Name: Remoção de um local de início de tradução interna do mRNA enquanto retém a expressão da proteína de comprimento completo (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-16T13:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 48 s
Description: Aprenda a genotipar mutações pontuais no gene Gja1 de camundongos usando PCR e enzimas de restrição. Este método eficiente identifica o alelo M213L que produz Connexin43 completo sem a isoforma GJA1-20k.

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O projeto foi apoiado pelos Institutos Nacionais de Saúde (R01HL152691, R01HL138577 e R01HL159983) à RMS.

Todos os protocolos de cuidados e estudos para animais foram aprovados pelos Comitês Institucionais de Cuidados e Uso de Animais do Cedars-Sinai Medical Center e da Universidade de Utah. Camundongos fêmeas C57BL/6J obtidos de fontes comerciais com 8-9 semanas de idade (ver Tabela de Materiais) foram utilizados para os experimentos.
1. Preparação para direcionamento genético
<ol><li>Selecione a sequência de destino guia em torno do site de mutação alvo codificando M213 usando o algoritmo web CRISPOR 4,9,10 (ver Tabela de Materiais). NOTA: Uma sequência de guia de 20 bases (ATTCAGAGCGAGACACCA), no fio oposto da sequência de codificação GJA1, com uma pontuação do MIT11 de 62 foi selecionada na qual o potencial local de decote está localizado após 16 bases a jusante do códon a ser mutado (ATG) (Figura 1; toda a sequência de crRNA é mostrada na Tabela 1).</li>
	<li>Sintetizar o crRNA e tracrRNA que interagem com o Cas9 como guia RNA12. NOTA: Embora a pontuação do MIT do RNA guia seja de 62, há apenas uma mutação potencial fora do alvo com quatro incompatibilidades a mais de 12 bases do PAM. Portanto, este guia RNA é considerado seguro.</li>
	<li>Projetar um oligo doador complementar à sequência guia para introduzir uma única substituição de aminoácido (ATG para TTA; M213L) com 60 e 48 bases de armas de ílogo nos lados de 5'e 3', respectivamente. NOTA: Este oligo doador inclui uma mutação pontual para interrupção do PAM (AGG to ACG) introduzindo uma mutação silenciosa (TCC to TCG; S217S) para evitar a reeditação após o reparo direcionado à bralogia crispr (HDR)13 para a introdução das mutações pretendidas (Figura 1 e Tabela 1).</li>
	<li>Use NaCl (concentração final de 200 mM) para precipitar 10 μg de oligos para minimizar o transporte de sal em tampão de microinjeção pronuclear (10 mM de Tris-HCl, pH 7,5; 0,1 mM de EDTA, e 100 mM de NaCl sem espermatozoide e espermidina14). NOTA: Não lave a pelota de DNA com 70% de etanol, pois a pelota pode ser dissolvida na solução.</li>
	<li>Misture 50 ng/μL de oligo doador, 60 ng/μL de mistura de crRNA/tracrRNA (razão molar 1:1) (a partir da etapa 1,2) e 50 ng/μL de proteína eSpCas9 (ver Tabela de Materiais) para fazer mistura CRISPR no volume final 20 μL (Tabela 2). Diminua a concentração do oligo doador se for observada alta toxicidade (por exemplo, 25 ng/μL).</li>
</ol>2. Indução de superovulação, colheita de ovos, microinjeção pronuclear de mistura CRISPR e triagem de blastocisto
NOTA: Este procedimento segue um protocolo geral publicado anteriormente14.
<ol><li>Injete 5 UI de PMSG (gonadotropina soro da égua grávida) (ver Tabela de Materiais) em 100 μL de água estéril a 5-10 camundongos com 8 semanas de idade por uma abordagem intraperitoneal por volta das 3:00 p.m. (dia 1).</li>
	<li>Injete 5 UI de hCG (gonadotropina coriônica humana) (ver Tabela de Materiais) em 100 μL de água estéril aos doadores de óvulos por uma abordagem intraperitoneal 46-48 h após a injeção de PMSG (dia 3). Configurar 1:1 reprodução com machos garanhão.</li>
	<li>Colher ovos fertilizados em m2 médio com hialuronidase, lavar três vezes em 100 μL de m2 médio por volta das 10:00 a.m., em seguida, manter em mWM15 ou KSOM16 médio (dia 4) (ver Tabela de Materiais).</li>
	<li>Introduza a mistura CRISPR (passo 1.3) em embriões de estágio 1 colhidos dos camundongos pela microinjeção pronuclear14 em 100 μL de M2 coberto com óleo de parafina em um prato plástico em um microscópio invertido com uma óptica que melhora o contraste no início da tarde (Vídeo 1). NOTA: A microinjeção pronuclear da mistura CRISPR foi realizada em embriões de estágio de 1 células em 14-16 h póscoitum (p.c.). Os embriões injetados foram cultivados em uma incubadora de CO2 de 5% por algumas horas e transferidos cirurgicamente a 18-20 h p.c. para camundongos receptores ICR que tinham um plugue de copulação na mesma manhã.</li>
	<li>Transfira 20-30 embriões de 2 células para cada receptor para produzir animais recombinantes. NOTA: Siga o protocolo geral14 ou cultue os embriões no mWM ou no meio KSOM por 4 dias para validar a eficiência e examinar a toxicidade. A toxicidade da mistura CRISPR é aceitável quando pelo menos um terço dos embriões injetados chegam cedo ao estágio blastocisto totalmente expandido com múltiplos recombinantes entre eles. Ao mesmo tempo, mais de 90% dos embriões não domesticados atingem o mesmo estágio blastocisto em uma cultura paralela. Siga o passo 2.6-2.9 para a triagem do blastcyst que não é essencial, mas pode ser feito se preferir quantificar a taxa de sucesso do HDR.</li>
	<li>Captar individualmente blastocistos totalmente expandidos com 2 μL de meio de cultura usando uma ponta de pipeta fina plugada com uma micropipetter em tubos PCR únicos (dia 8; Vídeo 2).</li>
	<li>Blastocistos de lyse em 8 μL de mistura de digestão (mesmo que passo 3.2; ver Tabela de Materiais) e processo a 75 °C por 10 min, 95 °C por 5 min, depois esfrie até 4 °C para armazenamento. Use 2 μL do lysate como modelo para PCR em uma mistura total de 15 μL PCR (passo 3).</li>
	<li>Examine a eficácia do HDR por eletroforese de gel agarose17 das amostras pcr após a digestão de restrição com NlaIII (passo 3-5).</li>
	<li>Confirme o estado da recombinação direcionada sequenciando o amplicon17 de 668 bp nos fundadores e prole subsequente para confirmar a integridade da mutação.</li>
</ol>3. Extração de DNA
NOTA: Camundongos no pós-natal dia 10 foram usados para este experimento devido à morte súbita do rato nocaute GJA1-20k cerca de 2-4 semanas após o nascimento4. Um protocolo mais geral também pode ser aplicado após o relatório publicado anteriormente18.
<ol><li>Corte 1-3 mm do dedo do dedo ou da ponta da cauda com uma tesoura limpa e transfira-a para um tubo PCR de 0,2 mL de 8 Tiras. Para evitar contaminação entre as amostras do dedo do pé ou da cauda, use uma tesoura pré-limpa ou uma lâmina por mouse ou limpe antes de cada amostra usando 70% de etanol ou 10% de alvejante. Se a cauda sangrar após a amostragem, aplique uma breve pressão com gaze para parar o sangramento. Armazene as amostras da cauda a -20 °C até a extração por até cerca de uma semana.</li>
	<li>Adicione a solução de lise tecidual (ver Tabela de Materiais) em um tubo de 100 μL/e misture bem, seguido de spin-down com uma minicentrífuda de mesa (2.200 x g para 10 s à temperatura ambiente). Certifique-se de que as amostras da cauda estão submersas na solução.</li>
	<li>Coloque os tubos em um cicloviário térmico definido pelo programa a seguir; 75 °C para 10 min (lise tecidual), 95 °C para 5 min (inativação) e 4 °C (segurando). Armazene o tecido a 4 °C por até uma semana se os PCRs não puderem ser realizados imediatamente.</li>
</ol>4. Amplificação de DNA por PCR
<ol><li>Prepare uma solução PCR contendo 5 μL de H2O sem nuclease, 0,75 μL de 10 μM para frente e primers invertidos e 7,5 μL de mix mestre PCR (ver Tabela de Materiais) por amostra em novo tubo PCR (ver Tabela 1 para sequências de primer). Se houver várias amostras, dimensione o conteúdo para alíquota de 14 μL por tubo.</li>
	<li>Adicione 1 μL do tecido à solução PCR preparada na etapa 3.1. Tenha cuidado para não tocar na cauda.</li>
	<li>Misture bem e gire para baixo com uma mini centrífuga de mesa (2.200 x g para 10 s em temperatura ambiente).</li>
	<li>Coloque os tubos em um cicloviário térmico definido pelo programa abaixo mencionado. Armazene os produtos PCR a 4 °C por 1-2 meses ou ~1 ano a -20 °C. NOTA: 95 °C por 3 min (etapa 1, Denaturação inicial), 95 °C para 15 s (etapa 2, Denaturação), 60 °C para 15 s (etapa 2, Annealing), 72 °C para 45 s (etapa 2, Extensão), repetição do passo 2 para 35 ciclos, 72 °C para 10 min (etapa 3, Extensão Final) e 4 °C (etapa 4, Holding).</li>
</ol>5. Incubação com enzima de restrição
<ol><li>Prepare a solução enzimápica contendo 7 μL de H2O sem nuclease, 2 μL de tampão CutSmart de 10x e 1 μL de enzima de restrição NlaIII (ver Tabela de Materiais). Se houver várias amostras, multiplique cada conteúdo para fazer a mistura e alíquota de 10 μL por tubo.</li>
	<li>Adicione 10 μL de produto PCR obtido na etapa 3 à solução enzimápica por tubo.</li>
	<li>Misture bem e gire para baixo com uma mini centrífuga de mesa (2.200 x g para 10 s em temperatura ambiente).</li>
	<li>Coloque os tubos em um cicloviário térmico ou bloco de calor definido pelo programa abaixo mencionado. Armazene o produto após a incubação a 4 °C por 1-2 meses ou ~1 ano a -20 °C. NOTA: 37 °C para 16 h (pelo menos 2 h; tempo curto de incubação pode resultar em decote insuficiente) e 4 °C para realização.</li>
</ol>6. Detecção de banda de DNA
<ol><li>Prepare um gel de 1,5% de agarose contendo mancha de gel de DNA para eletroforese.<ol>
<li>Adicione 0,75 g de agarose em 50 mL de tampão TAE 1x seguido de mistura e calor no micro-ondas até que a agarose se dissolva completamente. Depois de esfriar, adicione 5 μL de mancha de DNA e misture suavemente.</li>
		<li>Despeje no molde de gel (25 mL por molde) e deixe o gel solidificar. Para obter melhor resolução e separação, aumente a concentração de ágarose para 2,5%-4% conforme necessário.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Carregue 10 μL do produto PCR digerido até o poço. Misture 6x tampão de carregamento, se necessário.</li>
	<li>Execute o gel com 100 V por 35 min. NOTA: Esses parâmetros podem precisar de otimização.</li>
	<li>Imagem sob luz UV (comprimento de onda de 302 nm).</li>
</ol>

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<li>Basheer, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GJA1-20k+arranges+actin+to+guide+Cx43+delivery+to+cardiac+intercalated+discs%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">GJA1-20k arranges actin to guide Cx43 delivery to cardiac intercalated discs.</a> Circulation Research. 121 (9), 1069-1080 (2017).</li>
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</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Um modelo de rato modificado por genes é uma abordagem comum para entender a função genética. No entanto, uma vez que o isoform traduzido internamente GJA1-20k é traduzido do mesmo Gja1 mRNA como Cx43 de comprimento completo, uma estratégia criativa foi concebida para manter a expressão Cx43 de comprimento completo, mas suprimir a expressão GJA1-20k. A abordagem é baseada em uma mutação do códon inicial interno de GJA1-20k. Com uma mutação de um único ponto, M213 foi trocado para L em Gja1 mRNA, que con...

O Connexin 43 (Cx43) e o isoforme truncado N-terminus, GJA1-20k, codificados pelo mesmo GJA1 mRNA, mas utilizam códons de início diferentes1 para iniciar a tradução. A tradução Cx43 ocorre no primeiro códon de início de AUG, enquanto a tradução GJA1-20k inicia-se no AUG no resíduo 213. Foi previamente constatado que o GJA1-20k tem funções essenciais para o tráfico de Cx43 em comprimento total, estabilização de actin e regulação da morfologia mitocondrial in vitro 1,2,3.
Para entender o papel do GJA1-20k in vivo, foi gerado um modelo de mouse "knock-out" GJA1-20k que manteve a capacidade de criar Cx43 de comprimento completo. A abordagem foi utilizar o sistema CRISPR-Cas9 para substituir o resíduo único em 213 de uma methionina (M) a uma leucina (L) (Gja1M213L/M213L)4. Uma mutação interna de M a L diminui drasticamente a probabilidade de a tradução interna ocorrer, mas mantém a tradução e a função da proteína de comprimento total4. Como o tipo selvagem (WT) e o alelo mutado têm tamanhos idênticos e produtos mRNA quase idênticos, há uma dificuldade considerável em confirmar genótipo nos camundongos. O sequenciamento de DNA pode identificar a mutação, mas é muito caro e demorado para uso rotineiro. Em geral, vários métodos de genotipagem mais rápido foram estabelecidos, como reação de cadeia de polimerase em tempo real (RT-PCR), minisequenciamento-ligation, análise de fusão de alta resolução e sistema de mutação refratário tetra-primer PCR (ARMS-PCR)5,6,7,8. No entanto, esses métodos alternativos requerem múltiplas etapas, recursos exclusivos e/ou vários conjuntos de primer específicos que podem induzir produtos PCR não específicos.
Este protocolo introduz uma abordagem detalhada de segmentação e edição de genes pelo CRISPR-Cas9 para criar uma única mutação de aminoácidos, e genotipagem rápida é apresentada para confirmar a mutação. A identificação do genótipo envolve o uso criativo de enzimas de restrição utilizando apenas um único conjunto de primers para identificar o gene alvo. Os leitores são encaminhados à Referência4 para observar o profundo efeito eletrofisiológico da morte cardíaca súbita causada por uma mutação de substituição Gja1M213L/M213L que ainda gera proteína de comprimento total e não consegue gerar uma isoforma de truncação ingenuamente traduzida internamente menor. Este protocolo ajudará a fazer com que outros modelos de camundongos usem uma mutação pontual para diminuir a tradução interna de uma isoforme de interesse, mantendo a expressão da proteína endógena de comprimento total.

<table><tbody><tr><td>Tubo de PCR de 8 tiras de 0,2 mL</td><td>Thomas Scientific</td><td>1148A28</td><td></td></tr><tr><td>0,5 M EDTA pH 8,0</td><td>Invitrogen</td><td>15575-038</td><td>Para tampão de micorinjection pronuclear</td></tr><tr><td>10x CutSmart buffer</td><td>New England Biolabs</td><td>B7204S</td><td>Tampão de digestão para NlaIII</td></tr><tr><td>1 M Tris-HCl pH 7,5</td><td>Invitrogen</td><td>15567-027</td><td>Para tampão de micorinjection pronuclear</td></tr><tr><td>50x TAE Tampão</td><td>Invitrogen</td><td>24710-030</td><td></td></tr><tr><td>Termociclador de 96 poços</td><td>Applied Biosystems</td><td>Modelo # 9902</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9539</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6J</td><td>O Laboratório Jackson</td><td>664</td><td>cepa de camundongo</td></tr><tr><td>Chemidoc MP imaging system</td><td>Bio-rad</td><td></td><td>Para tirar a imagem do gel pela</td></tr><tr><td>proteína</td> <td>eSpCas9 de luz UV de 302 nmMilliporeSigma</td><td>ESPCAS9PRO-50UG</td><td></td></tr><tr><td>Gel Lading Dye Purple (6x)</td><td>New England Biolabs</td><td>B7024S</td><td>Tampão de carregamento para eletroforese</td></tr><tr><td>Luvas</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>hCG (gonadotrofina coriônica humana)</td><td>MilliporeSigma</td><td>23-073-425G</td><td></td></tr><tr><td>Hialuronidase</td><td>MilliporeSigma</td><td>H3884-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Image Lab software</td><td>Bio-rad</td><td></td><td>Para analisar a imagem</td></tr><tr><td>do gel Microscópio estéreo invertido com plasDIC</td><td>Zeiss</td><td>Axiovert A1</td><td></td></tr><tr><td>KAPA Kits de genotipagem de camundongos</td><td>Roche Diagnostics</td><td>KK7352</td><td>Para lise de tecidos ou células, extração de DNA e mistura mestre de PCR</td></tr><tr><td>KSOM</td><td>LifeGlobal</td><td>ZEKS-050</td><td>meio de cultura de embriões</td></tr><tr><td>Laboratório coart</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>M2 meio</td><td>MilliporeSigma</td><td>MR015D</td><td></td></tr><tr><td>NlaIII</td><td>New England Biolabs</td><td>R0125S</td><td>Para digerir o produto de PCR</td></tr><tr><td>Água Livre de Nuclease</td><td></td><td>Ambion AM9937</td><td>Para diluir reagentes</td></tr><tr><td>Óleo de parafina</td><td>Nacalai EUA</td><td>2613785</td><td></td></tr><tr><td>Plugged 20 &mu; L ponta de pipeta fina</td><td>FisherScientific</td><td>02-707-171</td><td>Para pegar blastócitos</td></tr><tr><td>PMSG (égua grávida' s gonadotrofina sérica)</td> <td>ProSpec-Tany</td><td>HOR-272</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de sódio</td><td>Invitrogen</td><td>AM9760G</td><td>Para tampão de micorinjection pronuclear</td></tr><tr><td>SYBR Safe DNA Gel Stain</td><td>Invitrogen</td><td>S33102</td><td>Para detectar bandas em gel</td></tr><tr><td>tracrRNA</td><td>Dharmacon</td><td>U-002000-120</td><td>Guid RNA</td></tr></tbody></table>

remoção de um local de início de tradução interna do mrna enquanto retém a expressão da proteína de comprimento completo

Removal of an Internal Translational Start Site from mRNA While Retaining Expression of the Full-Length Protein

O sistema de edição de genes CRISPR-Cas9, baseado em mecanismos de reparação de genomas, permite a geração de modelos de camundongos modificados por genes de forma mais rápida e fácil em relação à recombinação homologous tradicional. O sistema CRISPR-Cas9 é particularmente atraente quando uma mutação de um ponto é desejada. A proteína de junção de lacunas, Connexin 43 (Cx43), é codificada pelo gene Gja1, que tem um único exon de codificação e não pode ser emendado. No entanto, Gja1 produz não apenas proteína Cx43 de comprimento completo, mas até seis isoformas truncados N-terminus por um processo conhecido como tradução interna, o resultado da iniciação da tradução ribossômica em locais de partida internos de AUG (Methionine). GJA1-20k é o isóforme truncado mais comumente gerado do Cx43 iniciado no codon AUG na posição 213 de Gja1 mRNA. Como o resíduo 213 ocorre no final do último domínio transmembrano de Cx43, GJA1-20k é efetivamente a cauda C-terminus de 20 kDa C de Cx43 como uma proteína independente. Investigadores anteriores identificaram, em células, que um papel crítico do GJA1-20k é facilitar o tráfico de hemicanais de junção de lacunas Cx43 de comprimento completo à membrana plasmática. Para examinar esse fenômeno in vivo, foi gerado um rato mutante com mutação de ponto Gja1 que substitui o ATG (Methionine) no resíduo 213 por TTA (leucemia, mutação M213L). O resultado do M213L é que Gja1 mRNA e Cx43 de comprimento completo ainda são gerados, mas a tradução de Gja1-20k é significativamente reduzida. Este relatório se concentra na escolha do local da enzima de restrição para desenvolver um modelo de mouse de um aminoácido mutado (Gja1M213L/M213L). Este protocolo descreve camundongos geneticamente modificados pelo sistema CRISPR-Cas9 e genotipagem rápida combinando tratamentos de PCR e enzimas de restrição.

O sistema de edição de genes CRISPR/Cas9 produz uma mutação ATG para TTA e uma mutação silenciosa de TCC para TCG entre 56.264.279 a 56.264.281 e de 56.264.291 a 56.264.293 no cromossomo do rato 10, ou em 869 a 871 e 881 a 883 em Gja1 mRNA, respectivamente. Essa mutação resulta em uma mutação de Methionina 213 a Leucina (M213L) na proteína GJA1 e a mutação TTC para TTG interrompe uma sequência PAM próxima para evitar edição genética indesejada (Figura 1). Os detalhes da mutação estão descrit...

O presente protocolo descreve uma única mutação M213L em Gja1 que retém a geração Connexin43 em comprimento completo, mas impede a tradução do isoforme traduzido internamente GJA1-20k.

Remoção de um local de início de tradução interna do mRNA enquanto retém a expressão da proteína de comprimento completo

The CRISPR-Cas9 gene-editing system, based on genome repair mechanisms, enables the generation of gene-modified mouse models more quickly and easily ...

A dificuldade com uma única substituição de resíduo é genotipar animais de forma eficiente, apesar da diferença no único resíduo. O uso especial de uma enzima de restrição adiciona apenas um passo único, rápido e de baixo custo ao genotipagem típico baseado em PCR. Este protocolo pode ser aplicado a qualquer outro modelo de mouse com um ponto de mutação se a sequência de destino for reconhecida por uma enzima de restrição, que geralmente é o caso.Corte de um a três milímetros da ponta da cauda com uma tesoura limpa e transfira-a para um tubo PCR de oito tiras de 0,2 mililitro. Depois de conter a amostra de cauda como descrito no manuscrito, armazene-a a T-menos 20 graus Celsius até a extração, até cerca de uma semana. Adicione 100 microliters de solução de lise tecidual por tubo e misture bem, seguido de spin-down usando uma minicentrifuagem de mesa a 2.200 vezes G por 10 segundos à temperatura ambiente.Certifique-se de que as amostras da cauda estão submersas na solução. Coloque os tubos em um cicloviário térmico, programando os parâmetros para lise tecidual, inativação e retenção. Armazene o tecido a quatro graus Celsius por até uma semana se o PCR não puder ser realizado imediatamente.Prepare uma solução PCR contendo cinco microlitros de água sem nuclease, 0,75 microlitros de primers avançados e reversos de 10 micromolares e 7,5 microlitros de mix mestre PCR por amostra em um novo tubo PCR. Adicione um microliter do tecido previamente preparado à solução PCR. Misture bem a solução PCR e gire para baixo com uma minicentrifugação de mesa a 2.200 vezes G durante 10 segundos à temperatura ambiente.Coloque os tubos em um ciclo térmico programado. Uma vez concluída a reação, armazene os produtos PCR a quatro graus Celsius por um a dois meses ou aproximadamente um ano a menos 20 graus Celsius. Prepare a solução enzimada contendo sete microlitrais de água sem nuclease, dois microliters de buffer CutSmart com força de 10X e um microliter de enzima de restrição NlaIII.Se houver várias amostras, multiplique cada conteúdo para fazer a mistura e alíquota de 10 microliters por tubo. Adicione 10 microliters de produto PCR previamente obtidos à solução enzimápica por tubo. Misture bem e gire para baixo com o minicentrifuge de mesa como demonstrado anteriormente.Coloque os tubos em um ciclo de calor programado ou bloqueio térmico. Armazene o produto após a incubação em condições frias. Adicione 0,75 gramas de agarose em 50 mililitros de tampão TAE de força única.Misture e aqueça a agarose no micro-ondas até dissolver completamente. Depois de esfriá-lo, adicione cinco microliters de mancha de DNA e misture suavemente. Despeje 25 mililitros do gel de agarose no molde de gel e deixe o gel solidificar.Carregue 10 microliters do produto PCR digerido para o poço. Execute o gel com 100 volts por 35 minutos. Imagem do gel agarose sob luz ultravioleta.A eletroforese agarose realizada utilizando o produto PCR digerido resultou em várias faixas de tamanhos diferentes em cada genótipo, com duas bandas em tipo selvagem, três em heterozigous e uma em homozigos, respectivamente. A injeção de teste com análise blastocisto resultou em uma taxa de sucesso de 76,9% na injeção de 50 nanogramas por microliter dos oligos doadores, e uma taxa de sucesso de 25% na injeção de 25 nanogramas por microliter dos mesmos oligos doadores, respectivamente. Finalmente, injetar 50 nanogramas por microliter dos oligos doadores com precipitação de etanol obteve animais fundadores com uma taxa de sucesso de 50%.A purificação de doadores de oligo por precipitação de etanol reduziu a toxicidade, mantendo alta eficiência de edição de genomas. O manuseio cuidadoso e a adição de uma baixa quantidade de reagentes é muito importante. Certifique-se de que eles são adicionados corretamente e são bem misturados.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Um grande impedimento para análises bioquímicas dos ribossomos contendo nascente peptidil-tRNAs foi a presença de ribossomos outros nas mesmas amostras, os ribossomos não estão envolvidos na tradução da seqüência de mRNA específico que está sendo analisado. Nós desenvolvemos uma metodologia simples para purificar, exclusivamente, os ribossomos que contém a nascente peptidil-tRNA de interesse.

Isolamento de Ribossomos Traduzindo Contendo peptidil-tRNAs para análises funcionais e estruturais

Uma técnica para identificar locais de pausa de translação sobre mRNA é descrito. Este procedimento é baseado no isolamento de polipéptidos nascentes que se acumulam nos ribossomas durante in vitro tradução de um ARNm alvo, seguido de análise de tamanho das cadeias nascentes utilizando uma electroforese em gel de desnaturação.

Isolamento de Ribossomos ligados a polipeptídeos nascentes<em&gt; In vitro</em&gt; Identificar Sites Pausa translacionais Junto mRNA

Descrevemos aqui uma técnica que é rotineiramente usado para isolar estavelmente ligados ribossomo complexos da cadeia nascente (RNC). Esta técnica aproveita a descoberta de que um jovem de 17 aminoácidos longo SECM "seqüência de prisão" pode parar de alongamento de tradução em uma procariótica...

Usando Seqüência de Detenção SECM como uma ferramenta para isolar Ribossomos Polipeptídeos encadernados

Descrevemos aqui um método para visualizar retículo endoplasmático associadas mRNAs em células de cultura de mamífero de tecidos. Esta técnica envolve a permeabilização selectiva da membrana plasmática com digitonina para remover conteúdo citoplasmático seguido...

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Muitos mRNAs que codificam as proteínas mitocondriais são associados com a membrana exterior mitocondrial. Descreve-se um processo de fracionamento subcelular que visa o isolamento de mitocôndrias de levedura com seus mRNAs e ribossomos associados. Este protocolo pode ser aplicado a células cultivadas sob diversas condições, a fim de revelar os mecanismos de localização de mRNA e tradução localizada perto das mitocôndrias.

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Este manuscrito descreve um método para visualizar e quantificar eventos tradução localizada em compartimentos subcellular. A abordagem proposta neste manuscrito requer um sistema básico de imagens confocal e reagentes e é rápido e econômico.

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