Remoção de um local de início de tradução interna do mRNA enquanto retém a expressão da proteína de comprimento completo
16 de março de 2022
O presente protocolo descreve uma única mutação M213L em Gja1 que retém a geração Connexin43 em comprimento completo, mas impede a tradução do isoforme traduzido internamente GJA1-20k.
A dificuldade com uma única substituição de resíduo é genotipar animais de forma eficiente, apesar da diferença no único resíduo. O uso especial de uma enzima de restrição adiciona apenas um passo único, rápido e de baixo custo ao genotipagem típico baseado em PCR. Este protocolo pode ser aplicado a qualquer outro modelo de mouse com um ponto de mutação se a sequência de destino for reconhecida por uma enzima de restrição, que geralmente é o caso.
Corte de um a três milímetros da ponta da cauda com uma tesoura limpa e transfira-a para um tubo PCR de oito tiras de 0,2 mililitro. Depois de conter a amostra de cauda como descrito no manuscrito, armazene-a a T-menos 20 graus Celsius até a extração, até cerca de uma semana. Adicione 100 microliters de solução de lise tecidual por tubo e misture bem, seguido de spin-down usando uma minicentrifuagem de mesa a 2.200 vezes G por 10 segundos à temperatura ambiente.
Certifique-se de que as amostras da cauda estão submersas na solução. Coloque os tubos em um cicloviário térmico, programando os parâmetros para lise tecidual, inativação e retenção. Armazene o tecido a quatro graus Celsius por até uma semana se o PCR não puder ser realizado imediatamente.
Prepare uma solução PCR contendo cinco microlitros de água sem nuclease, 0,75 microlitros de primers avançados e reversos de 10 micromolares e 7,5 microlitros de mix mestre PCR por amostra em um novo tubo PCR. Adicione um microliter do tecido previamente preparado à solução PCR. Misture bem a solução PCR e gire para baixo com uma minicentrifugação de mesa a 2.200 vezes G durante 10 segundos à temperatura ambiente.
Coloque os tubos em um ciclo térmico programado. Uma vez concluída a reação, armazene os produtos PCR a quatro graus Celsius por um a dois meses ou aproximadamente um ano a menos 20 graus Celsius. Prepare a solução enzimada contendo sete microlitrais de água sem nuclease, dois microliters de buffer CutSmart com força de 10X e um microliter de enzima de restrição NlaIII.
Se houver várias amostras, multiplique cada conteúdo para fazer a mistura e alíquota de 10 microliters por tubo. Adicione 10 microliters de produto PCR previamente obtidos à solução enzimápica por tubo. Misture bem e gire para baixo com o minicentrifuge de mesa como demonstrado anteriormente.
Coloque os tubos em um ciclo de calor programado ou bloqueio térmico. Armazene o produto após a incubação em condições frias. Adicione 0,75 gramas de agarose em 50 mililitros de tampão TAE de força única.
Misture e aqueça a agarose no micro-ondas até dissolver completamente. Depois de esfriá-lo, adicione cinco microliters de mancha de DNA e misture suavemente. Despeje 25 mililitros do gel de agarose no molde de gel e deixe o gel solidificar.
Carregue 10 microliters do produto PCR digerido para o poço. Execute o gel com 100 volts por 35 minutos. Imagem do gel agarose sob luz ultravioleta.
A eletroforese agarose realizada utilizando o produto PCR digerido resultou em várias faixas de tamanhos diferentes em cada genótipo, com duas bandas em tipo selvagem, três em heterozigous e uma em homozigos, respectivamente. A injeção de teste com análise blastocisto resultou em uma taxa de sucesso de 76,9% na injeção de 50 nanogramas por microliter dos oligos doadores, e uma taxa de sucesso de 25% na injeção de 25 nanogramas por microliter dos mesmos oligos doadores, respectivamente. Finalmente, injetar 50 nanogramas por microliter dos oligos doadores com precipitação de etanol obteve animais fundadores com uma taxa de sucesso de 50%.
A purificação de doadores de oligo por precipitação de etanol reduziu a toxicidade, mantendo alta eficiência de edição de genomas. O manuseio cuidadoso e a adição de uma baixa quantidade de reagentes é muito importante. Certifique-se de que eles são adicionados corretamente e são bem misturados.
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Visão Geral
Este protocolo descreve um método para genotipagem de animais com uma única mutação M213L no gene Gja1 que leva à produção da Conexina43 de comprimento completo, ao mesmo tempo que impede a tradução da isoforma menor GJA1-20k. O método enfatiza a eficiência e a relação custo-benefício do uso de enzimas de restrição em genotipagem baseada em PCR.
Componentes Principais do Estudo
Área de Pesquisa
- Genética
- Biologia Molecular
- Modelos Animais
Contexto
- Importância da identificação de mutações genéticas
- Dificuldades das substituições de um único resíduo
- Aplicação de enzimas de restrição na genotipagem
Métodos Utilizados
- Genotipagem baseada em PCR
- Modelos de camundongos com mutações pontuais
- Eletroforese em gel de agarose para análise de DNA
Resultados Principais
- Identificação bem-sucedida de genótipos com padrões de bandas distintos
- Altas taxas de sucesso na geração de animais fundadores
- Validação da eficiência dos métodos descritos para análise genética
Conclusões
- O estudo demonstra um protocolo eficiente para genotipagem de mutações em modelos de camundongos.
- Ele contribui com metodologias valiosas para pesquisas genéticas em biologia do desenvolvimento.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Este protocolo permite a genotipagem precisa de mutações pontuais em modelos de camundongos, apoiando estudos de validação de alvos nos quais a expressão proteica isoforma-específica deve ser analisada. Ao eliminar isoformas truncadas que possam confundir os resultados, mantendo ao mesmo tempo a função da proteína de comprimento completo, ele aprimora a desvinculação mecanicista no estágio inicial de descoberta. A abordagem melhora a confiança preditiva para hipóteses terapêuticas envolvendo a biologia da Conexina 43 e vias relacionadas de junções comunicantes.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas ao isolar a contribuição funcional da Cx43 de comprimento completo em relação aos isoformas truncados no extremo N.
- Valor Operacional: Oferece um método de genotipagem escalável para distinguir alelos selvagens, heterozigotos e mutantes homozigotos em grandes coortes.
- Valor Preditivo: Apoia a triagem de portfólios ao esclarecer se os fenótipos observados decorrem da perda da proteína de comprimento completo ou de mecanismos específicos a isoformas.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Prontidão para ensaio: Gera amostras de DNA com padrões de fragmentos de restrição adequados para fluxos de trabalho de triagem em alta produtividade.
- Saída quantitativa: Permite a quantificação alélica específica por meio da análise de polimorfismo de comprimento de fragmento de restrição associada à PCR.
- Reprodutibilidade: Padroniza a genotipagem entre laboratórios utilizando uma adição de baixo custo de uma única enzima aos protocolos de PCR existentes.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Relevância para Doenças: Facilita modelos pré-clínicos em que o tráfego de Cx43 e a montagem de junções comunicantes estão implicados em distúrbios cardíacos, neurológicos ou oncológicos.
- Continuidade Translacional: Relaciona genótipo molecular com desfecho fenotípico ao preservar a expressão de Cx43 de comprimento completo enquanto reduz o GJA1-20k.
- Decisões Ajustadas ao Risco: Orienta critérios de prosseguimento ou interrupção ao permitir a correlação entre níveis de expressão de isoformas e leituras funcionais in vivo.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se insere no continuum de descoberta, desde a validação inicial do alvo até os testes de eficácia pré-clínica, especialmente quando é necessário esclarecer funções proteicas específicas de isoformas.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses ao permitir modelos genéticos que discriminam entre a função da proteína completa e a atividade de isoformas truncadas.
- Triagem: Fornece DNA genômico pronto para ensaios para aplicações posteriores, como validação de CRISPR ou gerenciamento de colônias de reprodução.
- Análises: Fornece padrões de bandas nítidos e passíveis de interpretação em gel de agarose, permitindo a atribuição rápida do genótipo sem sequenciamento.
- Pesquisa Translacional: Possibilita estudos pré-clínicos nos quais a localização da Cx43 na membrana e a comunicação intercelular são pontos finais mecanicistas essenciais.
- Reutilização Empresarial: Adaptável a qualquer mutação pontual em que um sítio de restrição possa ser introduzido ou interrompido, oferecendo uma plataforma reutilizável de genotipagem.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Reduz a ambiguidade mecanicista na validação de alvos ao isolar as contribuições específicas de isoformas.
- Valor Operacional: Aumenta a produtividade e reduz o custo por amostra por meio de uma única etapa pós-PCR de digestão com enzima de restrição.
- Valor Estratégico: Melhora a confiança nas decisões durante a otimização de compostos iniciais ao esclarecer as relações entre genótipo e fenótipo.
- Impacto no Portfólio: Permite o avanço ajustado ao risco de candidatos que visam vias dependentes de Cx43.
Considerações sobre a Implementação
- Exige conhecimento especializado em biologia molecular no design de primers para PCR e na seleção de enzimas de restrição.
- Depende do acesso a ciclos térmicos, sistemas de eletroforese em gel de agarose e equipamentos de imagem UV.
- Necessita padronização das condições de lise tecidual e de PCR entre diferentes usuários para obter resultados consistentes.
- A adaptação a sistemas modelo alternativos depende do contexto da sequência e da compatibilidade com enzimas de restrição.
- Limita-se a mutações que alteram ou criam um sítio de reconhecimento para enzima de restrição; mutações silenciosas podem exigir estratégias alternativas.
Perguntas Frequentes sobre Biotecnologia Farmacêutica
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:42
DNA Extraction
1:45
DNA Amplification by PCR
2:42
Incubation with Restriction Enzyme
3:34
Preparation of 1.5% Agarose Gel for Electrophoresis and DNA Band Detection
4:22
Results: Genotype Analysis and Recombination Efficiency
5:21
Conclusion
