Name: Membrana corioalantóica de codorna - Uma ferramenta para diagnóstico fotodinâmico e terapia (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-28T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 43 s
Description: Aprenda a preparar cultura ex ovo de codorna japonesa para diagnóstico e terapia fotodinâmica usando a membrana corioalantóica. Este método respeita os princípios 3R e permite testes in vivo de drogas e toxicidade.

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O trabalho foi apoiado pela VEGA 2/0042/21 e APVV 20-0129. A contribuição de V. Huntošová é o resultado da implementação do projeto: Comunidade científica aberta para a investigação interdisciplinar moderna em medicina (Acrónimo: OPENMED), ITMS2014+: 313011V455 apoiada pelo Programa Operacional Infraestrutura Integrada, financiado pelo FEDER.

A pesquisa foi realizada em conformidade com as diretrizes institucionais. Todos os equipamentos e reagentes devem ser autoclavados ou esterilizados com etanol a 70% ou luz UV.
1. Incubação de ovos
<ol><li>Armazenar ovos de codorna fertilizados a 10-15 °C por um máximo de 4-5 dias antes de iniciar a incubação. Use apenas ovos limpos e não danificados.</li>
	<li>Incube os ovos em uma incubadora de tração forçada por ~ 53-54 h. Coloque os ovos horizontalmente com a rotação do ovo desligada, a 50%-60% de umidade e temperatura de incubação de 37,5 °C.</li>
</ol>2. Preparação ex ovocultura
NOTA: Após a incubação inicial, os ovos são adequados para iniciar o cultivo ex ovo.
<ol><li>Desinfete a superfície do ovo com etanol a 70%, sem girar o ovo.</li>
	<li>Em um armário de fluxo laminar estéril, abra a casca do ovo usando uma pequena tesoura cirúrgica estéril e transfira o conteúdo para uma placa de cultura de 6 poços. Se feito corretamente, o embrião ficará em cima de uma gema não danificada. Após cada ovo, desinfete a tesoura com etanol a 70%.</li>
	<li>Adicione aproximadamente 5 mL de água estéril às lacunas na placa de 6 poços, pois a umidade é essencial para evitar que o CAM seque.</li>
	<li>Coloque os embriões em uma incubadora até novos experimentos, mantendo uma temperatura de 37 °C e 80%-90% de umidade.</li>
	<li>Quando o CAM estiver totalmente desenvolvido (a partir de ED7), coloque um anel de silicone esterilizado (6 mm de diâmetro e aproximadamente 1,5 mm de espessura) na superfície do CAM, ao longo dos pequenos capilares. Evite os principais vasos sanguíneos ao colocar o anel. NOTA: O anel define o espaço de trabalho, ajuda a marcar o local de aplicação da substância e impede que o conteúdo do líquido vaze.</li>
	<li>Encerrar o cultivo dos embriões de acordo com a legislação do país.</li>
	<li>É importante ressaltar que use luvas ou mantenha as mãos desinfetadas com etanol a 70% durante o trabalho. Aspirar embriões inadequadamente inclinados ou ovos não fertilizados com um aspirador a vácuo.</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63422/63422fig01.jpg"> Figura 1: Preparação ex ovocultura . A) Ovos de codorna japonesa tal como são armazenados e incubados. (B) Desinfecção da superfície do ovo com etanol. (C) A casca do ovo é cortada com uma tesoura. (D) O conteúdo do ovo é esvaziado no poço. (E) Embrião de 3 dias de idade devidamente preparado, com vasculatura CAM em desenvolvimento. (F) Placas de cultura armazenadas em incubadora. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63422/63422fig01large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63422/63422fig02.jpg"> Figura 2: Placa de cultura de 6 poços com embriões e anéis de silicone colocados no topo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63422/63422fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
3. Inoculação de células tumorais
NOTA: Todos os procedimentos requerem o uso de um gabinete de fluxo laminar estéril.
<ol><li>Cultivar diferentes tipos de células aderentes em frascos de acordo com os respectivos protocolos de cultura.<ol><li>Retirar o meio velho dos frascos e enxaguar a camada celular com solução salina estéril tamponada com fosfato (PBS) para remover vestígios do meio.</li>
		<li>Após a tripsinização, inibir a tripsina adicionando o meio de cultura e colher as células em tubos de centrífuga. Centrifugar as células e ressuspender o pellet celular em um meio de cultura fresco. Conte as células e ressuscite-as em um meio de cultura celular na concentração desejada. NOTA: Também é possível produzir culturas de células 3D, ou seja, esferoides utilizando, por exemplo, o método da queda suspensa21.</li>
	</ol></li>
	<li>Implante 1 x 10 5-1 x 106 células tumorais ou5-15 esferoides (por CAM) em 30 μL de solução de meio celular no anel de silicone no topo do CAM. NOTA: O volume depende do tamanho do anel de silicone utilizado. Se um anel de silicone com um diâmetro maior é usado, um volume maior é necessário para cobrir toda a área. Dependendo do tipo de célula, ou para diferentes tipos de experimentos, várias concentrações celulares podem ser usadas. Às vezes, a raspagem fina de CAM é usada para melhorar a adesão das células incorporadas.</li>
	<li>Devolver os CAMs com células inoculadas à incubadora (37 °C e 80%-90% de umidade).</li>
</ol><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63422/63422fig03.jpg"> Figura 3: Inoculação da MAC com tumores . (A) Aspiração de esferoides com pipeta e (B) implantação na superfície da CAM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63422/63422fig03large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
4. Aplicação do fotossensibilizador
<ol><li>Aplicação de hipericina<ol><li>Sob iluminação fraca, prepare uma solução-mãe de hipericina a 2 mM, dissolvendo-a em 100% de dimetilsulfóxido (DMSO). Preparar uma solução de trabalho de 79 μM de hipericina pouco antes do experimento com PBS estéril ou solução salina. Garantir que a concentração final de DMSO em todas as soluções seja sempre inferior a 0,2%, o que não afeta o desenvolvimento do embrião.</li>
		<li>Em condições estéreis, aplique um volume apropriado de solução de hipericina no anel de silicone. Um volume de 30 μL é suficiente para encher um anel com um diâmetro de 6 mm.</li>
		<li>Mantenha os embriões em uma incubadora a 37 °C e 80% a 90% de umidade. A hipericina em solução aquosa é fotoativa após sua monomerização no tecido, aproximadamente 3 h após sua aplicação no CAM.</li>
	</ol></li>
	<li>Aplicação de hipericina com LDL, HDL ou nanopartículas como sistemas de transporte NOTA: Estes sistemas de transporte são utilizados para melhorar a penetração da hipericina nas células e estruturas celulares.<ol><li>Devido à fotossensibilidade, execute todas as etapas, incluindo a preparação das soluções, sob iluminação fraca e armazene as soluções no escuro.</li>
		<li>Preparar as formulações de hipericina-LDL e hipericina-HDL misturando volumes apropriados de lipoproteínas e soluções-estoque de hipericina em PBS de acordo com a referência15. A concentração de LDL ou HDL em hipericina é de 20:115.</li>
		<li>Sintetizar nanopartículas poliméricas por polimerização catiônica viva de abertura de anel de acordo com as referências12,13. Ajustar a concentração de hipericina em nanopartículas poliméricas com PBS para 10 μM12,13.</li>
	</ol></li>
</ol>5. PDD e PDT
<ol><li>Conduta PDD<ol><li>Em condições estéreis, aplique fotossensibilizador (hipericina, nanopartículas poliméricas carregadas de hipericina ou hipericina com portador de lipoproteínas) na superfície da CAM, com ou sem células tumorais (DE 7-9).</li>
		<li>Iluminar o CAM usando luz de excitação violeta (luz LED circular personalizada de comprimento de onda de 405 nm) e registrar a fluorescência da hipericina no tecido CAM e células tumorais com uma câmera digital em intervalos de tempo de 0, 1, 3, 5, 24 e 48 h após a administração de hipericina.</li>
		<li>Se a pesquisa exigir uma imagem da CAM em luz branca, registre a CAM antes da administração de hipericina e no final do experimento, pouco antes da fixação tecidual, pois a luz afeta a fotoativação da hipericina.</li>
		<li>Avalie a intensidade de fluorescência usando um programa de processamento e análise de imagem (por exemplo, ImageJ22).<ol><li>Divida os canais de imagem RGB em imagens vermelhas, verdes e azuis separadas. Analise a imagem de intensidade vermelha em formato de 8 bits. Avalie a intensidade vermelha da área dentro do anel e aproxime-a como a fluorescência da hipericina. Obtenha gráficos de perfil de imagem inteiros (usando o plug-in Profile Plot do ImageJ) em diferentes intervalos de tempo após a administração de hipericina (ou seja, a partir de 0 h, logo após a administração, até 48 h).</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>Realizar PDT<ol><li>Realizar a TFD pelo menos 3 h após a aplicação de hipericina.</li>
		<li>Coloque a fibra óptica acima da superfície do CAM para que o raio laser cubra toda a área dentro do anel de silicone.</li>
		<li>Realizar irradiação in vivo (1-2 min) com uma luz laser de 405 nm a uma taxa de fluência de 285 mW/cm2.</li>
		<li>Registrar CAM usando luz branca e luz fluorescente de 405 nm antes e após o tratamento fotodinâmico (24 h e 48 h).</li>
		<li>Detectar fotodanos 24 h e 48 h após PDT a partir das imagens tiradas em luz branca. Avaliar o dano vascular por um escore semiquantitativo16: 1 - sem destruição; 2 - fechamento parcial dos capilares (diâmetro ≤10 μm) sem destruição de vasos médios ou maiores (diâmetro ≥50 μm) e menores (diâmetro 10-50 μm); 3 - fechamento parcial de vasos menores com desaparecimento capilar; 4 - fechamento parcial de vasos maiores com vasos menores e desaparecimento capilar; e 5 - trombose fotográfica total com a maioria dos vasos desaparecendo.</li>
	</ol></li>
</ol><img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63422/63422fig04.jpg"> Figura 4: Tratamento da MAC com luz laser. Esta foto foi tirada para fins ilustrativos. Para PDD ou PDT, a sala deve estar escura. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63422/63422fig04large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
6. Preparação do CAM para uma avaliação mais aprofundada
<ol><li>Incorporação de parafina<ol><li>Fixar o tecido CAM em uma placa de cultivo com paraformaldeído (PFA) a 4% em PBS por um período mínimo de 2 h e máximo durante a noite.</li>
		<li>Remova o PFA e corte cuidadosamente do CAM uma parte do tecido dentro do anel de silicone.</li>
		<li>Desidrate imediatamente o tecido CAM em séries de álcool ascendentes da seguinte forma. Coloque o tecido CAM em etanol a 70% por 3 min, solução de eosina por 2 min (para facilitar a localização do tecido no bloco de parafina), etanol a 96% por 3 x 5 min (sempre em uma nova placa de Petri) e etanol a 100% por 5 min e xileno por 2 x 10 min.</li>
		<li>Com uma espátula ou uma escova fina, transferir as amostras o mais rapidamente possível para a parafina dissolvida em placas de Petri (59 °C). Após 24 h, coloque o tecido no molde histológico, preencha-o com meio de incorporação de parafina e deixe-o solidificar na geladeira. Corte o CAM solidificado do meio de incorporação, vire-o na bandeja em 90°, preencha-o novamente com o meio de incorporação e deixe-o solidificar.</li>
		<li>Prepare seções de 5-10 μm em um micrótomo para análise histopatológica para determinar o dano induzido por TFD.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparação de seções CAM congeladas para histologia NOTA: Para algumas metodologias, incluindo histologia, as seções congeladas preparadas em micrótomo criostato são mais adequadas. Siga as etapas abaixo para preparar as seções CAM congeladas.<ol><li>Monte cuidadosamente o CAM nativo ou fixado em paraformaldeído a 4% na lâmina de vidro.</li>
		<li>Encha o molde de incorporação até a metade com composto de temperatura de corte ideal (OCT) e congele em nitrogênio líquido ou uma mistura de gelo seco e etanol.</li>
		<li>Após o congelamento, incline e deslize cuidadosamente o CAM da lâmina de vidro para a parte superior do meio OCT congelado. Colocar novamente no molde, cobrir com o meio OCT e congelar como na Etapa 6.2.2.</li>
	</ol></li>
	<li>Análise fractal da CAM de codornas NOTA: As alterações de vasculatura causadas pela TFD podem ser avaliadas pelo cálculo do coeficiente de dimensão fractal19.<ol><li>No gabinete de fluxo laminar, transbordar CAM em uma placa de cultivo com uma solução de fixação pré-aquecida (37 °C) de paraformaldeído a 4% e glutaraldeído a 2% em PBS.</li>
		<li>Retirar a solução de fixação após 48 h. Separe cuidadosamente o CAM do embrião com microtesouras e uma escova fina e lave-o em PBS.</li>
		<li>Monte o CAM lavado em uma lâmina de vidro e deixe secar lentamente.</li>
		<li>Fotografe o slide usando uma câmera digital e um transiluminador como fonte de luz branca homogênea.</li>
		<li>Processe imagens digitais usando o software ImageJ22. Para a análise, selecione uma região quadrada (512 × 512 pixels) da área com ramos arteriais distais. Binarize e esqueletizar as imagens e calcular o coeficiente de dimensão fractal (Df) seguindo os procedimentos descritos na referência31.</li>
	</ol></li>
	<li>Análise molecular do tecido CAM<ol><li>Para análise molecular, separe cuidadosamente o CAM nativo, congele em nitrogênio líquido e armazene a -80 °C.</li>
		<li>Determinar a expressão gênica de acordo com protocolos padrão para isolamento de RNA23, transcrição reversa em cDNA e PCR quantitativa24.</li>
	</ol></li>
</ol><img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63422/63422fig05.jpg"> Figura 5: Tecido CAM para análise fractal. Após a TFD, o CAM é fixo, montado em uma lâmina e seco para análise fractal. A foto foi tirada em luz branca usando um transiluminador. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63422/63422fig05large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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<li>Meta, M., Kundeková, B., Bilčík, B., Máčajová, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+silicone+ring+application+on+CAM+vasculature+in+Japanese+Quail+%28Coturnix+japonica%29%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+Student+Scientific+Conference+Faculty+of+Natural+Sciences+of+Comenius+University%2C+Bratislava%2C+Slovakia%22%5BJournal%5D)">The effect of silicone ring application on CAM vasculature in Japanese Quail (Coturnix japonica).</a> Proceedings of the Student Scientific Conference Faculty of Natural Sciences of Comenius University, Bratislava, Slovakia. , 385-390 (2019).</li>
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</ol>

Os autores não têm conflitos de interesse.

Para um cultivo ex ovo bem-sucedido, é importante seguir o protocolo acima. Além disso, se os ovos não forem abertos com cuidado suficiente ou se houver umidade insuficiente durante o cultivo, o saco de gema gruda na casca e muitas vezes se rompe. O início de um cultivo ex ovo no momento de cerca de 60 h de incubação dos ovos garante a alta taxa de sobrevivência dos embriões, pois eles já são grandes o suficiente para sobreviver ao manuseio. Nos estágios posteriores de desenvolvimento, a CAM torna-se ma...

O modelo de membrana corioalantóica de frango (CAM) é bem conhecido e amplamente utilizado em várias áreas de pesquisa. É um órgão extraembrionário ricamente vascularizado que proporciona troca gasosa e transporte mineral1. Devido à transparência e acessibilidade dessa membrana, vasos sanguíneos individuais e suas alterações estruturais podem ser observados em tempo real2. Apesar das vantagens, o CAM de pintos também tem algumas limitações (por exemplo, instalações de reprodução maiores, produção de ovos e consumo de ração) que poderiam ser evitadas usando outras espécies aviárias. Neste protocolo, um modelo alternativo ex ovo CAM usando embrião de codorna japonesa (Coturnix japonica) é descrito. Devido ao seu pequeno tamanho, permite o uso de um número muito maior de indivíduos experimentais do que o CAM de frango. Além disso, o desenvolvimento embrionário mais curto de 16 dias dos embriões de codornas é outra vantagem. Os primeiros vasos maiores na CAM das codornas aparecem no dia embrionário (DE) 7. Isso pode ser diretamente comparado com o desenvolvimento do embrião de pintinho (estágios 4-35); no entanto, os estágios posteriores de desenvolvimento não são mais comparáveis e requerem menos tempo para o embrião de codorna3. De interesse é a ocorrência regular de ramificação microvascular semelhante à dos CAMs de frango 4,5,6. A rápida maturação sexual, a alta produção de ovos e a reprodução de baixo custo são outros exemplos que favorecem o uso desse modelo experimental7.
Um modelo de MAC aviário é frequentemente utilizado em estudos de terapia fotodinâmica (TFD)8. A TFD é usada para tratar várias formas de câncer (pequenos tumores localizados) e outras doenças não oncológicas. Seu princípio está na entrega de um fármaco fluorescente, um fotossensibilizador (PS), ao tecido danificado e sua ativação com luz do comprimento de onda apropriado. Uma PS prospectiva utilizada em pesquisa é a hipericina, originalmente isolada da erva medicinal de São João (Hypericum perforatum)9. Os fortes efeitos fotossensibilizantes deste composto são baseados em suas propriedades fotoquímicas e fotofísicas. Estes são caracterizados por múltiplos picos de excitação por fluorescência na faixa de 400-600 nm, que induzem a emissão de fluorescência a cerca de 600 nm. Os máximos de absorção de hipericina dentro da banda espectral estão na faixa de 540-590 nm, e os máximos de fluorescência estão na faixa de 590-640 nm9. Para alcançar esses efeitos fotossensibilizantes, a hipericina é excitada pela luz do laser a um comprimento de onda de 405 nm após a administração local10. Na presença de luz, a hipericina pode apresentar efeitos virucidados, antiproliferativos e citotóxicos11, enquanto não há toxicidade sistêmica e é rapidamente liberada do organismo. A hipericina é uma substância lipofílica que forma agregados não fluorescentes insolúveis em água, razão pela qual vários tipos de nanocarreadores, como nanopartículas poliméricas12,13 ou lipoproteínas de alta e baixa densidade (HDL, LDL)14,15, são utilizados para auxiliar sua entrega e penetração nas células. Como a CAM é um sistema naturalmente imunodeficiente, as células tumorais podem ser implantadas diretamente na superfície da membrana. O modelo também é adequado para registrar a extensão do dano vascular induzido por TFD de acordo com um escore definido16,17. Luz de menor intensidade em comparação com a TFD pode ser utilizada para o diagnóstico fotodinâmico (TGD). O monitoramento do tecido sob excitação violeta da luz LED também leva à fotoativação de fotossensibilizadores18,19,20 que resulta em uma emissão de luz fluorescente, mas não fornece energia suficiente para iniciar uma reação PDT e danificar as células. Torna-se uma boa ferramenta para visualização e diagnóstico de tumores ou monitoramento da farmacocinética dos PSs utilizados14,15.
Este artigo descreve a preparação do ensaio de codorna ex ovo CAM com taxas de sobrevivência superiores a 80%. Esta cultura ex ovo foi aplicada com sucesso em um grande número de experimentos.

<table><tbody><tr><td>Placa de cultura de células de 6 poços</td><td>Sarstedt</td><td>83.392</td><td>Poliestireno transparente, estéril</td></tr><tr><td>Incubadora de CO2 ESCO CCL-0508</td><td>ESCO, Cingapura</td><td>CCL-050B-8</td><td>CO2 incubadora de cultura de células</td></tr><tr><td>criocorte Leica CM 1800</td><td>Reichert-Jung, EUA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>câmera digital Canon EOS 6D II</td><td>Canon, Japão</td><td></td><td></td></tr><tr><td>laser de diodo 405 nm</td><td>Ocean Optics, EUA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>67-68-5</td><td>dimetil sulfoxid</td></tr><tr><td>eosina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>15086-94-9</td><td></td></tr><tr><td>etanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>pincel fino tamanho 2</td><td>Faber-Castell</td><td>281802</td><td>escova para separação e manipulação CAM</td></tr><tr><td>glutaraldeído</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>111-30-8</td><td></td></tr><tr><td>hematoxilina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>517-28-2</td><td></td></tr><tr><td>hipericina</td><td>Incubadora Sigma-Aldrich</td><td>84082-80-4</td><td></td></tr><tr><td>Bios Midi</td><td>Bios Sedl<img alt="Equação 1" src="/files/ftp_upload/63422/63422eq01.jpg" style="margin: auto; ">any, República</td><td></td> Tcheca <td>Incubadora de tiragem forçada para incubadora de incubação inicial</td></tr><tr><td>Memmert IF160</td><td>Memmert, Alemanha</td><td></td><td>Incubadora de circulação de ar forçado para incubação CAM</td></tr><tr><td>Kaiser slimlite plano, caixa de luz LED</td><td>Kaiser, Alemanha</td><td>2453</td><td>Transiluminador</td></tr><tr><td>Luz LED 405 nm</td><td></td><td></td><td>luz LED circular feita sob medida</td></tr><tr><td>lente macro Canon MP- E 65 mm f/ 2.8</td><td>Canon, Japão</td><td></td><td></td></tr><tr><td>microscópio Kapa 2000</td><td>Kvant, Eslováquia</td><td></td><td>microscópio óptico</td></tr><tr><td>micrótomo Auxilab 508</td><td>Auxilab, Espanha</td><td></td><td>micrótomo rotativo manual</td></tr><tr><td>paraformaldeído</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>30525-89-4</td><td></td></tr><tr><td>Paraplast Plus</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3683</td><td>meio parafina para incorporação de tecidos</td></tr><tr><td>PBS</td>Tesoura de <td>tampão de fosfato salina</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>P4417</td></tr><tr><td>Castroviejo</td><td>Orimed</td><td>  OR66-108</td><td>micro tesoura para software de separação CAM</td></tr><tr><td>ImageJ 1.53</td><td>programa de processamento e análise de imagem</td><td>de domínio</td><td></td> público</tr><tr><td>solução de estoque HDL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>437641-10MG</td><td>lipoproteínas de alta</td></tr><tr><td>densidade solução de estoque LDL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>437644-10MG</td><td>lipoproteínas de baixa densidade</td></tr><tr><td>Tissue-Tek OCT Composto</td><td>Sakura Finetek</td><td>4583</td><td>Composto de temperatura de corte ideal Frascos de aperto de 118 mL</td></tr></tbody></table>

membrana corioalantóica de codorna - uma ferramenta para diagnóstico fotodinâmico e terapia

Quail Chorioallantoic Membrane - A Tool for Photodynamic Diagnosis and Therapy

A membrana corioalantóica (CAM) de um embrião aviário é uma membrana fina e extraembrionária que funciona como um órgão respiratório primário. Suas propriedades o tornam um excelente modelo experimental in vivo para estudar angiogênese, crescimento tumoral, sistemas de liberação de drogas ou diagnóstico fotodinâmico (PDD) e terapia fotodinâmica (TFD). Ao mesmo tempo, este modelo aborda a exigência de substituição de animais experimentais por uma alternativa adequada. O embrião cultivado Ex ovo permite fácil aplicação, acesso, monitoramento e documentação de substâncias. O mais utilizado é o CAM de pintinhos; no entanto, este artigo descreve as vantagens da codorna japonesa CAM como um modelo de baixo custo e alto rendimento. Outra vantagem é o menor desenvolvimento embrionário, que permite maior rotatividade experimental. A adequação da CAM de codorna para PDD e PDT de câncer e infecções microbianas é explorada aqui. Como exemplo, descreve-se o uso do fotossensibilizador hipericina em combinação com lipoproteínas ou nanopartículas como sistema de entrega. O escore de dano das imagens em luz branca e as alterações na intensidade de fluorescência do tecido CAM sob luz violeta (405 nm) foram determinados, juntamente com a análise dos cortes histológicos. A CAM de codorna mostrou claramente o efeito da TFD sobre a vasculatura e o tecido. Além disso, alterações como hemorragia capilar, trombose, lise de pequenos vasos e sangramento de vasos maiores puderam ser observadas. A CAM de codorna japonesa é um modelo in vivo promissor para diagnóstico fotodinâmico e pesquisa terapêutica, com aplicações em estudos de angiogênese tumoral, bem como terapia antivascular e antimicrobiana.

A localização do tumor na superfície CAM é difícil na luz branca. Espera-se que o fotossensibilizador (aqui, hipericina) usado no PDD seja absorvido seletivamente pelo tumor e ajude a visualizar o tumor. A adição de hipericina e o uso de luz fluorescente (por exemplo, 405 nm) mostraram a posição muito bem do tumor (carcinoma espinocelular TE1) (Figura 6A). A análise histológica mostrou células tumorais vitais invadindo tecidos saudáveis. Estruturas concêntricas de células escamosas anormais,...

A membrana corioalantóica (CAM) do embrião aviário é uma ferramenta muito útil e aplicável para várias áreas de pesquisa. Um modelo ex ovo especial de CAM de codorna japonesa é adequado para investigação de tratamento fotodinâmico.

Membrana corioalantóica de codorna - Uma ferramenta para diagnóstico fotodinâmico e terapia

The chorioallantoic membrane (CAM) of an avian embryo is a thin, extraembryonic membrane that functions as a primary respiratory organ. Its properties ...

Vamos mostrar-lhe como preparar a cultura japonesa de codornas ex ovo e como usar a membrana corioalantóica ou CAM em resumo para diagnóstico fotodinâmico e terapia de câncer ou infecções microbianas. As vantagens deste método são o rápido crescimento do desenvolvimento, tamanho pequeno, bom acesso ao tecido e fácil manuseio. Além disso, respeita os princípios da regra 3R para a realização de pesquisas com animais.Devido à sua semelhança estrutural com as membranas mucosas, como a bexiga, os pulmões ou a placenta, é adequado para testes in vivo de potenciais drogas, testes de toxicidade ou estudos de transplante. Demonstrando o procedimento estarão Barbora Kundekova e Majlinda Meta, estudantes de doutorado do meu laboratório. Para começar, use ovos de codorna fertilizados, frescos ou armazenados a 10 a 15 graus Celsius por um máximo de 4 a 5 dias antes do início da incubação.Use apenas ovos limpos e não danificados, em seguida, incube os ovos em uma incubadora de tração forçada a 50 a 60% de umidade e 37,5 graus Celsius por aproximadamente 54 horas colocadas horizontalmente com as rotações de ovos desligadas. Desinfete a superfície do ovo com etanol a 70% sem girar o ovo. Em seguida, em um gabinete de fluxo laminar estéril enquanto estiver usando luvas, abra a casca do ovo usando uma pequena tesoura cirúrgica estéril e transfira o conteúdo para uma placa de cultura de 6 poços.Após cada ovo, desinfete a tesoura com etanol a 70%. Adicione aproximadamente 5 mililitros de água estéril às lacunas na placa de 6 poços, pois a umidade é essencial para evitar que o CAM seque. Em seguida, aspirar embriões com pontas inadequadas ou ovos não fertilizados com um aspirador a vácuo e, em seguida, coloque os embriões em uma incubadora até novos experimentos, mantendo uma temperatura de 37 graus Celsius em 80 a 90% de umidade.Quando a CAM estiver suficientemente desenvolvida, geralmente a partir do dia embrionário 7, coloque um anel de silicone esterilizado na superfície da CAM ao longo dos pequenos capilares, evitando os principais vasos sanguíneos. Em condições estéreis, aplique um volume apropriado de solução de hipericina 30 microlitros no anel de silicone e mantenha os embriões em uma incubadora a 37 graus Celsius em 80 a 90% de umidade. Para realizar o diagnóstico fotodinâmico, ilumine a CAM usando luz de excitação violeta e registre a fluorescência de hipericina e tecido CAM e células tumorais com uma câmera digital em diferentes intervalos de tempo após a administração de hipericina.Se a pesquisa exigir uma imagem da CAM em luz branca, registre a CAM antes da administração de hipericina e no final do experimento pouco antes da fixação tecidual, pois a luz desencadeia a fotoativação da hipericina. Para realizar a terapia fotodinâmica após a aplicação de hipericina, coloque o CAM sob a fibra óptica para que o feixe de laser cubra toda a área dentro do anel de silicone. Depois de realizar irradiação in vivo, neste caso particular com uma luz laser de 405 nanômetros a uma taxa de fluência de 285 miliwatts por centímetro quadrado, registre CAM usando luz branca e / ou luz fluorescente antes e após o tratamento fotodinâmico.Fixe o tecido CAM em uma placa de cultivo com paraformaldeído a 4% em PBS por um mínimo de 2 horas e um máximo de durante a noite, em seguida, remova o paraformaldeído e corte cuidadosamente do CAM uma parte do tecido dentro do anel de silicone. Todas essas etapas devem ser feitas em um exaustor. Lave a parte cortada do tecido CAM em água por 10 minutos e posteriormente desidrate em série de álcool ascendente, colocando o tecido CAM em etanol a 70% por 3 minutos, solução de eosina por 2 minutos, trocina 96% etanol por 5 minutos, etanol a 100% por 5 minutos e duas vezes em xileno por 10 minutos em uma nova placa de Petri.Subsequentemente, transferir as amostras o mais rapidamente possível para a parafina dissolvida em placas de Petri utilizando uma espátula ou escova fina. Após 24 horas, coloque o tecido em molde histológico, preencha-o com um meio de incorporação de parafina e deixe-o solidificar na geladeira, em seguida, corte o CAM solidificado do meio de incorporação, vire-o na bandeja em 90 graus, preencha-o novamente com o meio de incorporação e deixe-o solidificar. Prepare seções de 5 a 10 micrômetros em um micrótomo para análise histopatológica para determinar o dano induzido por TFD.Para preparar as seções de CAM congeladas para histologia, monte cuidadosamente CAM fixo nativo ou 4% paraformaldeído na lâmina de vidro, encha o molde de incorporação até a metade com OCT e congele em nitrogênio líquido ou uma mistura de gelo seco e etanol. Após o congelamento, incline e deslize cuidadosamente o CAM da lâmina de vidro para a parte superior do meio OCT congelado. Coloque novamente no molde, cubra-o com o meio OCT e congele como descrito anteriormente.Para a análise da vasculatura CAM, são necessárias amostras inteiras de CAM. No gabinete de fluxo laminar, transborde CAM com uma solução de fixação pré-aquecida de aldeído paraforme a 4% e glutaraldeído a 2% em PBS, retire a solução de fixação após 48 horas. Em seguida, separe cuidadosamente o CAM do embrião com micro tesoura e uma escova fina e lave-o em PBS, em seguida, monte o CAM lavado em uma lâmina de vidro e deixe-o secar lentamente.Depois, fotografe o slide usando uma câmera digital em um transiluminador como fonte de luz branca homogênea. A localização do tumor na superfície CAM foi visualizada sob luz branca e luz fluorescente após a adição de hipericina. A análise histológica mostrou estruturas concêntricas de células escamosas anormais invadindo os tecidos sadios acompanhadas de edema e espessamento da membrana.Após o tratamento com TFD, observou-se uma clara diferença na densidade do vaso dentro do anel e da área circundante. A radiação laser sem a presença de fotossensibilizador não causou nenhum dano comparável ao controle sem qualquer tratamento. Após 3 horas de incubação com hipericina, a irradiação a laser resultou em fluorescência causada pela monomerização da hipericina agregada com extenso dano à vasculatura.A análise histológica revelou que a MAC controle não tratada apresentou espessura relativamente uniforme. No entanto, o tratamento com TFD fez com que a MAC se tornasse mais fina e frágil. Acabamos de demonstrar como preparar o ensaio de codorna ex ovo CAM e como usá-lo.Embora mantendo as diretrizes, essa metodologia é fácil de dominar e pode provar resultados rápidos.

quail-chorioallantoic-membrane-tool-for-photodynamic-diagnosis

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Pesquisa sobre o Câncer

Neste vídeo, descrevemos o método de co-cultura de gânglios da raiz dorsal e células cancerígenas na membrana corioalantóide de pintinho ou CAM para estudar a invasão perineural.

Membrana corioalantóide de pintinho ou modelo de tumor CAM: um método in ovo para simular a invasão perineural de células tumorais

Este vídeo demonstra o isolamento da membrana corioalantóide portadora de tumor do embrião de galinha. O CAM colhido pode ser usado para outras aplicações a jusante.

Colheita de membrana corioalantóide de pintinho: um método para isolar a membrana corioalantóide com enxerto tumoral de ovo de galinha

O protocolo relatado aqui permite a avaliação da eficácia da terapia fotodinâmica (PDT) em linhas de células e a optimização das condições de PDT, antes de aplicar a terapia em modelos animais.

Citotóxicos Eficácia da Terapia Fotodinâmica no osteossarcoma Células<em&gt; In Vitro</em

Este manuscrito descreve o romance de configuração e funcionamento interno de um fotoacústico microscopia e sistema de dual-modalidade de tomografia computadorizada de coerência óptica para a imagem latente de choriorétiniennes não-invasivo, livre de rótulo de animais maiores, tais como coelhos.

Novela fotoacústico microscopia e tomografia de coerência óptica Imaging Dual-modalidade choriorétiniennes nos olhos de coelho vivo

A terapia fotodinâmica (PDT) é um procedimento médico que envolve a incubação de uma forma exógena aplicada fotossensibilizador (PS) seguido de fotoativação de luz visível para induzir apoptose. Apresentamos um protocolo em vitro PDT projetado para simular o PDT que pode ser usado para estudar as diferenças em incubação de PS e parâmetros de tratamento com luz.

Uma abordagem In Vitro para terapia fotodinâmica

A invasão perineural é um phenotype agressivo para carcinomas de pilha Squamous da cabeça e da garganta e outros tumores. O modelo de membrana corioalantoica de pintinho tem sido usado para estudar angiogênese, invasão de câncer e metástase. Aqui nós demonstramos como este modelo pode ser utilizado para avaliar a invasão perineural in vivo.

A membrana Chorioalantoica Chick in vivo modelo para avaliar invasão perineural em câncer de cabeça e pescoço

Um sistema laser pulsado compacto do tomography fotoacústica do desktop (PLD-Pat) é demonstrado para A imagem latente dinâmica in vivo de alta velocidade do vasculature cortical animal pequeno.

Tomografia fotoacústica de desktop com base em diodo laser pulsada para monitoramento de lavagem e lavagem de corante em vasculatura cortical de ratos

Apresentamos o modelo de membrana chorioallantoico de frango como uma alternativa, transplantável, no modelo vivo para o enenxerto de linhas de células cancerígenas ginecológicas e urológicas e tumores derivados do paciente.

Utilização da membrana chorioallantoico de frango em modelo vivo para estudar cânceres ginecológicos e urológicos

Este é um método eficaz para testar supressores ou condutores de metástase de câncer. As células, transduzidas com uma biblioteca de expressão, são injetadas na vasculatura da membrana corioallantóica do frango para formar colônias metastáticas. Colônias que têm diminuído ou aumentado a invasividade são extirpadas, expandidas, reinjetadas para confirmar seu fenótipo e, finalmente, analisadas usando alto sequenciamento de rendimento.

Descoberta de reguladores metastáticos usando um modelo de membrana corioallantóica intravital rápida e quantitativa

O presente protocolo descreve o implante e a avaliação do melanoma em coroide murina utilizando tomografia de coerência óptica.

Implantação e Avaliação do Melanoma na Coroide Murina via Tomografia de Coerência Óptica

Aqui, descrevemos um protocolo para o desenvolvimento de um modelo de xenoenxertia de membrana corioalantóica (CAM) para tecido ovariano humano e demonstramos a eficácia da técnica, o tempo de revascularização do enxerto e a viabilidade tecidual ao longo de um período de enxertia de 6 dias.

Modelo de membrana corioalantóide de pintinhos (CAM) como ferramenta para o estudo do transplante de tecido ovariano

Aprenda a preparar cultura ex ovo de codorna japonesa para diagnóstico e terapia fotodinâmica usando a membrana corioalantóica. Este método respeita os princípios 3R e permite testes in vivo de drogas e toxicidade.

Membrana corioalantóica de codorna - Uma ferramenta para diagnóstico fotodinâmico e terapia

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