Name: Uma abordagem de segmentação sem rótulos para imagens intravitais do microambiente tumoral mamário (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 39 s
Description: Aprenda uma técnica de imagem intravital sem rótulos para segmentar o microambiente tumoral mamário em compartimentos distintos usando sinais de colágeno e NAD(P)H. Este método minimiza manipulações no animal e é amplamente aplicável a diversos sistemas intravitais.

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Os autores gostariam de reconhecer as subvenções NCI R01 CA216248, CA206458 e CA179556 para financiar este trabalho. Também gostaríamos de reconhecer o Dr. Kevin Eliceiri e seu grupo de imagens por sua experiência técnica no desenvolvimento precoce do nosso programa intravital. Agradecemos também ao Dr. Ben Cox e outros membros do Grupo de Fabricação Eliceiri do Instituto morgridge de pesquisa por seu design técnico essencial durante as fases iniciais do MIW. Ellen Dobson ajudou com conversas úteis sobre a ferramenta de segmentação WEKA capacitável ImageJ. Além disso, gostaríamos de agradecer à Dra. Por último, gostaríamos de agradecer à Dra.

Os autores não têm conflitos de interesse para divulgar.

A imagem intravital 4D é uma ferramenta poderosa para investigar interações fisiológicas dinâmicas dentro do contexto espacial e temporal do microambiente tumoral nativo. Este manuscrito fornece uma estrutura operacional muito básica e adaptável para compartimentar interações celulares dinâmicas dentro da massa tumoral, do estroma adjacente ou nas proximidades da rede vascular usando apenas sinais endógenos de segunda geração harmônica ou autofluorescência NAD(P)H). Este protocolo fornece um método abrangente, passo a pa...

A matriz extracelular (ECM) no microambiente tumoral é conhecida por ser dinamicamente depositada e remodelada por múltiplos tipos de células para facilitar ainda mais a progressão da doença 1,2,3. Essas alterações matriciais fornecem sinais mecânicos e biológicos que alteram o comportamento celular e muitas vezes resultam em um ciclo contínuo de remodelação matricial4. A investigação sobre a interação dinâmica e recíproca entre as células tumorais e a matriz extracelular é frequentemente conduzida usando cultura tridimensional (3D) in vitro ou sistemas microfluidos. Embora essas abordagens de baixo para cima tenham demonstrado mecanismos de remodelação do ECM 5,6,7, aumento da proliferação8, epitelial para transição mesenquimal 9,10,11,12, e migração e invasão de células tumorais 7,13,14,15,16 , seu foco tem sido principalmente em alguns tipos de células (por exemplo, células tumorais ou fibroblastos) dentro de uma matriz 3D homogênea em comparação com a diversidade e heterogeneidade das interações presentes dentro de um tecido fisiológico. Além dos sistemas in vitro, a histologia tumoral ex vivo também pode fornecer algumas informações sobre essas interações célula-célula e célula-ECM17. A imunohistoquímica tem a vantagem de poder analisar múltiplos tipos celulares no que diz respeito à composição espacialmente heterogênea e arquitetura do ECM, mas os pontos finais estáticos do tecido fixo não captam a natureza dinâmica das interações entre as células e o microambiente. A imagem intravital abriu a porta para interrogar interações diversas e dinâmicas dentro do contexto fisiológico do microambiente tumoral nativo.
As capacidades de imagem de tumor intravital estão avançando rapidamente. Melhorias no design de janelas de imagem e técnicas cirúrgicas para implantar as janelas permitiram imagens longitudinais de tumor a longo prazo em uma variedade de locais anatômicos (ou seja, tumor primário, linfonodos, sítios metastáticos 18,19,20). Além disso, a capacidade de instrumentação óptica para visualizar e coletar dados em múltiplas dimensões (ou seja, intensidade espectral, fluorescência espacial e vida útil), e em alta resolução e velocidade (taxa de vídeo) está se tornando amplamente acessível. A tecnologia aprimorada oferece uma oportunidade para explorar mudanças rápidas na sinalização celular e dinâmica fenotípica dentro de um ambiente fisiológico. Por fim, a expansão das ferramentas optogenéticas e a ampla gama de construções fluorescentes genéticas permitem a marcação de tipos celulares específicos para capturar a migração celular no microambiente tumoral ou rastreamento de linhagem celular durante o desenvolvimento ou progressão da doença21,22. O uso dessas ferramentas em combinação com a tecnologia CRISPR/Cas9 proporciona aos pesquisadores a oportunidade de gerar modelos animais únicos em tempo hábil.
Embora todos esses avanços tornem a imagem intravital um método cada vez mais poderoso para explorar interações celulares dinâmicas e fisiológicas, ainda há uma necessidade importante de desenvolver estratégias que forneçam contexto espacial, temporal e estrutural no nível tecidual a essas interações biológicas. Atualmente, muitos estudos de imagem intravital compensam a falta de marcos visuais, como os vasos sanguíneos, injetando corantes fluorescentes na vasculatura ou empregando modelos de camundongos que exógenos expressam proteínas fluorescentes para delinear características físicas. Corantes injetáveis e substratos como dextrans fluorescentes são amplamente utilizados para rotular com sucesso a vasculatura nas coleções intravitais19, 23, 24. No entanto, essa abordagem não é sem limitações. Por um tempo, requer manipulações adicionais de mouse e sua utilidade está limitada a experimentos de curto prazo. Para estudos longitudinais, o dextran fluorescente pode ser problemático, pois observamos o acúmulo de dextran em células fagocíticas ou difusão no tecido circundante ao longo do tempo25. A incorporação de proteínas fluorescentes exógenas no modelo do camundongo tem sido apresentada como uma alternativa aos dextrans fluorescentes, mas apresenta limitações próprias. A disponibilidade e a diversidade de fluoroforos exógenos dentro dos modelos de mouse ainda são limitadas e caras de criar. Além disso, em modelos específicos, como modelos PDX, manipulações genéticas não são desejáveis ou possíveis. Também foi demonstrado que a presença de proteínas fluorescentes ou bioluminescentes dentro das células são reconhecidas como estrangeiras dentro do camundongo, e dentro de modelos de camundongos imunocompetuntes, isso reduz a quantidade de metástase devido à resposta do sistema imunológico hospedeiro26,27. Por fim, proteínas fluorescentes exógenas ou corantes fluorescentes usados para contexto espacial ou para segmentar dados subsequentes muitas vezes ocupam faixas primos do espectro de luz que poderiam ser usadas para investigar as interações fisiológicas de interesse.
O uso do sinal intrínseco do ECM ou fluorescência endógena das células dentro do tecido representa um potencial meio universal livre de rótulos para segmentar dados intravitais para uma análise celular e espacial mais aprofundada. A segunda geração harmônica (SHG) tem sido usada há muito tempo para visualizar o ECM28. Com o desenvolvimento subsequente de importantes ferramentas para auxiliar na caracterização da organização defibras 29,30,31, é possível caracterizar o comportamento celular em relação à estrutura local de ECM. Além disso, a autofluorescência do metabólito endógeno, NAD(P)H, fornece outra ferramenta sem rótulos para compartimentar o microambiente tumoral in vivo. Nad(P)H fluoresce brilhantemente em células tumorais e pode ser usado para discriminar os limites do ninho tumoral em crescimento de seu estroma circundante21,32. Por fim, a vasculatura é uma importante estrutura fisiológica no microambiente tumoral e local de interações específicas do tipo celular chave 33,34,35. A excitação dos glóbulos vermelhos (RBC) ou plasma sanguíneo tem sido usada para visualizar a vasculatura tumoral, e usando excitação de dois ou três fótons (2P; 3P) a medição das taxas de fluxo sanguíneo tem se mostrado possível36. No entanto, enquanto os vasos sanguíneos maiores são facilmente identificáveis por suas assinaturas de fluorescência endógena, a identificação de vasos sanguíneos pequenos sutis, variáveis e menos fluorescentes requer mais conhecimento. Essas dificuldades inerentes dificultam a segmentação de imagem ideal. Felizmente, essas fontes de fluorescência endógena (ou seja, glóbulos vermelhos e plasma de sangue) também podem ser medidas pela imagem de vida fluorescência37, que capitaliza as propriedades fotofísicas únicas da vasculatura e representa uma adição útil à crescente caixa de ferramentas intravital.
Neste protocolo, um fluxo de trabalho para a segmentação de imagens intravitais quadridimensionais (4D) explicitamente utilizando sinais intrínsecos como fluorescência endógena e SHG é descrito desde a aquisição até a análise. Este protocolo é particularmente pertinente para estudos longitudinais através de uma janela de imagem mamária onde a fluorescência exógena pode não ser prática ou possível, como é o caso dos modelos PDX. Os princípios de segmentação aqui descritos, no entanto, são amplamente aplicáveis aos usuários intravitais que investigam biologia tumoral, desenvolvimento de tecidos ou mesmo fisiologia tecidual normal. O conjunto de abordagens de análise relatadas permitirá aos usuários diferenciar o comportamento celular entre regiões de configurações alinhadas ou aleatórias de fibra de colágeno, comparar números ou comportamentos de células residentes em regiões específicas do microambiente tumoral e mapear a vasculatura para o microambiente tumoral usando apenas sinal livre de rótulos ou intrínsecos. Juntos, esses métodos criam uma estrutura operacional para maximizar a profundidade das informações obtidas a partir da imagem intravital 4D da glândula mamária, minimizando a necessidade de rótulos exógenos adicionais.

<table><tbody><tr><td>#1.5 12mm vidro de cobertura redonda</td><td>Warner Instruments</td><td># 64-0712</td><td>MIW construção</td></tr><tr><td>Seringa de 1.0 mL para injeção SQ</td><td>Seringa</td><td></td><td>BD 309659</td></tr><tr><td>20x objetiva</td><td>Zeiss</td><td>421452-988</td><td>Agulha de imersão em água</td></tr><tr><td>27G para injeção SQ</td><td>Agulha Covidien</td><td>1188827012</td><td></td></tr><tr><td>objetiva 40x Nikon</td><td></td><td>MRD77410</td><td></td></tr><tr><td>Sutura trançada de seda de imersão em água 5-0 Sutura</td><td>Ethicon</td><td>K870</td><td>para implantação MIW</td></tr><tr><td>Gel de lágrimas artificiais</td><td>Akorn</td><td>NDC 59399-162-35</td><td>Gel para os olhos</td></tr><tr><td>Solução de Betadine, 5%</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC1558063</td> Surgery aplicador <td>anti-séptico</td></tr><tr><td>com ponta de algodão</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-400-101</td><td></td></tr><tr><td>Adesivo de cianoacrilato</td><td>Loctite</td><td>1365882</td><td>MIW construção</td></tr><tr><td>fluorescente dextran</td><td>Sigma</td><td>T1287-50mg</td> marcação <td>intravenosa de fórceps de vasculatura</td></tr><tr><td></td><td>Mckesson.com</td><td>Miltex&nbsp;#18-782</td> tubo fotomultiplicador GaAsP <td>curvado, 4 polegadas,</td></tr><tr><td></td><td>Hamamatsu&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>manta de aquecimento</td><td>CARA 72 almofada de aquecimento</td><td>&nbsp; 038056000729</td> Câmara de aquecimento <td>selecionável por temperatura</td></tr><tr><td></td><td>construída em casa</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Manual fluorescente vitalício</td> Base <td>de</td>microscópio invertida <td>https://www.becker-hickl.com/literature/handbooks Becker</td> and Hickl <td></td></tr><tr>Nikon<td>Isoflurane</td><td>Akorn</td><td>NDC 59399-106-01</td><td>Anestesia</td></tr><tr><td></td><td></td> Liqui-Nox Fisher <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> Scientific</td><td>16-000-125</td><td>MIW limpeza</td></tr><tr><td>Meloxicam</td><td>Norbrook</td><td>NDC 55529-040-10</td><td>Micro Mangueira Analgésica</td></tr><tr><td></td><td>Scientific Commodities INC.</td><td>&nbsp; Cabeça de varredura multifotônica BB31695-PE/1</td><td></td></tr><tr><td>Cabeçote de varredura multifotônico</td><td></td><td>Bruker Ultima II</td><td></td></tr><tr><td>Filtro NADH FLIM Chroma</td><td></td><td>284994</td><td>ET 440/80 m-2P</td></tr><tr><td>Nair</td><td>CVS</td><td>339826</td><td>Aquecedor de objetiva em creme depilatório</td></tr><tr><td></td><td>Tokai Hit</td><td>STRG-WELSX-SET</td><td></td></tr><tr><td>SHG/FAD Chroma</td><td></td><td>320740</td><td>ET450/ 40m-2P</td></tr><tr><td>Limpador de vidro Sparkle</td><td>Amazon.com</td><td>B00814ME24</td> Limpador de vidro para <td></td></tr><tr><td>placa de contagem de fótons MIW SPC-150</td> implantada <td>Luz cirúrgica Becker e Hickl</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>FAJ</td><td>B06XV1VQVZ</td> Micro-tesoura cirúrgica de luz magnética <td>LED gooseneck</td></tr><tr><td></td><td>Excelta</td><td>366</td><td>inoxidável,</td></tr><tr><td>pomada antibiótica tripla</td> de 3 polegadas <td>Actavis Agulha</td> feita sob encomenda do BD 30G do cateter <td>antibiótico</td>da tevê de Pharma <td>NDC 0472-0179-34</td></tr><tr><td></td><td></td><td>:</td><td>Cateter 305106 para a injeção da tevê</td></tr><tr>Laser do dois-fotões<td></td><td>Chroma</td><td>320282</td><td>ET585/65m-2P</td></tr><tr><td>Laser</td> coerente <td>do</td><td></td><td>multifotónico Gel de ultrassom multifotônico ajustável</td></tr><tr><td></td><td>Parker</td><td>PKR-03-02</td><td>Gel de imersão</td></tr><tr><td>em água Uréia cristais</td><td>Sigma</td><td>U5128-5G</td><td>Opcional: FLIM IRF</td></tr></tbody></table>

uma abordagem de segmentação sem rótulos para imagens intravitais do microambiente tumoral mamário

A Label-Free Segmentation Approach for Intravital Imaging of Mammary Tumor Microenvironment

A capacidade de visualizar interações fisiológicas complexas e dinâmicas entre numerosos tipos de células e a matriz extracelular (ECM) dentro de um microambiente tumoral vivo é um passo importante para entender mecanismos que regulam a progressão do tumor. Embora isso possa ser realizado através das técnicas atuais de imagem intravital, ela permanece desafiadora devido à natureza heterogênea dos tecidos e à necessidade de contexto espacial dentro da observação experimental. Para isso, desenvolvemos um fluxo de trabalho de imagem intravital que emparelha a imagem de segunda geração harmônica de colágeno, fluorescência endógena do cofator metabólico NAD(P)H, e microscopia de imagem de fluorescência vitalícia (FLIM) como meio de compartimentar não invasivamente o microambiente tumoral do tumor em domínios básicos do ninho tumoral, o estroma circundante ou ECM, e a vaculatura. Este protocolo não invasivo detalha o processo passo a passo que vai desde a aquisição de imagens de lapso de tempo de modelos de tumores mamários até análise pós-processamento e segmentação de imagens. A principal vantagem deste fluxo de trabalho é que ele explora assinaturas metabólicas para contextualizar o microambiente tumoral vivo em mudança dinâmica sem o uso de rótulos fluorescentes exógenos, tornando-o vantajoso para modelos de xenerto derivados do paciente humano (PDX) e uso clínico futuro onde fluoroforos extrínsecos não são prontamente aplicáveis.

A instalação do MIW e o planejamento experimental básico são os primeiros passos nesse processo. Este projeto e protocolo MIW em particular são mais favoráveis aos estudos longitudinais19 e tem sido utilizado com sucesso com microscópios eretos e invertidos. Neste caso, um microscópio invertido foi usado, pois resultou em maior estabilidade de imagem da glândula mamária com menos artefatos respiratórios. Na Figura 1A, fornecemos as dimensões do MIW rígido e uma visão ...

O método de imagem intravital descrito aqui utiliza colágeno segunda geração harmônica e fluorescência endógena do cofator metabólico NAD(P)H para segmentar não invasivamente um microambiente tumoral não rotulado em compartimentos tumorais, estromaéreos e vasculares para análise aprofundada de imagens intravital 4D.

Uma abordagem de segmentação sem rótulos para imagens intravitais do microambiente tumoral mamário

The ability to visualize complex and dynamic physiological interactions between numerous cell types and the extracellular matrix (ECM) within a live tumor ...

A imagem intravital nos permite observar interações fisiológicas dentro do microambiente tumoral. E usando este método, comportamentos dinâmicos específicos que são observados podem ser compartimentados usando características de tecido local. Este protocolo usa apenas um sinal onipresente sem rótulos de fibras de colágeno ou metabólitos autofluorescentes para segmentar o TME, minimizando assim a quantidade de manipulações para o mouse.Este método é amplamente aplicável a qualquer sistema intravital onde a compreensão de interações dinâmicas relativas a estruturas de matriz extracelular ou estruturas vasculares é necessária. Demonstrando esse procedimento estarão Dave Inman, especialista sênior em pesquisa, e Erica Hoffmann, estudante de pós-graduação do laboratório. Comece a preparar um vidro de cobertura de janela de imagem mamária, absorvendo um vidro de cobertura redonda de 1,5 12 milímetros em 100% de etanol por 10 minutos, depois seque o vidro de cobertura sob uma lâmpada de calor e fixe o vidro na estrutura da janela de imagem mamária metálica usando adesivo de cianoacrilato.Cure o adesivo da noite para o dia. No dia seguinte, use um cotonete encharcado de acetona para limpar a janela de imagem mamária montada do adesivo em excesso antes de submergir a janela de imagem mamária em 70% de etanol por pelo menos 10 minutos para ajudar na limpeza. Depois de secar, armazene a janela de imagem mamária limpa em uma placa de Petri estéril.Antes de iniciar a cirurgia para implantação da janela, ferramentas cirúrgicas autoclave e superfícies higienizadas com 70% de etanol. Prepare uma mesa higienizada para a cirurgia com um cobertor aquecido coberto com um campo estéril. Coloque o cobertor de aquecimento de tal forma que a temperatura medida no topo do campo estéril seja de 40 graus Celsius.Use iluminação a frio auxiliar e lupa para o procedimento cirúrgico. Use EPI consistindo de um jaleco de uso único estéril, mangas cirúrgicas, luvas, proteção ocular e máscara facial. Em seguida, remova a pele do rato anestesiado na quarta glândula mamária inguinal com um creme depilatório e enxágue o local cirúrgico com uma gaze estéril encharcada de água.Em seguida, prepare o local cirúrgico depilado para cirurgia, higienizando a superfície da pele com três betadinas alternadas e esfoliantes de etanol. Quando feito, levante suavemente a pele sobre a glândula mamária número quatro usando fórceps. Uma vez que a pele é afastada da parede do corpo, remova uma seção de um milímetro da camada dérmica na ponta dos fórceps com microscisores cirúrgicos.Sem cortar a glândula subjacente, crie uma incisão de 10 milímetros e, em seguida, libere a glândula mamária da camada dérmica com o movimento suave das fórceps. Adicione PBS para cobrir a glândula exposta. Use uma sutura trançada de seda 5-0 para criar uma sutura de corda de bolsa ao longo da periferia da abertura e, em seguida, insira uma borda da janela de imagem mamária para que a camada dérmica se envolva no entalhe receptor da janela de imagem mamária.Ao esticar o epitélio na extremidade oposta da janela de imagem mamária, empurre a janela de imagem mamária metálica para o lugar de tal forma que a camada dérmica engaje totalmente o entalhe receptor em torno de toda a circunferência da janela de imagem mamária. Em seguida, coloque a corda da bolsa para desenhar a camada dérmica no entalhe e amarre a camada para fixar a janela. Aplique um antibiótico tópico na camada dérmica na janela de imagem mamária e monitore continuamente o mouse.Depois de recuperar a consciência suficiente para manter a recumbência severa, abriga a janela de imagem mamária implantada do mouse separadamente em cama macia com um iglu colocado na gaiola e permite que o rato se recupere por 48 horas antes da imagem. Para a imagem, use um sistema de ar forçado definido para 30 graus Celsius. Use um aquecedor objetivo adicional para evitar a deriva no foco Z e permitir que o sistema chegue ao equilíbrio a 30 graus Celsius por pelo menos uma hora antes da imagem.Em seguida, configure uma câmara de aquecimento no palco do microscópio. Depois de confirmar a anestesia com o método de beliscar o dedo do dedo do dedo, adicione uma pomada ocular ao mouse. Para manter a hidratação adequada, injete 0,5 mililitros de PBS subcutâneamente a cada duas horas durante a duração da sessão de imagem.Aplique um gel à base de água em vez de água ao objetivo e limpe o lado de fora do vidro da janela de imagem mamária com um aplicador de algodão e limpador de vidro antes de transferir o mouse para o estágio de microscópio pré-aquecido. Depois de colocar o mouse no estágio do microscópio, pressione a coleira da janela de imagem mamária em um orifício receptor de 14 milímetros na inserção do palco para estabilizar as imagens e encaixar a mangueira isoflurane. Em seguida, leve o campo de imagem em foco usando os oculares do microscópio e a iluminação brightfield, observando vasculatura com fluxo sanguíneo.Verifique a estabilidade do campo de visão. Se os artefatos de movimento respiratório estiverem presentes, aplique uma compressão suave na parte traseira da glândula com um pequeno bloco de espuma e um pedaço de fita adesiva semelhante à cintura. Após a aplicação da compressão, verifique se o fluxo sanguíneo é mantido em todo o campo de visão.Uma vez que o mouse esteja sedado e posicionado com segurança no estágio do microscópio invertido, comece a localizar regiões de interesse. Usando uma fonte de luz direcionada à janela de imagem mamária, use os oculares do microscópio para identificar áreas potenciais para investigação. O foco deve ser ver vasculatura e fluxo sanguíneo.Adicione e salve as posições XY no software. Quando os níveis de energia apropriados forem definidos, configure a pilha Z e observe o aparecimento de fibras abundantes de colágeno a 20 a 50 micrômetros abaixo da superfície de vidro da janela de imagem mamária. O colágeno se tornará menos prevalente à medida que o microscópio se se for mais profundo no tumor.Os vazios da segunda geração harmônica ou SHG revelam a localização das massas tumorais. Coloque a fatia z superior abaixo da camada de células solitárias com as primeiras fibras de colágeno aparecem entre 50 e 100 mícrons. Coloque a fatia Z inferior em 250 micrômetros onde as fibras desaparecem e o sinal ruim domina.Em seguida, repita o procedimento para todas as posições XY salvas. Uma vez definida a faixa de pilha Z, aumente o tempo de moradia para oito microssegundos e otimize as configurações de energia e detector. Otimize os níveis de energia necessários para excitar o tecido para cada experimento e usar poderes de até 90 miliwatts a 750 nanômetros ou 70 miliwatts a 890 nanômetros na abertura traseira do objetivo.Em seguida, comece com intervalos de 10 minutos entre os pontos de coleta para a maioria dos filmes de migração intravital e ajuste os intervalos de tempo de acordo com as metas experimentais. Se forem observados sinais de fototoxicidade como sangramento celular ou aumento rápido da autofluorescência e fotobleaching excessivo, reduza a potência do laser ou aumente os intervalos de timelapse conforme as condições indicam. Para imagens de fluorescência ao longo da vida ou FLIM de NADPH, inicie a visualização e ajuste a potência do laser até que a leitura da fração constante discriminar ou CFD esteja entre 10 e 10 a sexta.Excedendo o CFD além de 10 para o sexto resultado em acúmulo de fótons e resultados gerais ruins. Uma vez definido o nível de potência, defina o tempo de integração entre 90 e 120 segundos e inicie a coleção FLIM para adquirir fótons do campo de visão para o tempo atribuído. Um campo de visão típico dentro de um tumor mamário sem rótulos demonstrou fibras abundantes de colágeno perto da janela e uma diminuição em abundância mais profunda no tumor.O uso da fluorescência vitalícia ou NADPH ajudou na identificação da vasculatura. Algumas regiões escuras nas imagens eram dobras tumorais ou a indagável de lóbulos tumorais adjacentes. Para identificar a vasculatura, uma imagem composta usando NDPH FLIM foi validada comparando projeções de intensidade máxima da pilha intravital antes e depois da injeção da veia da cauda do dextran fluorescente.A análise representativa mostra a quantificação de quatro camundongos e os campos de visão. Para delinear os limites das massas tumorais sem rótulo, foi utilizada a autofluorescência NADPH. As imagens relataram as assinaturas metabólicas das células e a localização dos vasos sanguíneos.A autofluorescência AFD também identificou os macrófagos. Com o esquema de segmentação, o tumor sem rótulos foi segmentado em compartimentos para o ninho tumoral, estroma e vasculatura utilizando apenas autofluorescência SHG e NADPH. Além disso, as fibras de estroma e colágeno também podem ser classificadas em regiões locais das fibras alinhadas.A coisa mais importante a ser lembrada para este protocolo é garantir que o mouse esteja devidamente sedado e contido para que o campo de visão permaneça estável para imagens.

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