Name: Método de coloração dupla para detectar pectina na interação planta-fungo (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 39 s
Description: Aprenda um método de coloração dupla com azul de algodão e vermelho de rutênio para detectar pectina em interações planta-fungo usando microscopia de luz. Esta técnica simples permite identificar estruturas fúngicas e defeitos na parede celular do patógeno em estudos histopatológicos de doenças como ferrugem do cafeeiro.

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Os autores agradecem ao Dr. Hudson W. P. de Carvalho pelo apoio para o desenvolvimento deste trabalho. Os autores também são gratos ao Laboratório de Microscopia Eletrônica ''Prof. Elliot Watanabe Kitajima'' por fornecer a instalação de microscopia leve. Os autores agradecem à Dra Flávia Rodrigues Alves Patrício por fornecer o material vegetal com lesões.

1. Preparação da solução de tamponamento e reagentes
<ol><li>Prepare 2 M tampão de cacodilato adicionando 4,28 g de cacodilato de sódio a 100 mL de água destilada e ajuste o pH para 7,25 com 0,2 N HCl.</li>
	<li>Prepare 100 mL da solução fixada Karnovsky misturando 10 mL de glutaraldeído aquoso de 25%, 10 mL de formaldeído aquoso de 10%, 25 mL de tampão de cacodilato de 2 M e 0,5 mL de 0,5 M CaCl226. Coma o volume até 100 mL com água destilada. NOTA: A solução pode ser mantida em uma geladeira por 6 meses. ATENÇÃO: A solução de tamponamento de cacodilato é tóxica; portanto, manuseie a solução fixativa em um capô de fumaça ou em uma área aberta. Evite inalar os vapores da solução e use luvas durante o manuseio.</li>
	<li>Prepare a solução de nutrientes hoagland aquosa misturando o seguinte: 3 mM Ca(NO3)2.4H 2O, 2 mM NH4H2PO4, 5 mM KH2PO4, 2 mM MgSO 4.7H2O, 9,07 mM MNSO4, 0,765 mM ZnSO4.7H 2O, 46,4 mM H3BO3, 0,09 mM Na2MoO4. H2O, 0,01 mM CuSO4, e 36 mM FeSO4.7H 2O como ferro-EDTA (ácido tetraacético de etilenodiamina)27.</li>
</ol>2. Amostras de plantas e inoculação de fungos
NOTA: Para experimentos em folhas afetadas pela ferrugem do café, cinco mudas de café arábica de 2 meses de idade. Catuaí foi cultivada e mantida em uma estufa no Centro de Energia Nuclear da Agricultura (CENA) da Universidade de São Paulo, Piracicaba, Estado de São Paulo, Brasil.
<ol><li>Cultivar plantas de café em potes de plástico de 500 mL recheados com solução aquosa de nutrientes Hoagland (pH de ~5,5) por 4 meses em uma câmara de crescimento mantida a 27 ± 3 °C com um fotoperíodo de 12 h criado por lâmpadas LED no fluxo de fótons de 250 μmol fótons s-1 m-2. Substitua a solução de nutrientes Hoagland toda semana por 4 meses.</li>
	<li>Inocular quatro folhas expandidas de cinco plantas em suas superfícies abaxial com 1 x 103 H. vastatrix uredospores seguindo o método descrito na referência28. Após a inoculação, mantenha as plantas por 48 h no escuro, cobrindo-as com um saco plástico preto. Colher as lesões 30 dias após a inoculação.</li>
	<li>Lesões características da colheita causadas pelo Cercospora coffeicola da Coffea arabica cv. Plantas obatã localizadas (coordenadas: -22.9065061269942, -47.015075902025266) no Instituto Biológico, Campinas, Estado de São Paulo, Brasil. Antes de processar a amostra, analise as lesões em um estereómico para verificar a presença do café C. coffeicola conidia. Em seguida, monte alguns slides com a conidia para confirmar a etiologia da doença22.</li>
</ol>3. Colheita de amostras, fixação e desidratação
<ol><li>Utilizando um bisturi e uma pinça, colhe uma amostra de ~10 mm2 folhas na região média da lesão (manchas amarelas; Figura 1) e imergi-lo em 30 mL de solução fixativa Karnovsky (Figura 1 e Figura 2A). A etapa de fixação pode ocorrer em uma geladeira por 48 horas.</li>
	<li>Por pelo menos quatro vezes, submia a amostra da folha a um vácuo baixo (500-600 mBar) usando uma bomba de óleo por 15 minutos cada para aumentar a permeabilidade da solução fixativa no tecido da folha. Execute esta etapa com rotação amostral (Figura 1).</li>
	<li>Após a fixação, lave a amostra da folha três vezes em tampão de cacodilato de 0,5 M (pH 7,2) diluído em água destilada por 5 min cada e depois transfira para uma série etanolilicada (30%, 50%, 70%, 90% (2x) e 100% (2x)) para 15 min a cada concentração de etanol (Figura 1 e 2B).</li>
</ol>4. Procedimento de incorporação de historesin
<ol><li>Transfira gradualmente as amostras para o methacrilato glicol (GMA) em três etapas, seguindo as instruções do fabricante. Primeiro, faça a Solução A misturando o pó GMA (1 g) com 100 mL de resina básica (kit de historesina; Tabela de Materiais) sob agitação magnética, e, em seguida, seguir os passos abaixo.<ol>
<li>Mergulhe as amostras em 1:2 Solução A: 100% etanol por 3 h.</li>
		<li>Mergulhe as amostras em 1:1 Solução A: 100% etanol por 3 h.</li>
		<li>Mergulhe as amostras em uma resina básica pura por 2-4 dias. Durante esta etapa, sujeitar as amostras a um vácuo baixo pelo menos quatro vezes por dia durante 15 minutos seguido de rotação.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Polimerização
NOTA: O processo de polimerização requer moldes plásticos de 1,2 mL, resina básica e endurecedor (ver Tabela de Materiais para os detalhes do kit comercial).
<ol><li>Misture 15 mL de Solução A (etapa 4.1) com 1 mL do endurecedor em um béquer com rotação por 2 minutos para produzir a solução de polimerização (Solução B).</li>
	<li>Coloque 1,2 mL da solução de polimerização (Solução B) em moldes plásticos. Utilizando uma picareta de madeira, transfira as amostras de folhas lesionadas de resina básica pura para a solução B (Figura 2C). Evite usar pinças, pois elas podem causar esmagamento de tecidos.</li>
	<li>Certifique-se de orientar rapidamente amostras de folhas perpendiculares aos moldes plásticos à medida que a solução B rapidamente se torna viscosa dentro de 5 minutos. Mais de uma amostra de folha lesionada pode ser colocada em um único molde. NOTA: Recomenda-se praticar o passo acima várias vezes antes de aplicar muitas amostras. Quando há muitas amostras, o tempo de polimerização é diferente entre os moldes e a orientação perpendicular das amostras de folhas pode ser difícil de alcançar.</li>
	<li>Quando a orientação perpendicular das amostras da folha for alcançada, espere por 30 minutos e, em seguida, transfira o molde plástico para uma câmara de plástico ou vidro contendo gel de sílica para evitar a umidade. Aguarde 2-3 h para polimerização.</li>
	<li>Uma vez que a resina e a amostra da folha sejam polimerizadas após o período de 2-3 h, retire o bloco resultante do molde de plástico lixando a base do bloco com um arquivo de lixamento. Em seguida, cole o bloco a um pedaço de madeira (Figura 2D).</li>
</ol>6. Secção
<ol><li>Utilizando um microtómeo rotativo equipado com lâminas de aço de 8 cm (Figura 2E), corte o bloco em seções de 5 μm de espessura. Coloque as seções em lâminas de vidro cobertas com água destilada. Transfira os slides com as seções flutuando sobre a água para uma placa quente a 40 °C para secar e promover a adesão das seções aos slides de vidro.</li>
	<li>Após a secagem (Figura 2F), rotule os slides de vidro com o nome de referência do bloco e o número do slide.</li>
</ol>7. Processo de coloração dupla
<ol><li>Cubra as seções com 2 mL de 5% de algodão azul em lactofenol (40% glicerol, 20% fenol e 20% ácido láctico na água) e aqueça-as em uma placa quente a 45 °C por 5 min (Figura 3A).</li>
	<li>Remova o excesso de corante lavando o slide três vezes em um béquer cheio de água destilada (Figura 3B-D).</li>
	<li>Mancha com 2 mL de 0,01% vermelho rutênio em água por 1 min (Figura 3E).</li>
	<li>Remova o excesso de corante lavando o slide três vezes em um béquer cheio de água destilada (Figura 3F,G).</li>
	<li>Coloque uma gota de água destilada sobre as seções e cubra as seções com um deslizamento de cobertura de 24 mm x 60 mm para realizar a análise de microscopia leve.</li>
</ol>

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<li>Lecker, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+lactophenol+cotton+blue+slide+mounts%5BTitle%5D)+AND+%22Community+Eye+Health+Journal%22%5BJournal%5D)">Preparation of lactophenol cotton blue slide mounts.</a> Community Eye Health Journal. 12 (30), 24(1999).</li>
<li>Whitakaer, F. C. S., Denison, F. C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lactic+acid+in+wool+dyeing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Society+of+Dyers+and+Colourists%22%5BJournal%5D)">Lactic acid in wool dyeing.</a> Journal of the Society of Dyers and Colourists. 98, 103(1895).</li>
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</ol>

Os autores não declaram conflitos de interesse.

O presente trabalho introduz um teste histoquímico alternativo de dupla coloração para investigar a composição da pectina das paredes celulares que encapsula a haustoria em um pathosystem biotrófico. O objetivo também é demonstrar a eficácia do método para detectar fungos necrotróficos e alterações na parede celular induzidas por ele. Aqui, a pectina das paredes celulares do café parenchyma pode encapsular tanto o pescoço quanto o haustorium do fungo ferrugem Hemileia vastatrix. Silva et al. também descreveram e...

Mecanismos de defesa de parede celular nas plantas são cruciais para conter a infecção fúngica. Estudos têm relatado mudanças na espessura e composição da parede celular desde o séculoXIX 1,2. Essas alterações podem ser induzidas por um patógeno fúngico que estimula a formação de uma papila, que impede que fungos entrem na célula ou possam ser usados para encapsular a hifa para isolar o protoplasto celular hospedeiro da haustoria fúngica. A produção de uma barreira dinâmica de parede celular (ou seja, papila e um haustorium totalmente envolto) é importante para promover a resistência à planta3. Estudos histopatológicos sobre doenças relacionadas ao fungo têm investigado a ocorrência desses mecanismos e descreveram os polímeros de parede celular, celulose, hemicellulose (arabinoxilans), e callose como mecanismos de resistência ao ataque fúngico 4,5,6,7.
A parede celular é a primeira barreira contra o ataque microorganismal, prejudicando a interação planta-fúngica. Polissacarídeos pecéticos compõem a parede celular e respondem por cerca de 30% da composição da parede celular em células primárias de plantas eudicot, nas quais os homogalacturonans são o polímero mais abundante (cerca de 60%)8. Os Golgi secretam compostos complexos de pectina que compõem as cadeias de ácido galacturônico, que podem ou não ser metilados 8,9. Desde 2012, a literatura aponta que o grau de esterificação de metila pectina é fundamental para determinar a compatibilidade durante a infecção por enzimas pecíticas microbianas 10,11,12. Assim, são necessários protocolos para verificar a presença e distribuição de compostos pecticos em sistemas de pathos vegetais-fúngicos.
Várias técnicas têm sido usadas para detectar o encapsulamento de papilas ou haustoria. Os métodos de referência utilizados são a microscopia eletrônica de transmissão (TEM) de tecido fixo e microscopia leve de tecidos vivos e fixos. Em relação ao TEM, diversos estudos têm demonstrado o papel estrutural das apposições de parede celular na resistência fúngica 13,14,15,16, e que o uso de lectinas e anticorpos é um método intrincado para localizar polímeros de carboidratos 16. No entanto, estudos mostram que a microscopia leve é uma abordagem importante e que as ferramentas histoquímicas e imunohistoquímicas permitem uma melhor compreensão da composição da papila e do haustoriumencasement 6,7.
Os fungos patogênicos apresentam dois tipos principais de estilos de vida: biotrófico e necrotrófico. Fungos biotróficos dependem de células vivas para sua nutrição, enquanto fungos necrotróficos matam as células hospedeiras, e depois vivem nos tecidos mortos17. Na América Latina, a ferrugem da folha de café, causada pelo fungo Hemileia vastatrix, é uma doença importante nas culturas de café18,19. A hemileia vastatrix apresenta um comportamento biotrófico e, entre as alterações estruturais observadas em espécies ou cultivares de café resistentes, foi relatada uma resposta de hipersensibilidade, deposição de calose, celulose e lignina nas paredes celulares, bem como hipertrofiacelular 14. Para o conhecimento dos autores, a literatura não informa informações sobre a importância da pectina na resistência à ferrugem do café. Por outro lado, fungos necrotróficos que causam a cercosporiose visam a pectina através de um conjunto de enzimas associadas à degradação da parede celular, como pectinases e poligalacturonase20. A cercosporiose no café, causada pelo fungo Cercospora coffeicola, também é uma grande ameaça às culturas de café21,22. Este fungo causa lesões necróticas em folhas e frutos. Após a penetração, C. coffeicola coloniza tecidos vegetais através de vias intracelulares e intercelulares 23,24,25.
O presente protocolo investiga a presença de estruturas fúngicas e pectina nas paredes celulares. Este protocolo é útil para identificar a resposta vegetal associada à pectina (manchada com corante vermelho rutênio, que é específica para grupos ácidos de ácidos poliurônicos de pectina), induzida pelo hospedeiro em uma interação biotrófica com fungo. Também ajuda a verificar o efeito de fungos necrotróficos na degradação das paredes das células pecíticas. Os resultados atuais indicam que o método de dupla coloração é eficaz para discriminar estruturas e a fase reprodutiva dos fungos.

<table><tbody><tr><td>Lâminas DB80 HS</td><td>Leica</td><td>14035838383</td><td>Seccionamento</td></tr><tr><td>Cacodilato tampão</td><td>EMS</td><td># 11652</td><td>Fixação</td></tr><tr><td>Algodão Azul Lactofenol</td><td>Metaqu&iacute; mica</td><td>70SOLSIG024629</td><td>Coloração</td></tr><tr><td>Formaldeído</td><td>EMS</td> <td># 15712</td><td>Fixação</td></tr><tr><td>Glutaraldeído</td><td>EMS</td> <td># 16216</td><td></td></tr><tr><td>Fixação Historesin Kit</td><td>Technovit / EMS</td> <td># 14653</td><td>Historesin para incorporação</td></tr><tr><td>Placa quente</td><td>Dubesser</td><td>SSCD25X30-110V</td><td>Microscopia de coloração</td></tr><tr><td></td><td>Zeiss</td> <td># 490040-0030-000</td><td>Captura de imagem</td></tr><tr><td>Micrótomo (Leica RM 2540)</td><td>Leica</td><td>149BIO000C1 14050238005</td><td>Seccionamento</td></tr><tr><td>Bandeja de copo de moldagem de plástico</td><td>EMS</td><td>10176-30</td><td>Coloração</td></tr><tr><td>Vermelho de rutênio</td><td>LABHouse</td><td>#006004</td><td>Software de coloração</td></tr><tr><td>Axion Vision</td><td>Zeiss</td><td>#410130-0909-000 Captura de</td><td>imagem</td></tr><tr><td>Bomba de vácuo</td><td>Prismatec</td><td>131 TIPO 2 V.C.</td><td>fixação</td></tr></tbody></table>

método de coloração dupla para detectar pectina na interação planta-fungo

Double-Staining Method to Detect Pectin in Plant-Fungus Interaction

As células vegetais utilizam diferentes mecanismos estruturais, constitutivos ou induíveis, para se defenderem da infecção fúngica. Encapsulamento é um mecanismo indutível eficiente para isolar a haustoria fúngica do protoplasto celular vegetal. Por outro lado, a pectina, um dos componentes poliméricos da parede celular, é alvo de várias enzimas pecotólicas em interações necrotróficas. Aqui, é apresentado um protocolo para detectar pectina e hifas fúngicas através de microscopia óptica. O encapsulamento rico em pectina nas células das folhas de café infectadas pelo fungo ferrugem Hemileia vastatrix e a modificação da parede celular mesófila induzida pelo Cercospora coffeicola são investigados . As amostras de folhas lesionadas foram fixadas com a solução Karnovsky, desidratadas e embutidas em metacrilato glicol por 2-4 dias. Todas as etapas foram seguidas pelo bombeamento a vácuo para remover o ar nos espaços intercelulares e melhorar o processo de incorporação. Os blocos incorporados foram seccionados em seções de 5-7 μm de espessura, que foram depositados em um toboágua de vidro coberto com água e, posteriormente, aquecidos a 40 °C por 30 minutos. Em seguida, os slides foram duplamente manchados com 5% de algodão azul em lactofenol para detectar o fungo e 0,05% vermelho rutênio na água para detectar pectina (grupos ácidos de ácidos poliurônicos de pectina). Haustoria fúngica de Hemileia vastatrix foram encontrados encapsulados por pectina. Na cercosporiose do café, foram observadas células de mesofílico exibindo dissolução de paredes celulares, e hifas intercelulares e conidioforos. O método aqui apresentado é eficaz para detectar uma resposta associada à pectina na interação planta-fungo.

A coloração de lactofenol azul de algodão na seção incorporada pela GMA revelou a presença de várias estruturas fúngicas entre e dentro de células de mesófilo de café em interações fúnequias biotróficas e nefróficas.
No pathosystem biotrófico, quando manchado usando o método de coloração dupla, hemileia vastatrix hiphae contendo paredes celulares e o denso teor de protoplasto aparecem em azul escuro em parenchyma esponjoso e palisade (Figura 4A,B<...

Este protocolo descreve um método microscopical para detectar pectina na interação café-fungo.

Método de coloração dupla para detectar pectina na interação planta-fungo

Plant cells use different structural mechanisms, either constitutive or inducible, to defend themselves from fungal infection. Encapsulation is an ...

Este protocolo é significativo, pois permite identificar a interação planta-fungo. Além de colorir a pectina, também demonstra defeitos no polímero da parede celular do patógeno e permite a identificação de estruturas de fungos. Esta técnica simples e descomplicada pode ser realizada usando microscopia leve e não requer nenhum equipamento caro, como o microscópio eletrônico de varredura.Além disso, é uma técnica rápida que obtém uma excelente distinção de estruturas vegetais para estudos histopatológicos. A técnica identifica a interação planta-fungo. Assim, colabora para o diagnóstico das doenças causadas por fungos biotróficos e necrotróficos, como ferrugem do café e cercosporiose.Para começar, colher e aproximadamente 10 milímetros quadrados de amostra de folha na região média da lesão usando um bisturi e pinça, e imergi-lo em 30 mililitros de solução fixa de Karnovsky. Sujeitar a amostra de folha a um baixo vácuo de 500 a 600 milibar por 15 minutos usando uma bomba de óleo, pelo menos quatro vezes para aumentar a permeabilidade da solução fixativa no tecido da folha. Após a fixação, lave a amostra da folha três vezes em tampão de cacodilato de 0,5 M diluído em água destilada po

double-staining-method-to-detect-pectin-in-plant-fungus-interaction

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Este vídeo demonstra um método de coloração dupla usando vermelho de rutênio e lactofenol azul de algodão para visualizar pectinas e quitinas durante as interações planta-fungo em uma planta de ferrugem do café. O procedimento ajuda a entender os mecanismos de defesa das plantas durante infecções fúngicas.

Método de coloração dupla: uma técnica para visualizar as interações planta-fungo usando vermelho de rutênio e lactofenol azul de algodão

Este vídeo descreve um método para cultivar e analisar qualitativamente biofilmes bacterianos em hifas fúngicas usando microscopia. Os biofilmes bacterianos freqüentemente se formam em superfícies fúngicas e envolvem vários processos de interação bactéria-fungo, como cooperação metabólica, competição ou predação.

Um método de preparação de amostras para visualizar bactérias formadoras de biofilme em hifas fúngicas

Este vídeo demonstra uma técnica de imunocoloração para localizar proteínas arabinogalactâcticas (AGPs) e pectinas em tecidos vegetais. Seções de tecido vegetal fixas e embebidas em resina são coradas com anticorpos primários e secundários fluorescentes específicos para AGP e pectina e um corante fluorescente de ligação à celulose para revelar sua colocalização específica do tecido na parede celular.

Imunolocalização de proteínas e pectinas de arabinogalactana em tecido vegetal

A composição da parede celular vegetal varia entre os tipos de tecido e pode incluir lignina, celulose, hemiceluloses e pectina. Várias técnicas de coloração foram desenvolvidas para visualizar as diferenças no nível do tipo de célula. Este artigo é uma compilação de técnicas de coloração da parede celular comumente usadas.

Coloração histoquímica de<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Celular Secundária parede Elements

Corantes fluorescentes vitais são ferramentas essenciais para análises de imagens de células vivas na biologia moderna das células fúngicas. Este artigo detalha a aplicação de corantes fluorescentes estabelecidos e menos conhecidos para rastrear a dinâmica da membrana plasmática, endo-/exocitose e mordogênese da parede celular em fungos filamentous.

Aplicação de corantes fluorescentes seletivos da membrana e da parede de pilha para a imagem latente da Viver-pilha de fungos de Filamentous

Este protocolo descreve em detalhes como o material vegetal para imunolocalização de proteínas e pectinas arabinogalactanas é fixado, embutido em uma resina acrílica hidrofílica, seccionada e montada em lâminas de vidro. Mostramos que epítopos relacionados à parede celular serão detectados com anticorpos específicos.

Imunolocalização fluorescente de proteínas árabes e pectinas na parede celular de tecidos vegetais

O protocolo aqui descreve os métodos para a avaliação dos padrões de colonização micorrízica arbuscular e a estratégia em raízes para duas espécies: Zea mays e Festuca rubra. O uso do método MycoPatt permite o cálculo de parâmetros, a conversão de estruturas micorrízicas em dados digitais e o mapeamento de sua posição real nas raízes.

Mapas micorrízicos como ferramenta para explorar padrões de colonização e estratégias fúngicas nas raízes de Festuca rubra e zea mays

Este protocolo visa fornecer procedimentos detalhados para coleta, fixação e manutenção de amostras de plantas micoheterotróficas, aplicando diferentes técnicas de microscopia, como microscopia eletrônica de varredura e transmissão, microscopia de luz, confocal e fluorescência para estudar a colonização fúngica em tecidos e sementes geridas com fungos micorrizais.

Técnicas de Microscopia para Interpretação da Colonização Fúngica em Tecidos de Plantas Micoheterotróficas e Germinação Simbiótica de Sementes

Devido à opacidade do solo, as interações entre seus micróbios constituintes não podem ser facilmente visualizadas com resolução celular. Aqui, são apresentadas duas ferramentas microfluidas, que oferecem novas oportunidades para investigar interações fúngicas-microbianas. Os dispositivos são versáteis e simples de usar, permitindo alto controle espesso e imagens de alta resolução no nível celular.

Ferramentas microfluídicas para sondar interações fúngicas-microbianas no nível celular

O presente artigo tem como objetivo fornecer protocolos detalhados e adequados para o isolamento de fungos endofíticos associados a plantas, preservação a longo prazo de isolados, caracterização morfológica e extração de DNA total para posterior identificação molecular e análises metagenômicas.

Isolamento, caracterização e extração de DNA total para identificação de fungos endofíticos em plantas micoheterotróficas

Este relatório descreve os métodos fundamentais usados para cultivar e manipular experimentalmente a alga estreptófita unicelular, Penium margaritaceum. Ele também fornece protocolos fundamentais de imagens baseadas em microscopia, incluindo marcação de células vivas com anticorpos monoclonais e outras sondas fluorescentes e microscopia eletrônica de varredura.

Protocolos de Triagem Experimental, Imunocitoquímica e Técnicas de Imagem Baseadas em Microscopia para Penium margaritaceum

Aprenda um método de coloração dupla com azul de algodão e vermelho de rutênio para detectar pectina em interações planta-fungo usando microscopia de luz. Esta técnica simples permite identificar estruturas fúngicas e defeitos na parede celular do patógeno em estudos histopatológicos de doenças como ferrugem do cafeeiro.

Método de coloração dupla para detectar pectina na interação planta-fungo

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