Name: Destacamento de Cientistas Comunitários para Realizar Amostragem Genética Não Destrutiva de Populações de Borboletas Raras (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-10-28T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 17 s
Description: Aprenda a realizar amostragem genética não destrutiva de borboletas raras usando resíduos de ovos ecolhidos. Este método de baixo custo permite a participação de cientistas comunitários na conservação da biodiversidade.

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Os autores agradecem a David Cuthrell, Amanda Dillon, Steve Fuller, Neil Gifford, Heidi Holman, Dean Jue, Sally Jue, Daniel Kennedy, Genevieve Kozak, Rebecca Longenecker, Maureen McClung, Matt Moran, Robin Niver, Brenda Smith, Hunter Trowbridge e Jessup Weichelt pela ajuda com vários aspectos do projeto, incluindo logística, coordenação, permissão e / ou coleta de amostras. Esta pesquisa foi financiada através de uma doação do Serviço de Pesca e Vida Selvagem dos EUA (Número de Identificação do Prêmio Federal F20AC00356) administrado pelo Wildlife Management Institute (subsídio SA 2021-01).

1. Divulgação de suprimentos para cientistas comunitários
<ol><li>Revise cuidadosamente e reúna a lista completa de suprimentos relacionados à coleta necessários, consultando a Tabela de Materiais completa.</li>
	<li>Se a coleta de amostras ocorrer em vários locais e/ou por vários indivíduos/equipes, reúna e organize todos os suprimentos necessários em unidades implantáveis separadas (Figura 1 e Figura 2).</li>
	<li>Suprimentos de transporte (unidades destacáveis) para cientistas comunitários ou outro pessoal responsável pela coleta de campo.</li>
	<li>Se o pessoal não for local, embale cuidadosamente os suprimentos (cada unidade destacável) em uma caixa de remessa de papelão separada com uma etiqueta de remessa completa e envie. NOTA: O envio acelerado não é necessário nesta fase.</li>
</ol>2. Preparação da recolha de cientistas comunitários
<ol><li>Após o recebimento dos suprimentos de coleta, incluindo a caixa de coleta de coleta, revise cuidadosamente a lista de suprimentos laminados e realize um inventário completo. Notifique o líder do projeto se algum suprimento estiver faltando.</li>
	<li>Pré-encha tubos de microcentrífuga de 1,5 mL com 180 μL de tampão de lise, aplique etiquetas com uma etiqueta ID exclusiva pré-impressa em cada tubo de microcentrífuga e coloque todos os tubos na caixa de armazenamento de tubos de microcentrífuga de 64 poços. Prenda firmemente a tampa após o carregamento. NOTA: Se não estiverem disponíveis impressoras de etiquetas, aplique números de identificação exclusivos na lateral e na tampa de cada frasco para injetáveis utilizando um marcador à prova de etanol.</li>
	<li>Certifique-se de que todos os equipamentos digitais (por exemplo, smartphone ou câmera) estejam totalmente carregados e que todas as baterias sobressalentes estejam embaladas.</li>
	<li>Encha parcialmente um pequeno refrigerador com gelo para armazenamento em campo e transporte local das amostras coletadas.</li>
	<li>Embale todos os suprimentos de coleta na caixa de coleta ou em um recipiente resistente e à prova de intempéries semelhante para transporte seguro e armazenamento consolidado.</li>
	<li>Revise o protocolo de coleta de amostras genéticas não destrutivas em detalhes antes de entrar em campo. NOTA: Use o protocolo ilustrado laminado e condensado para orientação adicional no campo (Figura Suplementar S1 e Figura Suplementar S2).</li>
</ol>3. Coleta de amostras no campo
<ol><li>Ao chegar ao local de campo, use um lápis ou caneta para todos os climas para registrar no caderno de campo à prova de intempéries a hora do dia, a data, o nome geral da propriedade (por exemplo, Floresta Nacional de Apalachicola), o nome ou a descrição do local do campo específico e a leitura por GPS, se disponível, e o nome completo e as funções de todas as pessoas presentes.</li>
	<li>Localize um habitat adequado com a presença de espécies de plantas hospedeiras larvais específicas para a borboleta alvo. NOTA: Tenha cuidado para evitar ou minimizar o impacto em habitats sensíveis, populações de plantas e vida selvagem. Além disso, certifique-se de proteger todas as permissões e/ou permissões apropriadas de proprietário de terras antes de acessar um site e eventos de coleta de amostras.</li>
	<li>Usando um smartphone ou câmera, tire fotografias detalhadas de todos os locais de campo, locais de coleta de amostras, plantas hospedeiras e qualquer outra informação que possa ser relevante para o projeto. Use smartphones ou outras câmeras que gravam coordenadas GPS. NOTA: A Geomarcação de Fotos precisa estar ativada em todos os smartphones.</li>
	<li>Pesquise de forma abrangente todas as partes da planta hospedeira larval, como folhas, botões florais, flores ou frutos em desenvolvimento, conhecidos por serem selecionados por ovipositação (postura de ovos) borboletas fêmeas adultas para ovos chocados. Para a maioria dos Lycaenidae, procure ovos brancos eclodidos com um orifício distinto no centro semelhante a um donut do qual a larva neonata emergiu (Figura 3). Procure ovos não eclodidos que sejam de cor um pouco mais escura, muitas vezes verdes ou azulados, e que estejam completamente intactos sem um buraco no meio (Figura 4). Use uma lente de mão ou outro dispositivo de ampliação para inspecionar cada ovo de perto.</li>
	<li>Uma vez que um ovo chocado tenha sido localizado, coloque luvas nitrílicas em ambas as mãos.</li>
	<li>Usando pinças limpas, estéreis e pontiagudas, pegue e puxe suavemente o ovo chocado da planta hospedeira e coloque-o diretamente em um tubo de microcentrífuga rotulado pré-preenchido com tampão de lise retirado da caixa de armazenamento de 64 poços. NOTA: Alguns materiais de transporte de plantas hospedeiras (menores que 15 mm de diâmetro) são aceitáveis e normais durante a coleta.</li>
	<li>Coletar no mínimo um total de 5 amostras por planta/local da planta hospedeira (cada uma contendo 1-20 ovos eclodidos), visando um total de >50 ovos em um local, se disponível. NOTA: Isso ajudará a garantir que pelo menos algum tecido seja coletado em cada planta/adesivo de amostra e aumentará as chances de detectar DNA (observação pessoal).</li>
	<li>Após cada coleta de ovos, limpe cuidadosamente as pontas da pinça mergulhando-as em um frasco de etanol a 95% ou mergulhando com etanol a 95% de uma garrafa de esprema ou usando lenços umedecidos com álcool. NOTA: Isso ajudará a minimizar o transporte de tecido entre os eventos de amostragem.</li>
	<li>Se disponível, colete vários ovos eclodidos (1-20 ovos) de várias plantas no mesmo remendo hospedeiro em um único tubo de microcentrífuga e feche firmemente a tampa. Para espécies de borboletas que utilizam espécies hospedeiras herbáceas ou lenhosas maiores, colete vários ovos de diferentes locais na mesma planta se as manchas hospedeiras forem limitadas. NOTA: As plantas estão na mesma mancha hospedeira se suas folhas se tocarem umas nas outras. Se houver uma separação física perceptível entre plantas ou manchas, esta deve ser considerada uma amostra diferente. Se coletar outro tipo de tecido, como exúvias larvais ou uma única perna, coloque apenas uma única perna, fragmento de perna ou exúvia larval em um tubo de microcentrífuga (uma amostra por indivíduo).</li>
	<li>Certifique-se de que todo o material coletado esteja totalmente submerso no tampão de lise dentro de cada tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Toque na parte inferior do tubo em questão em uma superfície dura para resubmergir todas as amostras, se necessário.</li>
	<li>Limpe a pinça para secar com uma limpeza de laboratório descartável. NOTA: A limpeza cuidadosa da pinça é essencial para evitar a contaminação cruzada entre as amostras.</li>
	<li>Ao coletar uma nova amostra, descarte luvas de nitrilo usadas e substitua-as por um par limpo.</li>
	<li>Em um caderno de campo à prova de intempéries, use um lápis ou caneta para todas as condições climáticas para registrar a etiqueta de identificação exclusiva atribuída a partir do tubo de microcentrífuga, juntamente com o tipo de amostra (por exemplo, ovos, exúvios larvais ou perna), o número aproximado de ovos chocados e informações de coleta, como nome(s) do coletor, data, localização, espécie de planta hospedeira e quaisquer notas adicionais (Figura 2).</li>
	<li>Coloque o tubo de microcentrífuga fechado com a amostra de detritos de ovos de volta na caixa de armazenamento de microcentrífuga de 64 poços.</li>
	<li>Mantenha a caixa de armazenamento de microcentrífuga de 64 poços em um refrigerador com gelo enquanto estiver no campo.</li>
	<li>Manter todos os outros suprimentos de coleta na caixa de coleta enquanto estiver no campo para armazenamento e transporte seguros e consolidados entre os locais.</li>
</ol>4. Quando a coleta de campos estiver concluída
<ol><li>Certifique-se de que todos os tubos de microcentrífuga contendo amostras estejam na caixa de armazenamento de microcentrífuga de 64 poços em um refrigerador com gelo para transporte.</li>
	<li>Coloque todos os suprimentos de coleta de campo de volta na caixa de coleta de coleta.</li>
	<li>Transporte todas as amostras de volta para o escritório ou laboratório e verifique cuidadosamente cada tubo de microcentrífuga para garantir que todo o material da amostra esteja completamente submerso no tampão de lise.</li>
	<li>Coloque a caixa de armazenamento de microcentrífuga de 64 poços com amostras em um freezer até o embarque ou processamento. NOTA: Um congelador comercial médio de -18 °C é aceitável para armazenamento a curto prazo.</li>
	<li>Avalie cuidadosamente todos os suprimentos na caixa de ferramentas de coleta e substitua os que forem necessários. Observação : isso é particularmente importante se vários eventos de coleta de campo são agendados.</li>
	<li>Armazene a caixa de coleta em um local seguro até o próximo evento de coleta de campo.</li>
	<li>Baixe todas as imagens digitais e garanta que todas sejam armazenadas em backup com segurança em um servidor ou sistema de armazenamento baseado em nuvem.</li>
	<li>Digitalize ou fotografe as páginas originais à prova de intempéries, cadernos de campo ou folhas de dados de campo contendo dados de coleta até que todas as informações possam ser inseridas em uma planilha ou banco de dados do projeto.</li>
</ol>5. Apresentação de amostras e dados
<ol><li>Remova todas as caixas de armazenamento de microcentrífugas de 64 poços com amostras do congelador.</li>
	<li>Embale cuidadosamente as caixas de armazenamento de microcentrífuga de 64 poços com amostras e o caderno de campo ou folhas de dados de campo em uma caixa de remessa padrão, anexe a etiqueta de remessa fornecida com o número de conta do remetente original e envie via entrega garantida por transportadora expressa, durante a noite, no dia seguinte, para o diretor do projeto.</li>
	<li>Envie por e-mail o número de acompanhamento do pacote e uma cópia das páginas de bloco de anotações digitalizadas ou folhas de dados de campo para o diretor do projeto.</li>
</ol>6. Extração de DNA
<ol><li>Uma vez recebidas as caixas de armazenamento de microcentrífugas de 64 poços, armazene-as a -20 °C para a preservação do DNA em amostras até que estejam prontas para a extração de DNA.</li>
	<li>No laboratório, extraia o DNA moendo o tecido do inseto armazenado em tampão de lise após o descongelamento a partir do -20 °C. Adicionar 20 μL de proteinase K e deixar a amostra de molho durante a noite a 56 °C numa incubadora aquecida durante um período não superior a 24 h.</li>
	<li>Adicione os amortecedores de limpeza e lavagem adequados, de acordo com a recomendação específica do fabricante13.</li>
	<li>Transfira a amostra suspensa em tampão para uma coluna de rotação ligada a um frasco para injetáveis de recolha de 2 ml.</li>
	<li>Gire para baixo a 6.021 × g por 60 s usando uma centrífuga. Adicione os amortecedores de lavagem apropriados e gire para baixo adequadamente.</li>
	<li>Solte o DNA ligado usando tampão de elusão (30 μL) e gire a amostra para baixo em um tubo de microcentrífuga fresco de 1,5 mL. Conservar a -20 °C. NOTA: Prossiga para a sequenciação se a concentração de ADN exceder 0,010 ng/ml. Ver figura 5 para a concentração de ADN por tipo de tecido.</li>
</ol>7. Análise de dados de sequências de DNA
<ol><li>Corte ou edite chamadas de base de baixa qualidade em sequências resultantes.</li>
	<li>Sequências de consulta em bancos de dados públicos para confirmação da identificação de espécies.</li>
	<li>Alinhe as sequências entre si para comparação das diferenças entre os indivíduos.</li>
</ol>

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<li>Storer, C., Daniels, J., Xiao, L., Rossetti, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+noninvasive+genetic+sampling+to+survey+rare+butterfly+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Insects%22%5BJournal%5D)">Using noninvasive genetic sampling to survey rare butterfly populations.</a> Insects. 10 (10), 311(2019).</li>
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</ol>

Os autores não têm conflitos de interesse a divulgar.

Este protocolo descreve um método de campo para amostragem não destrutiva de borboletas raras para estrutura genética populacional ou análises de código de barras de DNA. Os benefícios gerais deste protocolo são projetados especificamente para ajudar a maximizar a ampla implementação por indivíduos de diferentes níveis de experiência e habilidade, como cientistas comunitários, profissionais de conservação e estudantes. Isso inclui um custo geral relativamente baixo, suprimentos e equipamentos fáceis de adquirir, um método simples e acessível, sem inúmeras etapas excessivamente complexas e fácil implantação em uma ampla área geográfica. Além disso, tem como alvo o material orgânico residual que elimina a necessidade de capturar ou manipular temporariamente e, no processo, potencialmente prejudica os organismos vivos para adquirir amostras genéticas. Além disso, estende o período potencial disponível para a coleta de amostras além da fenologia tradicional ou da vida útil de um estágio de vida específico, aumentando a flexibilidade e a oportunidade geral de coleta para ajudar a maximizar o número de amostras. 
Embora o táxon focal para esse esforço tenha sido a borboleta elfina fosca, um especialista em habitat generalizado, mas em declínio, esse protocolo pode ser aplicado de forma mais ampla a muitos outros insetos, incluindo aqueles de preocupação com a conservação. Da mesma forma, enquanto o protocolo visa a coleta de ovos eclodidos como fonte de material genético, ele pode ser facilmente adaptado a outras amostras potencialmente mais tradicionais (por exemplo, pernas, fragmentos de asas, clipes de antena) ou mesmo organismos inteiros. No entanto, esse aspecto também é uma potencial limitação do protocolo. Embora a grande maioria das etapas seja projetada para ser relativamente simples e rápida de realizar, pesquisar de forma abrangente manchas de plantas hospedeiras larvais para ovos de eclosão, que individualmente são tipicamente < 1,0 mm de diâmetro, é demorado e trabalhoso. No entanto, essa extensa atividade de amostragem é particularmente ideal para uma rede maior de participantes, como cientistas comunitários. 
Tal como acontece com outros projetos baseados em campo, a preparação cuidadosa é essencial. Isso inclui a realização de um inventário completo dos suprimentos necessários para garantir que nenhum item esteja faltando, que qualquer trabalho de preparação necessário tenha sido concluído e que eles estejam bem organizados, embalados com segurança e prontos para a implantação em campo. Além disso, todo o pessoal de campo, particularmente aqueles que conduzem a coleta de tecidos, devem revisar o protocolo de coleta em detalhes antes de qualquer evento de coleta e abordar quaisquer perguntas aos indivíduos que supervisionam o projeto. Uma vez no campo, a parte de coleta de amostras do protocolo requer atenção meticulosa aos detalhes. Isso inclui localizar e inspecionar cuidadosamente quaisquer óvulos para garantir que eles estejam chocados e, portanto, apropriados para coleta, limpando completamente a pinça, substituindo luvas para ajudar a reduzir o transporte de tecido entre os eventos de amostragem e garantindo que as amostras de tecido sejam completamente submersas em tampão de lise dentro de cada tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Por fim, o registro de dados precisos e detalhados é essencial, o que inclui a vinculação da etiqueta de identificação exclusiva atribuída a partir do tubo de microcentrífuga, juntamente com a amostra específica coletada e todas as outras informações de coleta pertinentes. Embora esse passo seja rotineiro na pesquisa científica, muitas vezes precisa ser completamente esclarecido e reforçado para um público de ciência da comunidade.
Aqui, demonstramos o potencial de alavancagem de cientistas comunitários para a coleta de amostras não letais de espécies pequenas, raras e ameaçadas. No entanto, existem algumas limitações potenciais a ter em mente ao analisar quaisquer dados genéticos resultantes. Por exemplo, enquanto o agrupamento de amostras de um único adesivo aumenta as chances de recuperar DNA suficiente para detecção, ele também potencialmente introduz heterozigosidade. Além disso, como o protocolo envolve a coleta do córion de óvulos eclodidos, apenas borboletas fêmeas, representando o DNA parental, podem ser amostradas dentro de uma população. No entanto, como não havia dados genéticos anteriores em nível populacional disponíveis para o C. irus, os insights resultantes obtidos só podem beneficiar a conservação e o manejo das espécies. Por exemplo, enquanto um projeto de estudo completo e detalhado e uma seleção cuidadosa de marcadores seriam necessários para avaliar adequadamente a estrutura da população, o protocolo de amostragem descrito aqui e o uso de código de barras de DNA da subunidade 1 (CO1) da citocromo c oxidase poderiam ser usados para detectar a ocorrência de táxons raros ou em perigo. Discussões adicionais sobre a utilidade e aplicação do sequenciamento de DNA a partir de amostras não letais descritas aqui são detalhadas por Storer et. al.14.
Além do objetivo principal de coletar amostras para análise genética, o protocolo também enfatiza que os participantes tirem fotografias digitais detalhadas de todos os locais de campo, locais de coleta, plantas hospedeiras larvais presentes e quaisquer outros elementos do habitat circundante que possam ser relevantes. Essa documentação ajuda a fornecer uma avaliação geral do habitat que é útil para ilustrar as condições existentes do local, como fenologia de plantas, densidade de recursos do hospedeiro e histórico de gerenciamento (por exemplo, incêndio prescrito recentemente). Essas informações são particularmente úteis para projetos em que amostras de campo são coletadas durante um período temporal mais amplo, a fim de permitir comparações ambientais mais detalhadas. 
Por fim, à medida que o declínio global de insetos continua a se acelerar, esforços expandidos de avaliação e monitoramento de espécies são extremamente necessários15,16. O uso de um envolvimento participativo mais generalizado de cientistas comunitários, estudantes (por exemplo, estagiários e bolsistas do Serviço de Pesca e Vida Selvagem dos EUA) e profissionais de conservação oferece opções cada vez mais viáveis para a extensa coleta de dados de muitos tipos, incluindo amostras de DNA. Assim, os dados gerados a partir deste protocolo têm muitos usos possíveis. Isso inclui ajudar a informar ações de conservação (por exemplo, planejamento, recuperação e gerenciamento), listar decisões ou avaliações de status de espécies e pesquisas ecológicas, populacionais e taxonômicas.

A amostragem genética populacional eficaz de táxons de insetos raros, em declínio e/ou listados é muitas vezes crítica para ajudar a informar as ações de conservação e manejo. Métodos de amostragem de tecidos letais ou prejudiciais são rotineiramente utilizados para muitas análises genéticas. No entanto, esses métodos são indesejáveis ou não permitidos porque podem causar danos às populações vulneráveis existentes ou afetar negativamente o comportamento e a aptidão. Várias técnicas de amostragem não letais ou não invasivas envolvendo tecidos como pernas inteiras, recortes de antenas ou asas, exúvias larvais ou hemolinfa de secreções defensivas e outros produtos, como frass, têm sido adequadas para pesquisa genética de insetos 1,2,3,4,5,6,7,8,9 . A viabilidade geral e a aplicabilidade dessas várias técnicas de amostragem de tecidos variam significativamente com base na biologia, ecologia, comportamento, tamanho e raridade do organismo focal, situação e indivíduos que coletam o material. Por exemplo, pernas inteiras ou recortes de apêndices exigem captura temporária e manuseio cuidadoso de vários indivíduos de um estágio de vida apropriado, normalmente por pessoal experiente. Da mesma forma, as fontes de tecido, como exúvios larvais ou frass, provavelmente só serão práticas se os organismos estiverem em cativeiro ou temporariamente mantidos por um período adequado.
Para questões de pesquisa que estão sendo feitas no nível da população, como aquelas relativas à potencial diferenciação taxonômica ou estrutura genética, a amostragem em uma escala temporal ou geográfica mais ampla (ou seja, regional ou continental) é frequentemente necessária. Como resultado, certas fontes de tecido não invasivas podem ser completamente impraticáveis ou, no mínimo, ineficientes para coletar em quantidade. A coleta de amostras em tais escalas também pode ser logisticamente ou financeiramente impraticável ou proibitiva para pesquisadores individuais ou mesmo equipes de campo menores empreenderem. Embora o envolvimento direto de cientistas comunitários tenha sido cada vez mais adotado pela comunidade de pesquisa para ajudar a enfrentar muitos desses desafios e acelerar a coleta orientada por big data, a adoção tem sido limitada para estudos envolvendo amostragem não destrutiva, não invasiva ou de eDNA10,11,12.
Para ajudar a superar algumas dessas limitações potenciais, demonstramos que o córion dos óvulos de borboleta eclodidos poderia produzir quantidade e qualidade de DNA suficientemente altas para o sequenciamento genético bem-sucedido para confirmar a identidade da espécie e quantificar a variação genética. Posteriormente, testamos vários protocolos de coleta utilizando essa técnica13. Este trabalho-piloto serviu de base para um maior aperfeiçoamento metodológico. Este artigo descreve em detalhes o protocolo de coleta de campo revisado e direto, mas abrangente, lançado para cientistas comunitários e outros funcionários não especializados. Este protocolo faz parte de uma análise da estrutura populacional de toda a gama da borboleta elfa congelada (Callophrys irus) para ajudar a informar futuras ações de conservação e uma determinação federal de possivelmente listagem sob a Lei de Espécies Ameaçadas dos EUA. Embora potencialmente mais trabalhoso do que alguns métodos não invasivos, a falta de contato necessário com o organismo e a facilidade de uso o tornam um modelo potencialmente viável que pode ser aplicado a outros programas de pesquisa genética populacional visando uma seleção de insetos comuns e aqueles de preocupação com a conservação, que deixam detritos residuais de ovos para trás de ninfas ou larvas recém-eclodidas. A linguagem protocolar aqui apresentada foi desenvolvida especificamente para borboletas da família Lycaenidae e para uso por não especialistas aqui definidos como cientistas comunitários ou outros indivíduos (por exemplo, biólogos de agências, estagiários) com experiência entomológica limitada.

<table><tbody><tr><td>Refrigerador portátil Igloo Playmate de 14 quartos</td><td></td><td></td><td> Quantidade por unidade implantável: 1 refrigerador</td></tr><tr><td>250 DNeasy Mini Spin Columns, Proteinase K, Buffers, Tubos de Coleta (2 mL)</td><td>Qiagen</td><td>69506</td><td>Qiagen DNeasy Blood & Kit de lenços de papel Valor por unidade implantável: NA</td></tr><tr><td>Andwin Scientific Supplier Diversity Partner MARCADORES DE LABORATÓRIO PRETO</td><td>FisherSci</td><td>NC9280166</td><td>marcador de laboratório à prova de etanol Valor por unidade implantável: 2 marcadores</td></tr><tr><td>Caixa de remessa</td><td></td><td></td> de papelão<td> Valor por unidade implantável: conforme necessário</td></tr><tr><td>Frascos de lavagem de polietileno Eisco, LDPE</td><td>FisherSci</td><td>S14091</td><td>garrafa de spray ou esguicho de grau de laboratório (para etanol ou álcool) Quantidade por unidade implantável: 1 garrafa</td></tr><tr><td>FedEx U.S. express airbill</td><td>FedEx</td><td>NA</td><td>envio etiqueta de devolução Quantidade por unidade implantável: 2 etiquetas</td></tr><tr><td>Tubos de Microcentrífuga Premium Fisherbrand: 1,5 mL</td><td>FisherSci</td><td>NC9386261</td><td>tubos de microcentrífuga estéreis de 1,5 mL Quantidade por unidade implantável: 128 tubos Pinça,</td></tr><tr><td>#4a, pontas muito finas, mas extra fortes (33 mm), 4-3/8" (111 mm) de comprimento</td><td>Pinça de ponta reta Bioquip</td><td>4523</td><td> Quantidade por unidade implantável: 2 pinças retas</td></tr><tr><td>Pinça, #7, pontas curvas (13 mm), pontas muito finas, 4-1/2" (114 mm) de comprimento</td><td>Pinça de ponta curva Bioquip</td><td>4527</td><td> Quantidade por unidade implantável: 2 pinças curvas</td></tr><tr><td>Kimberly-Clark Professional&nbsp; Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipers, 1-Ply</td><td>FisherSci</td><td>06-666A</td><td>kimwipes (ou outro lenço estéril) Quantidade por unidade implantável: 1 caixa</td></tr><tr><td>Protocolo de coleta de campo ilustrado laminado</td><td>NA NA</td><td></td><td>protocolo abreviado Quantidade por unidade implantável: 1 protocolo</td></tr><tr><td>Lista laminada de materiais Lista de</td> suprimentos <td>NA</td><td></td><td>NA Quantidade por unidade implantável: 1 lista</td></tr><tr><td>Lily Sugar 'N Cream The Original Solid Yarn, 2.5 oz, Medium 4 Gauge, 100% Algodão - Rosa Choque - Lavar à Máquina e Fio</td> rosa <td>seco da Amazon</td><td>NA</td><td>(para prender ao fórceps para visibilidade) Quantidade por unidade implantável: 2 jardas</td></tr><tr><td>Lupa por Bausch & Lomb, 10x Lupa Coddington</td><td>Amazon</td><td>NA</td><td>lente de mão Quantidade por unidade implantável: 2 lentes</td></tr><tr><td>de mão MyGift Bandejas de plástico transparente de 2 camadas Caixa de armazenamento de suprimentos de artesanato / estojo de transporte de primeiros socorros com alça superior e Caixa</td> de armazenamento de suprimentos <td>Latch Lock Amazon</td><td>NA</td><td> Quantidade por unidade implantável: 1 caixa</td></tr><tr><td>Nitrilo, Luvas Descartáveis, L, Sem Pó, 2.8 mil Espessura da Palma</td><td>Grainger</td><td>60NU14</td><td>luvas de laboratório de nitrilo (grande) Quantidade por unidade implantável: 1 caixa</td></tr><tr><td>Nitrilo, Luvas Descartáveis, M, Sem Pó, 2.8 mil Espessura da Palma</td><td>Grainger</td><td>60NU13</td><td>luvas de laboratório de nitrilo (médio) Quantidade por unidade implantável: 1 caixa</td></tr><tr><td>Qiagen, Inc.&nbsp; BUFFER ATL (200 ML)</td><td>Qiagen</td><td>19076</td><td>Qiagen ATL lysis buffer Quantidade por unidade implantável: 180 &micro; l/tubo; 128 tubos</td></tr><tr><td>Caderno Espiral Lateral à Prova de Intempéries Rite In The Rain, Capa Amarela, Padrão de Página Universal (Nº 373-MX), 11 x 8.75 x 0.5</td><td>Caderno de</td><td>campo à prova de intempéries Amazon NA Quantidade por unidade implantável: 1 caderno</td><td></td></tr><tr><td>Pinças de Carimbo Profissionais Showgard 6" 904 Pinças de Ponta Redonda</td><td>Amazon</td><td>NA</td><td>6" Pinça de ponta de pá Quantidade por unidade implantável: 2 pinças de pá longa</td></tr><tr><td>Texwipe PolySat Limpadores Pré-Umedecidos</td><td>FisherSci</td><td>18-366-231</td><td>lenços umedecidos com álcool Quantidade por unidade implantável: 100 lenços</td></tr><tr><td>Thermo Scientific CryoBoxes</td><td>FisherSci</td><td>12-565-227</td><td>Tubos de microcentrífuga de 64 poços caixas de coleta/armazenamento Quantidade por unidade implantável: 2 caixas</td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>Material de embalagem Quantidade por unidade implantável: conforme necessário</td></tr></tbody></table>

destacamento de cientistas comunitários para realizar amostragem genética não destrutiva de populações de borboletas raras

Deploying Community Scientists to Conduct Nondestructive Genetic Sampling of Rare Butterfly Populations

O declínio global de insetos continua a acelerar. A amostragem genética eficaz é extremamente necessária para avançar a compreensão de muitos táxons e abordar as lacunas de conhecimento existentes. Este protocolo representa um método demonstrado para amostragem não destrutiva de borboletas raras para análise de estrutura genética populacional ou DNA barcoding . Ele usa o córion de óvulos de borboletas eclodidas para produzir quantidade e DNA de qualidade suficientemente altas para o sequenciamento de genes bem-sucedido para confirmar a identidade da espécie e quantificar a variação genética. Pode ser particularmente útil quando outras técnicas de amostragem de tecidos são impraticáveis ou indisponíveis. Embora desenvolvido para um lepidóptero, no entanto, poderia ser facilmente adaptado para uso com outras espécies de insetos. Ele foi projetado especificamente com facilidade de uso como um objetivo para ajudar a maximizar a ampla implementação por indivíduos de diferentes níveis de experiência e habilidade, como cientistas comunitários, profissionais de conservação e estudantes, e para uso em grandes áreas geográficas para facilitar a ampla amostragem populacional. Os dados gerados podem ajudar a informar decisões taxonômicas e de listagem, ações de conservação e gerenciamento e aprimorar a pesquisa ecológica básica.

Materiais para coletar até 563 amostras foram enviados para oito cientistas de conservação e comunitários de nove estados em toda a área de distribuição de espécies no leste da América do Norte. Os materiais foram enviados ao longo de três meses durante 2021, antes dos horários de pico de voo locais. Até o momento, recebemos um total de 160 amostras de tecido de C. irus que foram coletadas (Tabela 1). O DNA genômico foi extraído seguindo um protocolo para esse tipo de amostra detalhado por Storer et al.14. Dessas 160 amostras, o DNA foi extraído com sucesso de 88 com uma concentração média de 1,67 ng/μL (SE ± 2,98), e o maior rendimento de DNA foi de 26,8 ng/μL. As concentrações foram quantificadas utilizando-se um kit de ensaio de alta sensibilidade de acordo com as instruções do fabricante com 2 μL de extrato.
Embora o número total de amostras recebidas seja substancialmente menor do que o número total total de materiais implantados para coleta, isso é predominantemente um artefato de fornecer uma superabundância de materiais de coleta ao coletor primário ou líder de equipe para permitir que eles tenham a máxima flexibilidade para incluir vários locais de coleta e / ou cientistas comunitários envolvidos, se desejado. Além disso, C. iris é um táxon raro e em declínio, representado por populações limitadas e muitas vezes relativamente pequenas em toda a sua área de distribuição existente. Apesar dessa restrição, o número total de amostras de tecido recebidas é substancial, especialmente em comparação com o que seria esperado com uma amostragem mais tradicional de borboletas adultas individuais.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63416/63416fig01.jpg"> Figura 1: Unidades individuais destacáveis de todos os suprimentos necessários aguardando envio para cientistas comunitários ou outro pessoal responsável pela coleta de campo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63416/63416fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63416/63416fig02.jpg"> Figura 2: Unidade destacável individual, incluindo todos os suprimentos, caixa de coleta de plástico transparente e etiqueta de transportadora expressa preenchida aguardando remessa para cientistas comunitários ou outro pessoal responsável pela coleta de campo<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63416/63416fig02large.jpg" target="_blank">. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63416/63416fig03.jpg"> Figura 3: Foto do ovo de borboleta elfina congelada (Callophrys irus) chocado em tremoço selvagem (Lupinus perennis) mostrando um buraco distinto no centro do qual a larva recém-nascida emergiu. Observe que a cor geral do ovo chocado é clara. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63416/63416fig03large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63416/63416fig04.jpg"> Figura 4: Foto de ovos de borboleta elfa congelada (Callophrys irus) não eclodida em tremoço selvagem (Lupinus perennis). Observe que os ovos não eclodidos não têm um orifício central perceptível e que sua cor geral é verde azulado. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63416/63416fig04large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63416/63416fig05.jpg"> Figura 5: Concentração de DNA por tipo de tecido. As linhas intermediárias da caixa representam a mediana, cada caixa estende o IQR e os bigodes da caixa são 1,5 × IQR, com quaisquer pontos fora sendo outliers. Amostras contendo uma única caixa de ovo tiveram apenas uma caixa de ovo, e amostras contendo múltiplas caixas de ovos tiveram pelo menos dois casos, com o número de casos variando de 2 a 20 (média = 5,3) por amostra. Abreviação: IQR = intervalo interquartil. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63416/63416fig05large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Estado</td>
			<td>Caixa do ovo</td>
			<td>Caixas de ovos</td>
			<td>Frass</td>
			<td>Perna</td>
			<td>Mudar</td>
			<td>Total Geral</td>
		</tr><tr><td>Arkansas</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>2</td>
			<td></td>
			<td>2</td>
		</tr><tr><td>Flórida</td>
			<td>3</td>
			<td>10</td>
			<td></td>
			<td>7</td>
			<td>22</td>
			<td>42</td>
		</tr><tr><td>Michigan</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Nova Hampshire</td>
			<td>24</td>
			<td>6</td>
			<td></td>
			<td>15</td>
			<td></td>
			<td>45</td>
		</tr><tr><td>Nova Iorque</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>30</td>
			<td></td>
			<td>30</td>
		</tr><tr><td>Ohio</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Wisconsin</td>
			<td>9</td>
			<td>5</td>
			<td></td>
			<td>5</td>
			<td></td>
			<td>19</td>
		</tr><tr><td>Oklahoma</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>16</td>
			<td>6</td>
			<td></td>
			<td>22</td>
		</tr><tr><td>Total Geral</td>
			<td>36</td>
			<td>21</td>
			<td>16</td>
			<td>65</td>
			<td>22</td>
			<td>160</td>
		</tr></tbody></table>Tabela 1: Número e tipo de material tecidual coletado por estado. 
Figura Suplementar S1: Primeira página do protocolo frente e verso, laminado, condensado e ilustrado para uso em campo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63416/63416_Supplemental%20Fig%20S2.zip" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Figura suplementar S2. Última página de protocolo bilateral, laminado, condensado e ilustrado para uso no campo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63416/63416_Supplemental%20Fig%20s1.zip" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>

Aqui, apresentamos um protocolo simples para amostragem genética não invasiva de populações de borboletas com base na coleta de campo de detritos residuais de ovos. Pode ser usado para confirmar a identidade da espécie e quantificar a variação genética. Este protocolo pode ser facilmente adaptado a grupos mais amplos para o envolvimento da ciência comunitária.

Destacamento de Cientistas Comunitários para Realizar Amostragem Genética Não Destrutiva de Populações de Borboletas Raras

Global insect declines continue to accelerate. Effective genetic sampling is critically needed to advance the understanding of many taxa and address ...

Este protocolo usa uma nova abordagem de amostragem do córion de ovi borboleta eclodida para análise genética. Pode ser particularmente útil quando outras técnicas de amostragem de tecidos são impraticáveis, indisponíveis ou não permitidas. Este protocolo tem um custo global relativamente baixo usando suprimentos fáceis de adquirir e tem como alvo material orgânico residual que elimina a necessidade de capturar ou manipular temporariamente e potencialmente prejudicar os organismos vivos para adquirir amostras genéticas.O protocolo geral é simples e fácil de aprender, mas requer destreza e atenção rigorosa aos detalhes, especificamente para localizar, identificar e remover com sucesso amostras alvo muito pequenas para evitar a contaminação cruzada entre os eventos de coleta de amostras. Comece revisando e reunindo cuidadosamente a lista completa de suprimentos relacionados à coleta necessários. Se a coleta de amostras ocorrer em vários locais ou por vários indivíduos ou equipes, reúna e organize todos os suprimentos necessários em unidades implantáveis separadas.Suprimentos de transporte para cientistas comunitários ou outro pessoal responsável pela coleta de campo. Se o pessoal não for local, embale cuidadosamente os suprimentos em uma caixa de remessa de papelão separada com uma etiqueta de remessa completa e envie-os. Após o recebimento dos suprimentos de coleta, incluindo a caixa de coleta de equipamentos, revise cuidadosamente a lista de suprimentos laminados e realize um inventário completo.Notifique o líder do projeto se algum suprimento estiver faltando. Pré-encha tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitro com 180 microlitros de tampão de lise. Aplique uma etiqueta de identificação exclusiva pré-impressa em cada tubo de microcentrífuga e coloque todos os tubos na caixa de armazenamento de tubos de microcentrífuga de 64 poços.Prenda firmemente a tampa após o carregamento. Certifique-se de que todos os equipamentos digitais estejam totalmente carregados e que todas as baterias sobressalentes estejam embaladas. Encha parcialmente um pequeno refrigerador com gelo para armazenamento em campo e transporte local das amostras coletadas.Embale todos os suprimentos de coleta na caixa de equipamento de coleta ou em um recipiente resistente e resistente semelhante à prova de intempéries para transporte seguro e armazenamento consolidado. Revise o protocolo de coleta de amostras genéticas não destrutivas e detalhe antes de ir para o campo. Ao chegar ao local de campo, use um lápis ou uma caneta meteorológica para registrar a hora do dia, a data, o nome geral da propriedade, o nome ou a descrição do local específico do local do campo, a leitura por GPS, se disponível, e o nome completo e as funções de todos os indivíduos presentes no caderno de campo à prova de intempéries.Localize um habitat adequado para a presença de uma planta hospedeira larval para a borboleta-alvo específica da espécie. Usando um smartphone ou câmera, tire fotografias detalhadas de todos os locais de campo, locais de coleta de amostras, plantas hospedeiras e outras informações relevantes. Use smartphones ou outras câmeras que gravam coordenadas GPS.Pesquise de forma abrangente todas as partes da planta hospedeira larval, como folhas, botões florais, flores ou frutos em desenvolvimento conhecidos por serem selecionados por borboletas fêmeas adultas que postulam óvulos para ovos chocados. Para a maioria dos Lycaenidae, procure ovos brancos eclodidos com um buraco distinto no centro semelhante a um donut do qual a larva recém-nascida emergiu. Procure ovos não eclodidos que sejam de cor mais escura, muitas vezes verdes ou azulados, e que estejam completamente intactos sem um buraco no meio.Uma vez que um ovo chocado é localizado, use luvas nitrílicas. Usando pinças estéreis e pontiagudas, pegue e puxe suavemente o ovo chocado da planta hospedeira e coloque-o diretamente em um tubo de microcentrífuga rotulado pré-preenchido com tampão de lise. Da mesma forma, outras amostras de tecido podem ser usadas e processadas.Certifique-se de que todo o material coletado esteja totalmente submerso no tampão de lise dentro de cada tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro. Toque na parte inferior do tubo em uma superfície dura para re-submergir todas as amostras, se necessário. Ao coletar uma nova amostra, descarte luvas de nitrilo usadas e substitua-as por um par limpo.Após cada coleta de ovos, limpe cuidadosamente as pontas da pinça mergulhando-as ou mergulhando-as em um frasco de etanol a 95% de uma garrafa de esprema ou usando lenços umedecidos. Coletar pelo menos cinco amostras por mancha de planta hospedeira por local, cada amostra contendo de um a 20 ovos, visando mais de 50 ovos no total em um local, se disponível. Colete de um a 20 ovos chocados de várias plantas no mesmo local hospedeiro em um único tubo de microcentrífuga e feche firmemente a tampa.Para espécies de borboletas que utilizam espécies hospedeiras herbáceas ou lenhosas maiores, colete vários ovos de diferentes locais na mesma planta se as manchas hospedeiras forem limitadas. No caderno de campo à prova de intempéries, registre a etiqueta de identificação exclusiva atribuída, juntamente com o tipo de amostra, o número aproximado de ovos chocados e as informações de coleta. Coloque o tubo de microcentrífuga fechado com a amostra de detritos de ovos de volta na caixa de armazenamento de microcentrífuga de 64 poços.Mantenha a caixa de armazenamento em um refrigerador com gelo enquanto estiver no campo. Coloque todos os outros suprimentos de coleta na caixa de coleta para armazenamento e transporte seguros e consolidados entre os locais. Dessas 160 amostras, o DNA foi extraído com sucesso de 88 com uma concentração média de 1,67 nanogramas por microlitro e o maior rendimento de DNA foi de 26,8 nanogramas por microlitro.As concentrações de DNA por tipo de tecido confirmaram que as amostras contendo um único detrito de ovo tinham apenas um caso de ovo e as amostras contendo vários casos de ovos tinham pelo menos dois casos, com o número de casos variando de dois a 20, em média de 5,3 por amostra. Materiais para coletar até 563 amostras foram enviados para oito cientistas de conservação e comunitários de nove estados em toda a gama de espécies no leste da América do Norte. Os materiais foram enviados ao longo de três meses durante 2021, antes dos horários de pico de voo locais.Um total de 160 amostras de tecido de Calephelis iris foram recebidas. É crucial minimizar a contaminação cruzada entre as amostras, garantir que a amostra coletada esteja totalmente submersa no buffer de lise e registrar com precisão o rótulo de identificação exclusivo e os dados de coleta para cada amostra. Este protocolo permitiu uma ampla implantação e uso por cientistas comunitários para amostragem não destrutiva de populações existentes de uma borboleta rara para ajudar a conduzir uma ampla análise de estrutura genética.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

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Desenvolvimento e teste de ensaios quantitativos de PCR específicos para aplicações de DNA ambiental

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Demonstramos um método testado para manusear com segurança abelhas coletadas em campo. Este método permite rápida manipulação, identificação, amostragem genética e confirmação das interações planta-inseto por meio do pólen coletado durante a amostragem. Facilmente adaptável, essa abordagem oferece um meio econômico e não letal para estudar grupos raros de insetos.

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Destacamento de Cientistas Comunitários para Realizar Amostragem Genética Não Destrutiva de Populações de Borboletas Raras

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