Produção automatizada em larga escala de esferoides de células-tronco derivados de adiposo para bioimpressão 3D
31 de março de 2022
Aqui, descrevemos a produção em larga escala de esferoides esferoides de células-tronco derivados de adiposos (ASC) usando um sistema automatizado de pipetização para semear a suspensão celular, garantindo assim a homogeneidade do tamanho e forma de spheroid. Estes esferoides ASC podem ser usados como blocos de construção para abordagens de bioimpressão 3D.
A importância do protocolo depende da redução de erros humanos e contaminação por microbiologia. Além disso, responsável por produzir milhares de esferoides para abordagens de bioimpressão 3D. A principal vantagem deste assunto, porém, é que ele otimize o horário de trabalho.
Os parâmetros de software são cruciais porque podem influenciar a qualidade final dos esferoides. E o melhor conselho seria realizar testes apenas com mídia de cultura celular. A demonstração visual deste método é crítica porque é um antigo método tradicional de cultura celular 3D baseado no Begin, colhendo a suspensão das células-tronco com uma pipeta sorológica de 10 mililitros e transferindo-a para um tubo de centrífuga de 50 mililitros.
Em seguida, centrífuga a 400 RCF por 5 minutos para obter a pelota ASC. Resuspende a pelota de célula usando DMEM-Low contendo 10% de FBS. Após a realização da contagem de células, tome ASCs em tubos de centrífugas separados de 15 mililitros para semear as 81 e 256 recessões micromoedas com hidrogel não aderente.
Consulte o manuscrito do texto para obter detalhes do número de células utilizadas. Adicione 500 microliters de solução de agarose 2% ultra pura estéril no centro de um molde de silicone contendo 81 ou 256 recessos circulares. Após 40 minutos, desenforme a agarose ultra pura do molde de silicone e coloque-a em um poço de uma placa de plástico de 12 poços.
Adicione dois mililitros de DMEM-Low no poço com a ágarose micromoldada e incubar a 37 graus Celsius com 5% de suprimento de dióxido de carbono atmosférico por pelo menos 12 horas antes de semear os ASCs. Certifique-se de que o fluxo laminar está ligado e que o fluxo de ar do gabinete esteja funcionando corretamente. Confirme se o equipamento está conectado à tensão correta e o tablet está conectado ao equipamento.
Verifique se a altura do vidro de proteção do armário está no mesmo nível da marcação do sensor do equipamento. Pressione o botão liga ou desarme no lado esquerdo do equipamento. Então, espere o tablet e o equipamento começarem.
Posicione as caixas de ponta, o rack para tubos de centrífugas e a placa contendo o hidrogel de agarose micromoldado no espaço de trabalho do equipamento. No software aberto no tablet, clique em LabWare Editor. Configure uma mesa de trabalho virtual e escolha as posições das pipetas, caixas de ponta, o rack para os tubos de plástico e as placas.
Clique no botão mudar para procedimento"botão para incluir todos os parâmetros e comandos realizados pelo equipamento durante todo o experimento. Aguarde uma barra de ferramentas e uma lista de procedimentos para abrir no software. Inicialmente, para indicar os comandos, incorpore o número de amostras a serem pipetadas e arraste-as para a lista de procedimentos.
Em seguida, clique no botão de comando de transferência de reagente no software para transferir a suspensão ASC para os poços da placa de 12 poços contendo os micro moldes e arraste-o para a lista de procedimentos. Clique em propriedades "para configurar as posições de inicial e final para o equipamento transferir a amostra. Aguarde que o software retorne à página Tabela de Trabalho.
Configure os parâmetros para semeadura automatizada das ASCs conforme descrito no manuscrito do texto. Selecione a água como o tipo líquido padrão. Clique no botão opções"para configurar os parâmetros para criar uma suspensão homogênea dos ASCs conforme descrito no manuscrito do texto.
Clique no botão com um símbolo de verificação na barra superior do software para garantir que não haja erro de programação. Clique no botão play"na barra superior do software para iniciar o programa. Que o equipamento comece como programado.
E espere que ele faça um som indicando que terminou. Colete a placa de 12 poços e incuba-a a 37 graus Celsius com um suprimento de dióxido de carbono 5% atmosférico por pelo menos 18 horas, para permitir a formação de esferoides completos e compactos. Colher manualmente os esferoides após um, três e sete dias de cultura para análise.
Lave o meio com uma micro pipeta para liberar os esferoides do hidrogel agarose micromolded não aderente. Colete os esferoides manualmente usando uma micro pipeta e transfira-os para um tubo de centrífuga de 15 mililitros. Um total de 85 e 160 esferoides foram medidos a partir de hidrogéis micromoedos não adesivos com 81 e 256 recessões circulares, respectivamente.
O sistema de pipeta automática semeou a suspensão da célula ASC em 12 poços de uma única placa de 12 poços em 15 minutos. Utilizando o hidrogel não aderente de 81 micromoldados, produziu 972 esferoides neste estudo. Enquanto o hidrogel não aderente de 256 micromoldados, produziu 3072 esferoides.
Os spheróides ASC foram analisados para a homogeneidade de seu tamanho e forma. Os esteroides ASC de micro moldes com 81 recessões apresentaram diâmetro homogêneo durante o período de cultura. Em contraste com os esteroides ASC de micro moldes com 256 recessões, a menor e maior proporção de diâmetros foi próxima de uma em esferoides ASC de micro moldes com 81 e 256 recessões.
A viabilidade, a morfologia e as análises de força forneceram evidências para a produção bem sucedida e em larga escala de esferoides ASC. O maior caso é garantir que o problema foi resolvido abruptamente sem erros.
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Visão Geral
Este artigo descreve um protocolo para a produção em larga escala de esferoides derivados de células estromais/tronco adiposas (ASC) utilizando um sistema automatizado de pipetagem. Este método melhora a homogeneidade do tamanho e da forma dos esferoides, tornando-os adequados para aplicações de bioimpressão 3D.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Cultura celular
- Bioprintagem 3D
- Pesquisa com células-tronco
Contexto
- Métodos tradicionais de cultivo celular tridimensional podem ser suscetíveis a erros humanos.
- A contaminação microbiológica é uma preocupação significativa no cultivo celular.
- Sistemas automatizados podem otimizar o processo de produção.
- A qualidade dos esferoides é influenciada por parâmetros de software.
Objetivo do Estudo
- Reduzir erros humanos na produção de esferoides.
- Minimizar os riscos de contaminação.
- Produzir milhares de esferoides de forma eficiente para pesquisa e aplicações.
Métodos Utilizados
- Sistema automatizado de pipetagem para semeadura de suspensão celular.
- Uso de pipetas serológicas para colheita de suspensão de células-tronco.
- Transferência da suspensão celular para tubos de centrífuga para processamento.
- Testes com meio de cultura celular para otimização de condições.
Resultados Principais
- Produção bem-sucedida de esferoides uniformes de ASC.
- Redução das horas de trabalho necessárias para a geração de esferoides.
- Controle de qualidade aprimorado por meio da automação.
- Demonstração da eficácia do método em formato visual.
Conclusões
- O método automatizado aumenta a confiabilidade da produção de esferoides.
- Oferece uma solução escalável para aplicações de bioimpressão 3D.
- Estudos futuros podem se basear neste protocolo para diversas aplicações.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A produção em larga escala e automatizada de esferoides derivados de células-tronco do tecido adiposo (ASC) resolve um gargalo crítico nos fluxos de trabalho de bioimpressão 3D, permitindo a geração reprodutível e com mínima contaminação de blocos construtivos uniformes. Essa capacidade aumenta a confiabilidade preditiva na engenharia de tecidos e sustenta pipelines de biofabricação escaláveis e de alto rendimento. A produção confiável de esferoides impacta diretamente o potencial translacional de tecidos projetados para aplicações pré-clínicas e em estágio de descoberta.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biofármacos
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Permite testes robustos de hipóteses sobre interações célula-célula e célula-matriz em microambientes tridimensionais.
- Apóia a desmistificação biológica ao fornecer modelos de tecidos fisiologicamente relevantes.
- Facilita a validação funcional de alvos por meio de sistemas padronizados e reproduzíveis de esferoides.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Prepara esferoides homogêneos e validados para triagem de compostos e desenvolvimento de ensaios posteriores.
- Melhora a reprodutibilidade do ensaio e a consistência da saída quantitativa, minimizando erros humanos e contaminação.
- Permite a produção escalonável de microtecidos tridimensionais prontos para ensaios, destinados a fluxos de trabalho de alto rendimento.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Fornece construtos teciduais tridimensionais relevantes para doenças, para modelagem translacional e estudos de biomarcadores.
- Garante continuidade desde a descoberta até a validação pré-clínica, padronizando a qualidade e o tamanho dos esferoides.
- Reduz o risco no avanço dos construtos teciduais rumo a estudos in vivo e translacionais.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este método automatizado de produção de esferoides se insere na interface entre descoberta inicial, desenvolvimento de ensaios e geração de modelos pré-clínicos, apoiando a transição da pesquisa baseada em hipóteses para engenharia de tecidos escalonável.
- Biologia da Descoberta: Apoia estudos mecanicistas ao permitir ambientes controlados de cultivo tridimensional para testes de hipóteses.
- Triagem: Fornece resultados quantitativos e reprodutíveis de esferoides para avaliação de compostos e padronização de ensaios.
- Análises: Oferece populações mensuráveis e homogêneas de esferoides para análise comparativa entre diferentes condições.
- Pesquisa Translacional: Atende às necessidades de modelagem de doenças e biomarcadores ao produzir construtos tridimensionais fisiologicamente relevantes.
- Reutilização Corporativa: Estabelece uma capacidade escalável e automatizada para uso repetido em diversos programas de P&D.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva e reduz a ambiguidade mecanicista na modelagem de tecidos tridimensionais.
- Valor Operacional: Padroniza a produção, reduz as horas de trabalho e minimiza o risco de contaminação.
- Valor Estratégico: Permite decisões mais assertivas de prosseguir ou não prosseguir e maior eficiência no uso de capital, ao apoiar fluxos de trabalho de alto rendimento e reprodutíveis.
- Impacto no Portfólio: Facilita a priorização e o avanço ajustados ao risco de projetos de engenharia de tecidos.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em cultura de células-tronco e fluxos de trabalho de bioimpressão 3D.
- Necessita de acesso a sistemas automatizados de pipetagem e infraestrutura de hidrogéis micromoldados.
- Exige padronização entre equipes dos parâmetros de software e dos protocolos de controle de qualidade.
- Pode ser necessária adaptação para diferentes tipos celulares ou formatos de hidrogel.
- A homogeneidade e a viabilidade devem ser validadas rotineiramente para garantir confiabilidade em etapas subsequentes.
Perguntas Frequentes sobre Biotecnologia Farmacêutica
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:55
Trypsinization of ASC Monolayer at Passage Three
1:45
Micro Molded Non-Adherent Agarose Hydrogel Fabrication
2:31
Bio-Fabrication of ASC Spheroids Using the Automated Pipetting System
5:48
Results: Automated Pipette System for Large-Scale Generation of ASC Spheroids
7:17
Conclusion
