent+Bisphenol-A+exposure+on+memory+and+spine+density+in+ovariectomized+female+rats%3A+Adolescence+vs+adulthood%5BTitle%5D)+AND+%22Hormones+Behavior%22%5BJournal%5D)">Effects of adolescent Bisphenol-A exposure on memory and spine density in ovariectomized female rats: Adolescence vs adulthood.</a> Hormones Behavior. 107, 26-34 (2019).</li>
<li>Novaes, L. S., Dos Santos, N. B., Perfetto, J. G., Goosens, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environmental+enrichment+prevents+acute+restraint+stress-induced+anxiety-related+behavior+but+not+changes+in+basolateral+amygdala+spine+density%5BTitle%5D)+AND+%22Psychoneuroendocrinology%22%5BJournal%5D)">Environmental enrichment prevents acute restraint stress-induced anxiety-related behavior but not changes in basolateral amygdala spine density.</a> Psychoneuroendocrinology. 98, 6-10 (2018).</li>
<li>Trzesniewski, J., Altmann, S., Jäger, L., Kapfhammer, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+Purkinje+cell+size+is+compatible+with+near+normal+morphology+and+function+of+the+cerebellar+cortex+in+a+mouse+model+of+spinocerebellar+ataxia%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Neurology%22%5BJournal%5D)">Reduced Purkinje cell size is compatible with near normal morphology and function of the cerebellar cortex in a mouse model of spinocerebellar ataxia.</a> Experimental Neurology. 311, 205-212 (2019).</li>
<li>Zemmar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligodendrocyte-+and+Neuron-Specific+Nogo-A+Restrict+Dendritic+Branching+and+Spine+Density+in+the+Adult+Mouse+Motor+Cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebral+Cortex%22%5BJournal%5D)">Oligodendrocyte- and Neuron-Specific Nogo-A Restrict Dendritic Branching and Spine Density in the Adult Mouse Motor Cortex.</a> Cerebral Cortex. 28 (6), 2109-2117 (2018).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

O presente protocolo descreve um método de impregnação de Golgi que permite o processamento simultâneo rápido de muitas seções. É uma melhoria em relação aos5 métodos mais intensivos em mão-de-obra e produz consistentemente neurônios impregnados para análise. Além disso, há menos exposição a produtos químicos tóxicos usados na impregnação de Golgi. A parte mais desafiadora do processo é fazer com que as seções sejam planas nos slides, o que requer uma prática considerável. Manter tudo o mais frio ...

O método de uso de dicromato de potássio e nitrato de prata para rotular neurônios foi descrito pela primeira vez por Camillo Golgi 1,2 e posteriormente usado por Santiago Ramon y Cajal para produzir um imenso corpo de trabalho diferenciando subtipos neuronais e gliais. Um livro recentemente publicado com suas ilustrações está agora disponível3. Após os estudos de Ramon e Cajal, publicados há mais de 100 anos, pouco golgi impregnação foi utilizada. A impregnação de Golgi é um processo trabalhoso que permite a visualização tridimensional de neurônios com um microscópio leve. Houve inúmeras modificações do método Golgi ao longo dos anos para facilitar o método e a coloração mais consistente4. Em 1984, Gabbott e Somogyi5 descreveram o procedimento de impregnação da seção única golgi que permitiu um processamento mais rápido. Este método de impregnação golgi requer perfusão com 4% de paraformaldeído e 1,5% de ácido picrico, pós-fixação seguida de vibratome seção em um banho de 3% de dicroma de potássio. As seções são montadas em lâminas de vidro, os quatro cantos de tampas colados de modo que, quando imersos em nitrato de prata, a difusão é gradual. As manchas são então retiradas, as seções são desidratadas e, eventualmente, cobrem o deslizamento permanentemente com o meio de montagem. Esta técnica foi usada com sucesso para rotular neurônios e glia 6,7,8 no hipocampo. O método golgi rápido descrito aqui é uma melhoria porque há muito menos exposição tanto ao dicromato de potássio quanto ao nitrato de prata e não são utilizados paraformaldeído e ácido picrico. Além disso, embora as células que foram impregnadas usando modificações do método Gabbott e Somogyi5 pudessem ser analisadas, muitas vezes as seções estavam sobreexe ou sub-expostas ou caíram dos slides durante a etapa de desidratação e, geralmente, vários experimentos tinham que ser agrupados para ter células suficientes para análise.
O presente protocolo descreve o uso do kit de coloração golgi (ver Tabela de materiais) para rotular dendritos e colunas dendríticas no hipocampo e córtex pré-frontal medial (mPFC) do rato. As vantagens desse método em relação aos anteriores são que ele é rápido, há menos exposição a produtos químicos nocivos para o pesquisador e há uma coloração consistente de neurônios. O protocolo descrito abaixo tem sido usado com pequenas modificações para avaliar a densidade da coluna vertebral dendrítica no hipocampo e mPFC do rato em muitos estudos 9,10,11,12,13,14,15.

<table><tbody><tr><td>Bandejas de lâminas de papelão</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-587-10</td><td></td></tr><tr><td>Lamínulas 24 x 60mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-M</td><td></td></tr><tr><td>FD Rapid GolgiKit de manchas</td><td>FD Neurotechnologies</td><td>PK 401</td><td>Estável em RT no escuro por meses; Kit de coloração Golgi</td></tr><tr><td>Spray de congelamento</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-022524</td><td></td></tr><tr><td>HISTO-CLEAR</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-899-90147</td><td>agente de limpeza</td></tr><tr><td>NCSS Software</td><td>Kaysville, UT, EUA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Permount</td><td>Fisher Scientific</td><td>SP-15-100</td><td>meio de montagem</td></tr><tr><td>Superfrost Plus Lâminas de microscópio</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Tissue Tek CTYO OCT Compound</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-373-65</td><td>Usado para montar cérebros no mandril de criostato</td></tr></tbody></table>

mancha rápida de golgi para visualização da coluna dendrítica no hipocampo e córtex pré-frontal

Rapid Golgi Stain for Dendritic Spine Visualization in Hippocampus and Prefrontal Cortex

A impregnação de Golgi, utilizando o kit de coloração golgi com pequenas adaptações, é usada para impregnar espinhas dendríticas no hipocampo de ratos e córtex pré-frontal medial. Esta técnica é uma melhoria acentuada em relação aos métodos anteriores de impregnação de Golgi porque os produtos químicos pré-selecionados são mais seguros de usar, os neurônios são consistentemente bem impregnados, há muito menos detritos de fundo, e para uma determinada região, há desvios extremamente pequenos na densidade da coluna vertebral entre experimentos. Além disso, os cérebros podem ser acumulados após um certo ponto e mantidos congelados até um processamento mais aprofundado. Usando este método qualquer região de interesse cerebral pode ser estudada. Uma vez manchada e coberta escorregada, a densidade da coluna vertebral dendrítica é determinada contando o número de espinhas para um comprimento de dendrito e expressa como densidade da coluna vertebral por dendrito de 10 μm.

Usando o método Golgi rápido, as células são consistentemente bem impregnadas para que haja muitas células para analisar. Trata-se de uma melhoria acentuada em relação aos métodos anteriores, onde os experimentos tiveram que ser agrupados para ter dados suficientes para análise. Portanto, mais amostras podem ser processadas de uma só vez e cérebros podem ser armazenados congelados até o processamento. Exemplos de células impregnadas de Golgi na região ca1 do hipocampo são mostrados em baixa e alta potência na <strong cla...

O protocolo descreve uma modificação do método golgi rápido, que pode ser adaptado a qualquer parte do sistema nervoso, para colorir neurônios no hipocampo e córtex pré-frontal medial do rato.

Mancha rápida de Golgi para Visualização da Coluna Dendrítica no Hipocampo e Córtex Pré-Frontal

Golgi impregnation, using the Golgi staining kit with minor adaptations, is used to impregnate dendritic spines in the rat hippocampus and medial ...

Embora relativamente simples, a técnica de impregnação de Golgi tem alguns passos complicados e a falha em fazê-las corretamente resulta em células que são impróprias para análise. Esta técnica fornece rotulagem rápida e reprodutível de neurônios impregnados de Golgi. Além disso, o pequeno erro padrão da média permite a comparação entre experimentos.A parte mais desafiadora sobre esta técnica é cortar as seções de criostat, porque há uma consistência e fixação incomuns, e, portanto, levá-las no slide flat é um pouco de um desafio que requer prática. Primeiro, coloque uma pequena quantidade de tecido médio em um mandril criostat pré-frio. Monte os blocos cerebrais em mandris criostates descongelando um lado do bloco ligeiramente em uma mão enluvada e colocando-o no meio de tecido.Use um spray de congelamento na faca e no bloco. Use a placa anti-rolo ou a escova para manter a seção plana durante o corte. Corte seções de 100 micrômetros em um criostat a menos 22 graus Celsius.Degelo montar, se possível, usando um slide de temperatura ambiente e rapidamente se opor a ele para a seção. Alternativamente, mantenha slides no criostat, então eles estão congelando. Transfira a seção com fórceps frios ou uma escova de tinta fria e, em seguida, descongele a montagem.Monte três a quatro seções coronais em subsídios. Limpe a faca com lenços de papel entre as fatias. Se a faca precisar de mais limpeza, use 100% de etanol e seque antes de cortar a próxima fatia.Coloque slides em racks, espaçados o suficiente para permitir o acesso à solução às seções. Coloque seções em água destilada duas vezes por quatro minutos antes de colocá-las na solução de impregnação de Golgi por 10 minutos. Separe os deslizamentos de cobertura para garantir que apenas um deslizamento de cobertura seja colocado nas seções.Cubra os slides de vidro com uma quantidade generosa de meio de montagem antes de colocar um deslizamento de tampa de vidro no slide. Uma vez que a tampa escorregou, lâminas secas sinalizadas em qualquer papel não poroso por três a cinco dias, movendo-os ligeiramente, especialmente após o primeiro dia para evitar furar. Posteriormente transfira os slides para porta-slides e, idealmente, deslizes secos por pelo menos três semanas antes de examiná-los.Para analisar a densidade da coluna vertebral dendrítica em neurônios piramidários tanto do córtex pré-frontal medial quanto da região ca1 do hipocampo, meça o comprimento dendrático utilizando-se no programa de análise de imagem. Conte as espinhas dos dendritos usando um contador de mãos e registe o comprimento e o número de lombadas. Para análise, escolha neurônios com corpos celulares e dendritos enquanto impregnados, e dendritos que sejam contínuos e distinguíveis das células adjacentes.A figura mostra exemplos de células impregnadas de Golgi na região do CA1 do hipocampo é mostrado em baixa e alta potência. A figura ilustra um experimento no qual a densidade da coluna dendrítica basal foi aumentada em células piramidas em ratos adolescentes machos e fêmeas após enriquecimento ambiental em CA1 e o córtex pré-frontal medial. É desafiador manter as seções frias o suficiente ao cortar e usamos uma grande quantidade de spray de congelamento para fazer isso.E, posteriormente, é difícil colocar as seções nos slides e tê-las secas. Esta técnica é usada para examinar características neuroanatomômicas. Pode ser usado sozinho ou em combinação com outros métodos de rastreamento neuroanatomômico.

rapid-golgi-stain-for-dendritic-spine-visualization-hippocampus

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

FRAP tem sido utilizada para quantificar a mobilidade de proteína de fluorescência verde (GFP) marcadas proteínas em células em cultura. Examinamos as frações móveis / imóveis da GFP, analisando o percentual de recuperação de fluorescência após a fotodegradação. Neste estudo, foi realizada na FRAP espinhas de neurônios do hipocampo.

Recuperação de fluorescência Após Fotodegradação (FRAP) de fluorescência Proteínas Tagged em espinhas dendríticas dos neurônios do hipocampo Cultivadas

Numerosos estudos recentes identificaram mutações em proteínas sinápticas associada a patologias cerebrais. Primários cultivados neurônios corticais oferecem grande flexibilidade para examinar os efeitos destas proteínas doenças associadas na morfologia e motilidade espinha dendrítica.

Análise de Morfologia Spine dendríticas em neurônios cultivados CNS

Fonte: McLeod, F., et al. Avaliação da densidade de sinapses em fatias de cérebro de roedores hipocampais. J. Vis. Exp. (2017). Este vídeo demonstra um método para visualizar marcadores sinápticos em fatias cerebrais do hipocampo usando análise de imunofluorescência confocal. As fatias são imunomarcadas com anticorpos primários direcionados a marcadores pré-sinápticos e pós-sinápticos, seguidos por anticorpos secundários conjugados com fluoróforo. Os marcadores marcados são então visualizados...

Análise microscópica de sinapses em fatias de hipocampo de camundongos usando imunofluorescência

A localização e distribuição das proteínas fornecem informações importantes para a compreensão de suas funções celulares. A resolução espacial superior, de microscopia electrónica (ME) pode ser usado para determinar a localização subcelular de um dado antigénio imuno sequência. Para tecidos do sistema nervoso central (SNC), preservando a integridade estrutural durante a antigenicidade manutenção tem sido particularmente difícil em estudos de EM. Aqui, adoptar um procedimento que tem sido...

Pós-incorporação de Etiquetagem immunogold de proteínas sinápticas em culturas de hipocampo

Este documento descreve os procedimentos para a estimulação tátil de filhotes de ratos e posterior coloração de Golgi-Cox da morfologia neuronal. A estimulação tátil é uma experiência positiva que é administrada no período perinatal por acariciar filhotes com um espanador doméstico. Coloração de Golgi-cox é um processo fiável que permite a visualização dos neurónios inteiras.

Visualizar os Efeitos de uma experiência precoce positiva, Tátil Estimulação, em dendríticas Morfologia e Synaptic conectividade com Golgi-Cox Coloração

Este artigo descreve um protocolo de trabalho de imagem espinhas dendríticas dos neurônios do hipocampo in vitro utilizando Structured Illumination Microscopy (SIM). Microscopia Super-resolução usando SIM oferece resolução de imagem significativamente além do limite de difração da luz em todas as três dimensões espaciais, permitindo que a imagem de espinhas dendríticas individuais com maior pormenor.

Imagiologia espinhas dendríticas dos neurônios do hipocampo de rato primária usando Structured Illumination Microscopy

Descrevemos dois métodos para visualização e quantificação da arborização dendrítica no hipocampo de modelos de camundongos: imagens em tempo real e de profundidade de campo estendida. Enquanto o primeiro método permite um rastreamento topográfico sofisticado e a quantificação da extensão da ramificação, o último permite a visualização rápida da árvore dendrítica.

Avaliação de dendríticas Arborização no giro dentado do hipocampo em Ratos Região

Apresenta-se um protocolo para a utilização do método de coloração de Golgi-Cox em secções do cérebro de espessura, a fim de visualizar os neurónios com árvores dendriticas longos contidos dentro de amostras de tecidos individuais. Duas variantes deste protocolo são também apresentados que envolvem cresilo contracoloração violeta, e a congelação dos cérebros não transformadas, para o armazenamento a longo prazo.

Neurônios de imagem dentro de seções do cérebro grossas usando o método de Golgi-Cox

Aqui apresentamos um protocolo Golgi-Cox com detalhes detalhados. Este método de mancha de tecido confiável permite uma avaliação de alta qualidade da citoarquitetura no hipocampo e em todo o cérebro, com solução de problemas mínima.

Avaliação da complexidade dendrítica do hipocampo em ratos idosos usando o método de Golgi-Cox

A Microscopia eletrônica de varredura de blocos de blocos serial (SBEM) é aplicada à imagem e análise de colunas dendríticas no hipocampo murino.

Microscopia eletrônica de varredura de blocos de bloco serial (SBEM) para o estudo de espinhas dendríticas

Aprenda a técnica de impregnação rápida de Golgi para visualização de neurônios no hipocampo e córtex pré-frontal de ratos. Este método permite analisar a densidade de espinhos dendríticos e a morfologia neuronal com alta reprodutibilidade.

Mancha rápida de Golgi para Visualização da Coluna Dendrítica no Hipocampo e Córtex Pré-Frontal

Explorar mais vídeos