Name: Cauterização em círculo completo do plexo vascular limbal no glaucoma induzido cirurgicamente em roedores (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 10 s
Description: Aprenda a cauterização completa do plexo vascular limbal para induzir hipertensão ocular em ratos. Este modelo reprodutível e de baixo custo permite estudar a neurodegeneração glaucomatosa e a fisiopatologia ocular in vivo.

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Agradecemos aos nossos técnicos de laboratório José; Nilson dos Santos, Daianne Mandarino Torres, José Francisco Tibúrcio, Gildo Brito de Souza e Luciano Cavalcante Ferreira. Pesquisa financiada pela FAPERJ, CNPq e CAPES.

Todos os procedimentos foram realizados de acordo com a Declaração para o Uso de Animais em Pesquisa Oftalmológica e Visual da Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) e aprovada pelo Comitê de Ética no Uso de Animais em Experimentação Científica do Centro de Ciências da Saúde da Universidade Federal do Rio de Janeiro (protocolo 083/17). No presente trabalho, foram utilizados ratos Lister Hooded, de ambos os sexos, com idade entre 2-3 meses e peso de 180-320 g. No entanto, o procedimento pode ser adaptado em diferentes linhagens de ratos de várias faixas etárias.
1. Cirurgia de hipertensão ocular e seguimento clínico
<ol><li>Animais domésticos em ambiente de temperatura controlada e ciclo claro/escuro de 12 h (6h: luz acesa/ 18h: luz apagada) com alimento padrão peletizado irradiado por radiação gama (Nuvilab® CR-1, Quimtia S/A, Brasil) e água (filtro triplo, com carvão ativado atóxico) disponível ad libitum.</li>
	<li>Preparar uma calda de coquetel anestésico composta por três partes de cloridrato de cetamina a 10% e uma parte de cloridrato de xilazina a 2% (diluente: água estéril).</li>
	<li>Conter suavemente o animal segurando a pele dorsal e induzir anestesia pela administração intraperitoneal de 1 μL/g de peso corporal da mistura (cetamina: 75 mg/kg; xilazina: 5 mg/kg). Verifique se há anestesia adequada após aproximadamente 5 min, realizando uma resposta de pinça do dedo.</li>
	<li>Anestesiar topicamente ambas as superfícies oculares instilando colírio de proximetacaína a 0,5%. Aguarde 30-60 s e remova a solução restante da face anterior do globo, tocando suavemente a conjuntiva bulbar nasal ou lateral com um pequeno cotonete estéril.</li>
	<li>Medir a PIO basal dos olhos controles experimentais e contralaterais colocando o animal em decúbito ventral na bancada, de modo que a superfície corneana seja facilmente acessível à ponta do tonômetro.</li>
	<li>Use o tonômetro portátil de aplanação ou rebote (Figura 1A). Posicione a ponta do tonômetro de forma que ela toque levemente a zona corneana central perpendicularmente. Adquira e faça uma média de 3 a 5 médias confiáveis geradas por máquinas. Cada média é calculada automaticamente pelo aparelho após seis medições individuais bem-sucedidas.<ol><li>Carregue o tonômetro de rebote com uma sonda e pressione o botão de medição uma vez para ligá-lo, enquanto coloca a ponta do dispositivo para cima, a fim de evitar que a sonda caia. Após ligar, o visor mostrará 00 indicando que o equipamento está pronto para medir.</li>
		<li>Posicione o aparelho com a ponta da sonda a uma distância de 1-4 mm da córnea e adquira as medidas pressionando rápida e cuidadosamente o botão de medição, sem movimentar o equipamento. Cada medida bem-sucedida é identificada por um bipe curto e, após seis vezes, a média é exibida na tela do dispositivo. NOTA: Apesar da longa experiência com tonômetro de aplanação, para otimizar todo o procedimento os autores recomendam o uso de um tonômetro de rebote, que facilita a obtenção de medidas confiáveis da PIO.</li>
	</ol></li>
	<li>Colocar o animal em decúbito lateral leve sob estereomicroscópio e planejar cuidadosamente a cirurgia inspecionando o olho experimental em aumento de 40x. Não se esqueça de manter o olho de controle contralateral lubrificado durante o procedimento, instilando uma gota de carmelose sódica ou hialuronato de sódio.</li>
	<li>Com o auxílio de pinças curvas, empurre suavemente o globo ocular experimental de modo a expor a vasculatura que envolve 360° do limbo13. Com a outra mão, cauterizar suavemente os vasos ao redor da córnea com um cautério oftálmico de baixa temperatura (1.300 °F; Bovie Medical, EUA) (Figura 1B-E). OBS: O referido cautério possui ponta arredondada que deve tocar longitudinalmente a vasculatura do limbo.</li>
	<li>Cuidado para não cauterizar a periferia corneana, pois isso pode resultar em opacificação corneana pós-operatória, o que impossibilita a avaliação in vivo da função retiniana.</li>
	<li>Observar o surgimento de pequenas marcas circulares de cauterização no limbo escleral, a obliteração da vasculatura limbal e a dilatação pupilar no olho operado, sinais de sucesso do procedimento cirúrgico. OBS: Como a vasculatura limbal de ratos e camundongos é anatomicamente semelhante13,24 e o cautério utilizado possui ponta pequena e suave, este protocolo pode funcionar também para o olho de camundongo sem qualquer adaptação.</li>
	<li>Após a cirurgia, verificar a PIO pós-operatória imediata em ambos os olhos, como descrito no passo 1.5.</li>
	<li>Aplicar uma gota de acetato de prednisolona oftálmica (1,2 mg/mL) e mantê-la em contato com a superfície anterior do olho experimental por cerca de 40 s, substituindo-a por uma pomada oftálmica de antibióticos (cloridrato de oxitetraciclina 30 mg/g mais polimixina B 10.000 U/g; ou ciprofloxacina 3,5 mg/g). Realizar injeção intramuscular de cloridrato de tramadol (dose única; 2 mg/kg) para prevenir dor após o procedimento.</li>
	<li>Acompanhe de perto a recuperação do animal da anestesia, preferencialmente em um ambiente quente, como uma almofada de aquecimento ou dentro de sua gaiola de alojamento com cama adequada. Preste atenção ao padrão respiratório.</li>
	<li>Realizar acompanhamento clínico diário do olho experimental com medicações tópicas compostas por anti-inflamatório não esteroidal (AINE, por exemplo, colírio cetorolaco trometamol 0,5%) e pomada antibiótica (preferencialmente a mesma utilizada imediatamente após a cirurgia). NOTA: O uso de AINEs em vez de colírios anti-inflamatórios esteroidais é recomendado porque este último pode induzir OHT e é regularmente aplicado para modelos de glaucoma induzido por glicocorticoides em roedores.<ol><li>Sob sedação leve (cetamina: 18,75 mg/kg; xilazina: 1,25 mg/kg), medir a PIO preferencialmente no mesmo período do dia, para evitar viés devido à flutuação fisiológica da PIO circadiana.</li>
		<li>Durante o exame ocular, observe intercorrências clínicas raras, como hifema, fibrose corneana ou adelgaçamento escleral associado ao prolapso uveal. Edema de córnea, quemose e hiperemia conjuntival são comuns, mas temporários.</li>
		<li>Observar recuperação clínica completa por volta do 7º dia de pós-operatório. A revascularização do limbo geralmente começa nos primeiros dois dias após a cirurgia, de acordo com o retorno gradual esperado da PIO aos valores basais.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Análise da resposta optomotora (OMR)
OBS: Para este procedimento, foi utilizado um sistema específico25.
<ol><li>Organize quatro monitores de computador em um quadrilátero, que delimitam uma arena com uma plataforma no meio. Nos monitores, exibe a imagem de um cilindro virtual com grades senoidais orientadas verticalmente (listras alternadas em preto e branco), girando em torno da plataforma a uma velocidade fixa (12 graus/s) e contraste (100%).</li>
	<li>Posicione uma câmera de vídeo acima da plataforma, permitindo que o experimentador observe os movimentos do animal. Realizar o teste em condições fotópicas e definir o software preferencialmente no modo manual/separado, a fim de avaliar cada olho separadamente.</li>
	<li>Permita que os animais se habituem por aproximadamente 2 min na plataforma. Mantenha o cursor da mira vermelha no quadro de vídeo entre os olhos do animal em movimento livre, pois indica o centro do cilindro virtual (Figura 1G)25.</li>
	<li>Observar a TMO, que consiste em um rastreamento reflexivo da cabeça e pescoço do animal provocado pelas grades rotatórias. Teste as vias visuais esquerda e direita girando as direções das grades de onda senoidal no sentido horário e anti-horário, respectivamente.<ol><li>Inicialmente apresentam um estímulo com baixa frequência espacial (0,042 ciclos/grau). Em seguida, incremente a frequência progressivamente até que o movimento de rastreamento não seja mais notado. A maior frequência espacial em que uma OMR clara é eliciada corresponde à frequência espacial limiar do olho avaliado.</li>
		<li>Se o animal eventualmente cair da plataforma durante o exame, devolva-o imediatamente à plataforma e retome o teste.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Registro do eletrorretinograma padrão (PERG)
OBS: O eletrorretinograma foi registrado utilizando-se um sistema específico para processamento de sinais e software relacionado para armazenamento e análise das formas de onda.
<ol><li>Anestesiar profundamente os animais por injeção intramuscular de cloridrato de cetamina e cloridrato de xilazina (75 mg/kg e 5 mg/kg, respectivamente). A anestesia profunda (plano cirúrgico) diminui as chances de artefatos por movimentos musculares involuntários ou fontes alternativas de ruído durante o exame. Verifique se há anestesia adequada realizando uma resposta de pinça do dedo do pé. LEGENDA: Os agentes anestésicos citados não afetam a amplitude da resposta26. Como uma pequena agulha inserida na córnea foi usada como eletrodo ativo, a anestesia intramuscular é preferida em vez da intraperitoneal, pois é mais fácil de reinjetar caso o rato necessite de uma dose de reforço (1/2 da dose inicial), com menores chances de modificar a posição do eletrodo e, assim, levando a registros mais reprodutíveis durante todo o experimento, que pode durar até 60 min.</li>
	<li>Anestesiar topicamente a córnea com uma gota de cloridrato de proximetacaína 0,5% e manter o olho umedecido com lubrificantes oftálmicos.</li>
	<li>Inserir cuidadosamente o eletrodo ativo (agulha de aço inoxidável 0,25 mm × 15 mm) na periferia temporal da córnea. Além disso, inserir os eletrodos de referência e terra (agulha de aço inoxidável 0,4 mm × 37 mm) no tecido subcutâneo do canto temporal ipsilateral e em um dos membros pélvicos, respectivamente (Figura 1I).</li>
	<li>Para o PERG, ajuste o estímulo para um xadrez reservatório preto e branco, alternando em 15 reversões/s com luminância média constante (250 cd/m2). Defina o filtro passa-banda para 1 Hz-100 Hz. NOTA: O estímulo de reversão rápida gera o PERG em estado estacionário, um sinusóide estável e reprodutível que reúne o componente de onda mais provavelmente associado à resposta bioelétrica RGC: a deflexão NII do PERG de estado transitório.</li>
	<li>Posicionar o animal a 20 cm da tela de estímulo (monitor LCD 0,58 m; Figura 1I), monitore a linha de base do sinal e inicie a aquisição do PERG pressionando o botão Analysis no sistema de aquisição.</li>
	<li>Durante o procedimento, mantenha os animais adaptados à luz do ambiente (luz branca de ~140 lux). Aqui, seis frequências espaciais distintas (em ciclos por grau: 0,018, 0,037, 0,073, 0,146, 0,292, 0,585) foram apresentadas em sequência aleatória. NOTA: O software usado para processamento de sinais executa automaticamente a média. A média de 200-300 ondas individuais foi considerada adequada para se destacar do ruído e analisar a amplitude das ondas.</li>
</ol>4. Quantificação de somas de células ganglionares da retina
NOTA: O procedimento a seguir é para quantificação de somas RGC, com base na coloração imunohistoquímica de montagens planas da retina com um anticorpo contra a proteína de domínio homeobox/POU 3A específica do cérebro (Brn3a).
<ol><li>Submeter animais de experimentação à eutanásia por luxação cervical, precedida de inalação de dióxido de carbono para induzir inconsciência.</li>
	<li>Imediatamente após a eutanásia, dissecar ambos os olhos sob um microscópio estéreo, usando pinça dentada e tesoura curva.</li>
	<li>Realizar dissecção cuidadosa de modo que tanto a porção distal dos músculos extraoculares quanto a carúncula permaneçam aderidas ao globo ocular, pois são marcos importantes para a orientação topográfica da retina (descritos no passo 4.5). Tente salvar um trecho do nervo óptico ligado ao globo o maior tempo possível para análises futuras.</li>
	<li>Após a enucleação, colocar os olhos em uma solução de 1 mL de paraformaldeído a 4% (PFA 4%) em tampão fosfato 0,1 M (PBS) e mantê-lo por 24 h para fixação química adequada.</li>
	<li>Separe a retina do resto dos tecidos oculares.<ol><li>Sob um microscópio dissecante, coloque o globo ocular em uma placa de Petri coberta com PBS 1x e preste atenção a pontos de referência importantes, como carúncula nasal, fissuras coroides e impressões esclerais de vórtices para orientação topográfica adequada27.</li>
		<li>Penetrar na câmara anterior a partir da córnea central usando pinça dentada e tesoura curva (westcott). Realizar dois cortes radiais na face superior (dorsal) da esclera, em direção ao forame escleral do nervo óptico, de modo a delimitar o quadrante dorsal do globo ocular.</li>
		<li>Separe a córnea do resto do globo terrestre através de um corte longitudinal de 360° no limbo escleral. Retirar o cristalino e a íris e delimitar o quadrante dorsal da retina utilizando as mesmas demarcações radiais esclerais descritas acima (passo 4.5.2).</li>
		<li>Desprender cuidadosamente o tecido retiniano da coroide e esclera, evitando lacerações aleatórias por todo o tecido e eventual perda topográfica de orientação.</li>
		<li>Separe o corpo ciliar da ora serrata da retina. Remova cuidadosamente o corpo vítreo restante do copo da retina usando uma pinça curva não dentada mais uma tesoura curva (puxe o vítreo e disseque-o perto da membrana limitante interna) e uma pequena escova. NOTA: A remoção do humor vítreo é um passo importante para obter um sinal imuno-histoquímico forte e limpo.</li>
	</ol></li>
	<li>Transfira retinas isoladas para uma placa de cultura de 24 poços (uma retina por poço) contendo 1 mL de 1x PBS e mantenha a retina interna voltada para cima.</li>
	<li>Permeabilizar o tecido lavando 3x por 10 min com um tensoativo não iônico 0,5% diluído em 1x PBS (0,3 mL). Em seguida, manter o tecido agitando suavemente em albumina de soro bovino (BSA) a 5% em surfactante não iônico a 2% e 1x PBS (solução bloqueadora; 0,25 mL) por 60 min à temperatura ambiente.</li>
	<li>Durante a etapa 4.7, preparar a solução de anticorpos primários Brn3a diluindo 1:200 em tensoactivo não iónico a 0,5% e 1x PBS mais BSA a 5% e armazená-la a 4 °C.</li>
	<li>Após 60 minutos de bloqueio tecidual, incubar as retinas em 0,2 mL de solução de anticorpos primários a 4 °C por 72 h com agitação suave.</li>
	<li>Lavar o tecido 3x por 10 min com 1x PBS, em seguida, incubar o tecido por 2 h à temperatura ambiente em 0,2 mL da solução de anticorpos secundários diluída 1:750 em 1x PBS mais 5% BSA.</li>
	<li>Além disso, incubar o tecido por 10 min em solução de contracoloração nuclear para coloração de núcleos fluorescentes. Concluir a imunohistoquímica com uma etapa final de lavagem com 1x PBS (0,3 mL) repetido 3x.</li>
	<li>Transfira retinas com o auxílio de duas pequenas escovas para lâminas de microscópio de vidro, mantendo o lado vítreo para cima. Posicionar o quadrante dorsal da retina para cima sobre as lâminas do microscópio (previamente delimitado no passo 4.5.3). Realizar mais dois cortes radiais em direção à cabeça do nervo óptico para delimitar os outros 3 quadrantes (nasal, ventral e temporal). Observação : as dimensões de corte não são fixas. Eles não devem ser muito curtos que prejudiquem um achatamento eficiente da retina na lâmina e não devem ser muito longos para que atinja o forame do nervo óptico e separe completamente o quadrante retiniano delimitado do resto do tecido.</li>
	<li>Finalmente, aplique 0,2 mL de meio de montagem antifade em uma lamínula de vidro e coloque-a na retina plana para análise microscópica do tecido. Para estimar a densidade de RGCs, examine as montagens planas sob um microscópio confocal de epifluorescência usando uma objetiva de 40x/1,3.</li>
	<li>Para cada quadrante da retina, tire oito fotos: duas da retina central (~0,9 mm do disco óptico), três da retina média (~2,0 mm do disco óptico) e três da retina periférica (~3,7 mm do disco óptico), totalizando 32 fotos por retina. Use o software FIJI para contar células positivas para Brn3a e estimar a densidade celular média.</li>
</ol>5. Exame do nervo óptico
<ol><li>Após a eutanásia e enucleação do globo ocular (passos 4.1-4.3), remover o segmento proximal da porção intraorbital do nervo óptico (1-2 mm), incluindo parte da porção intraocular, e colocar imediatamente as amostras em frascos/tubos contendo 0,2-0,3 mL de fixador a frio (solução de glutaraldeído a 2,5% em tampão cacodilato de sódio 0,1 M (pH 7,4)) por 2 h. NOTA: As seguintes etapas para o processamento do nervo óptico são executadas nos mesmos frascos / tubos da etapa 5.1</li>
	<li>Lave o material 3x por 5 min com tampão cacodilato de sódio 0,1 M frio. Tecido pós-fixação por 1 h sob agitação suave em solução de tetróxido de ósmio a 1,0% em ferrocianeto de potássio a 0,8% e cloreto de cálcio 5 nM diluído em tampão cacodilato de sódio 0,1 M a 4 °C (0,1-0,2 mL).</li>
	<li>Lavar fragmentos de nervo óptico 3x por 5 min com tampão cacodilato de sódio 0,1 M frio e, posteriormente, com água destilada fria, 3x por 1 min. Manter o material durante a noite sob agitação suave em uma solução de acetato de uranila a 1,0% em água destilada para coloração a 4 °C (0,1-0,2 mL). Lave os fragmentos 3x com água destilada fria.</li>
	<li>Desidratar progressivamente o tecido com uma série graduada de acetona (0,5 mL cada), com posterior substituição das seguintes diluições em água destilada: incubação 2x 7 min em acetona gelada a 15%; 2x 7 min de incubação em acetona gelada a 30%; 2x 7 min de incubação em acetona gelada a 50%; 2x 7 min de incubação em acetona gelada a 70%; 2x 7 min de incubação em acetona gelada a 80%; 2x 7 min de incubação em acetona gelada a 90%; 2x 15 min de incubação em acetona 100% à temperatura ambiente (TR).</li>
	<li>Realizar 3 etapas de infiltração/incorporação, com posterior substituição das seguintes soluções: 1 parte de resina epóxi: 2 partes de acetona (volume total: 0,5 mL), em TR por 12 h; 1 parte de resina epóxi: 1 parte de acetona (volume total: 0,5 mL), em TR por 12 h; 2 partes de resina epóxi: 1 parte de acetona (volume total: 0,5 mL), em TR por 12 h. Finalmente, infiltrar-se o tecido em resina epóxi pura em RT por 24 h.</li>
	<li>Retire as amostras do porta-amostras, transfira-as para moldes de incorporação e deixe polimerizar por 48 h a 60 °C. Cortar cortes transversais semifinos (300-400 nm) dos fragmentos do nervo óptico usando um ultramicrótomo, coletá-los e transferi-los para uma lâmina de vidro do microscópio. Cortes coratórios com azul de toluidina e imagem com microscópio óptico em aumento de 100x.</li>
	<li>Para análise ultraestrutural, realizar cortes transversais ultrafinos (70 nm), coletá-los em grades de cobre e corá-los com acetato de uranila e citrato de chumbo. Examine as seções em um microscópio eletrônico de transmissão.</li>
</ol>

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</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

A cauterização do plexo limbal (LPC) é um novo modelo pós-trabecular com a vantagem de ter como alvo estruturas vasculares de fácil acesso, não necessitando de dissecção conjuntival outenonal 17,28. Diferentemente do modelo de cauterização de veias vórtices, um renomado modelo de OHT baseado no comprometimento cirúrgico da drenagem venosa coroide, não se espera que a congestão venosa influencie a elevação da PIO no modelo LPC, uma vez que as veias límbicas estão ...

A literatura médica entende o glaucoma como um grupo heterogêneo de neuropatias ópticas caracterizadas por degeneração progressiva das células ganglionares da retina (CGRs), dendritos, soma e axônios, resultando em escavação estrutural (escavação) do disco óptico e deterioração funcional do nervo óptico, levando à amaurose em casos não controlados pela interrupção da transmissão de informações visuais do olho para océrebro1. Atualmente, o glaucoma é a causa mais comum de cegueira irreversível em todo o mundo, com previsão de atingir aproximadamente 111,8 milhões de pessoas em 20402, afetando profundamente a qualidade de vida (QV) dos pacientes e levando a importantes preocupações socioeconômicas3.
A pressão intraocular (PIO) elevada é um dos mais importantes e o único fator de risco modificável para o desenvolvimento e progressão do glaucoma. Dentre os múltiplos tipos de glaucoma, todos, exceto o glaucoma de tensão normal (GNT), estão associados à PIO elevada em algum momento da história clínica da doença. Apesar dos notáveis avanços clínicos e cirúrgicos para atingir a PIO e retardar ou interromper a progressão da doença, os pacientes ainda perdem a visão devido ao glaucoma 4,5. Portanto, o conhecimento aprofundado da fisiopatologia complexa e multifatorial dessa doença é imperativo para o desenvolvimento de tratamentos mais eficazes, especialmente para fornecer neuroproteção aos CGRs.
Entre uma variedade de abordagens experimentais para a compreensão dos mecanismos da doença, os modelos animais baseados em hipertensão ocular (OHT) mais se assemelham ao glaucoma humano. Os modelos de roedores são particularmente úteis por serem de baixo custo, fácil manuseio, manipulação genética, vida útil curta e características anatômicas e fisiológicas oculares comparáveis aos humanos, como produção e drenagem do humor aquoso 6,7,8,9,10,11,12,13 . Os modelos atualmente utilizados incluem esclerose da malha trabecular após injeção de solução salina hipertônica em veias episclerais 14, injeção intracameral de microesferas15 ou substâncias viscoelásticas 16, cauterização de veias vórtices 17, fotocoagulação da tela trabecular com laser de argônio18, sutura circunlimbal 19 e uso de um modelo transgênico de OHT relacionada à idade (camundongos DBA/2J)8. No entanto, invasividade, opacificação pós-operatória da córnea, ruptura do segmento anterior, curvas de aprendizado extensas, equipamentos caros e PIO pós-operatória altamente variável estão entre algumas das armadilhas relatadas associadas aos modelos atuais, tornando o desenvolvimento de um modelo alternativo de ESB uma demanda para superar esses problemas20,21,22.
O presente protocolo formaliza um novo procedimento cirúrgico para induzir OHT como substituto do glaucoma, baseado na cauterização do plexo limbal (LPC) emroedores23. Trata-se de um modelo fácil, reprodutível, acessível e não invasivo, que proporciona alta eficiência e baixa variabilidade de elevação da PIO, associado a uma taxa excepcionalmente alta de recuperação clínica completa, proporcionando avaliação funcional in vivo em um número reduzido de animais utilizados em cada experimento. A técnica cirúrgica induz OHT subaguda com retorno gradual aos níveis basais em poucos dias, o que modela o ataque hipertensivo observado no glaucoma agudo de ângulo fechado. Além disso, a recuperação da PIO no modelo é seguida por neurodegeneração glaucomatosa contínua, o que é útil para futuros estudos mecanísticos da degeneração secundária dos CGRs, que ocorre em vários casos de glaucoma humano apesar do controle adequado da PIO.

<table><tbody><tr><td>Acetona</td><td>Isofar</td><td>201</td><td>Usado para preparação de tecido de microscopia eletrônica (passo 5)</td></tr><tr><td>Eletrodo ativo para eletroretinografia</td><td>Hansol Medical</td> <td>Co-Agulha</td> <td>de aço inoxidável 0,25 mm &vezes; 15 mm</td></tr><tr><td>Anestalcon</td><td>Novartis Bioci&ecirc; ncias S / A</td><td>MS-1.0068.1087</td><td>Cloridrato de Proxymetacaína 0,5%</td></tr> <tr><td>Cloreto de cálcio</td><td>Vetec</td><td>560</td><td>Usado para preparação de tecido de microscopia eletrônica (etapa 5)</td></tr> <tr><td>Cautery Low Temp Fine Tip 10 / bx</td><td>Bovie Medical Corporation</td><td>AA00</td><td>Cautério oftálmico de baixa temperatura</td></tr><tr><td>Cetamin</td><td>Syntec do Brasil Ltda</td><td>000200-3-000003</td><td>Cloridrato de cetamina 10%</td></tr> <tr><td>DAKO</td><td>Dako North America</td><td>S3023</td><td>Meio de montagem antidesvanecimento</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>28718-90-3</td><td>diamidino-2-fenilindol; contramancha nuclear fluorescente azul; emissão a 452&plusmn; Acrílico</td></tr><tr><td>Ecofilm</td> de 3 nm<td>&aacute; lia Produtos Qu&iacute; micos Farmac&ecirc; uticos Ltda</td><td>MS-1.0298.0487</td><td>Carmelose sódica 0.5%</td></tr> <tr><td>EPON Resina</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>-</td><td>Resina epóxi utilizada para microscopia eletrônica, composta por uma mistura de quatro reagentes: Resina Poly/Bed 812 (CAT#08791); DDSA - Anidrido dodecenilsuccínico (CAT#00563); NMA - Anidrido de Metila Nadic (CAT#00886); DMP-30 - 2,4,6-tris (dimetilaminometil) fenol (CAT # 00553)</td></tr> <tr><td>Ciências de Microscopia Eletrônica</td> <td>de Glutaraldeído</td><td>16110</td><td>Usado para preparação de tecido de microscopia eletrônica (etapa 5)</td></tr> <tr><td>Hyabak</td><td>Uni&atilde; o Qu&iacute; mica Farmac&ecirc; utica Nacional S / A</td><td>MS-8042140002</td><td>Hialuronato de sódio 0,15%</td></tr> <tr><td>Icare Tonolab</td><td>Icare Finlândia Oy</td><td>TV02 (número do modelo)</td> <td>Tonômetro portátil de rebote</td></tr><tr><td>IgG anticorpo anti-rato de burro + Alexa Fluor 555</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A31570</td><td>Solução de anticorpos</td></tr><tr><td>secundários Monitor LCD 23 polegadas</td><td>Samsung Electronics Co. Ltd.</td><td>S23B550</td><td>Modelo LS23B550, para gravação de eletrorretinograma</td></tr><tr><td>LSM 510 Meta</td><td>Carl Zeiss-Microscópio</td><td></td> <td>de epifluorescência confocal</td></tr><tr><td>Maxiflox</td><td>Crist&aacute; lia Produtos Qu&iacute; micos Farmac&ecirc; uticos Ltda</td><td>MS-1.0298.0489</td><td>Ciprofloxacina 3,5 mg/g</td></tr><tr><td>MEB-9400K</td><td>Nihon Kohden</td> <td>Corporation-Sistema</td> <td>para registro de eletrorretinograma</td></tr><tr><td>monoclonal IgG1 camundongo anti-Brn3a</td><td>MilliporeSigma</td><td>MAB-1585</td><td>Brn3a solução de anticorpo primário</td></tr><tr><td>Neuropack Manager v08.33</td><td>Nihon Kohden</td> <td>Corporation-Software</td> <td>para processamento de</td></tr> <tr><td>sinal de eletrorretinogramaOptomotry</td><td>CerebralMechanics-System</td><td></td> <td>para análise de resposta optomotora</td></tr><tr><td>Tetróxido de ósmio</td><td>Microscopia Eletrônica Sciences</td><td>19100</td><td>Usado para preparação de tecido de microscopia eletrônica (etapa 5)</td></tr><tr><td>Ferrocianeto de potássio</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>20150</td><td>Usado para preparação de tecido de microscopia eletrônica (etapa 5)</td></tr><tr><td>Eletrodos de referência e terra para eletrorretinografia</td><td>Chalgren Enterprises</td><td>110-63</td><td>Agulhas de aço inoxidável 0,4 mm &vezes; 37 mm</td></tr><tr><td>Tampão de cacodilato de sódio</td><td>Microscopia Eletrônica Sciences</td><td>12300</td><td>Usado para preparação de tecido de microscopia eletrônica (passo 5)</td></tr><tr><td>Ster MD</td><td>Uni&atilde; o Qu&iacute; mica Farmac&ecirc; utica Nacional S/A</td><td>MS-1.0497.1287</td><td>Acetato de prednisolona 0.12%</td></tr><tr><td>Terolac</td><td>Crist&aacute; lia Produtos Qu&iacute; micos Farmac&ecirc; uticos Ltda</td><td>MS-1.0497.1286</td><td>Cetorolaco trometamol 0,5%</td></tr><tr><td>Terramicina</td><td>Laborat&oacute; rios Pfizer Ltda</td><td>MS-1.0216.0024</td><td>Cloridrato de oxitetraciclina 30 mg/g + polimixina B 10.000 U/g</td></tr><tr><td>Tono-Pen XL</td><td>Reichert Technologies</td><td>230635</td><td>Tonômetro portátil de aplanação digital</td></tr><tr><td>TO-PRO-3</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>T3605</td><td>Contracoloração nuclear fluorescente vermelha distante; emissão a 661 nm</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9036-19-5</td><td>Surfactante não iônico</td></tr><tr>Ciências <td>22400</td> da <td>microscopia eletrônica</td> <td>do acetato de uranilo</td><td>usadas para a preparação do tecido da microscopia eletrônica (etapa 5)</td></tr>Hidrocloro <tr>2%Carl Zeiss-Stereo do hidrocloro 2%<td></td><td>Carl Zeiss-Stereo</td> <td>do</td> Ltda 7899 do acetato de uranila <td>para a cirurgia e a dissecção da retina</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

cauterização em círculo completo do plexo vascular limbal no glaucoma induzido cirurgicamente em roedores

Full-Circle Cauterization of Limbal Vascular Plexus for Surgically Induced Glaucoma in Rodents

O glaucoma, segunda causa de cegueira no mundo, é um grupo heterogêneo de doenças oculares caracterizadas por danos estruturais ao nervo óptico e degeneração das células ganglionares da retina (CGR), resultando em disfunção visual pela interrupção da transmissão de informações visuais do olho para o cérebro. A pressão intraocular elevada é o fator de risco mais importante; Assim, vários modelos de hipertensão ocular têm sido desenvolvidos em roedores por abordagens genéticas ou experimentais para investigar as causas e efeitos da doença. Dentre essas, algumas limitações têm sido relatadas, como invasividade cirúrgica, avaliação funcional inadequada, exigência de treinamento extensivo e extensão altamente variável do dano retiniano. O presente trabalho caracteriza um método simples, de baixo custo e eficiente para induzir hipertensão ocular em roedores, baseado na cauterização em círculo completo do plexo limbal a baixa temperatura, um dos principais componentes da drenagem aquosa do humor. O novo modelo proporciona uma hipertensão ocular subaguda tecnicamente fácil, não invasiva e reprodutível, associada à degeneração progressiva do CGR e do nervo óptico, e uma taxa de recuperação clínica pós-operatória única que permite estudos funcionais in vivo por métodos eletrofisiológicos e comportamentais.

As variáveis quantitativas foram expressas como média ± erro padrão da média (EPM). Com exceção da comparação da dinâmica da PIO entre os grupos ESB e controle (Figura 1F), a análise estatística foi realizada por meio de ANOVA two-way seguida do teste de comparações múltiplas de Sidak. Um valor de p &lt; 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.
A Figura 1 ilustra os passos cirúrgicos do modelo de cauterização do plexo limb...

O objetivo deste protocolo é caracterizar um novo modelo de neurodegeneração glaucomatosa baseado na cauterização térmica 360° do plexo vascular limbal, induzindo hipertensão ocular subaguda.

Cauterização em círculo completo do plexo vascular limbal no glaucoma induzido cirurgicamente em roedores

Glaucoma, the second leading cause of blindness worldwide, is a heterogeneous group of ocular disorders characterized by structural damage to the optic ...

Desenvolvemos um método simples para induzir degeneração robusta e progressiva do glaucoma baseado na elevação temporária da pressão intraocular. Isso representa uma oportunidade única para estudar pontos-chave da fisiopatologia do glaucoma. Trata-se de um modelo de fácil aprendizado, não invasivo, de baixo custo e altamente reprodutível, que permite a análise in vivo da função e o planejamento experimental de curto prazo utilizando um número reduzido de animais para cada experimento.A retina e o nervo óptico são partes avaliáveis do sistema nervoso central, de modo que a modelagem do comprometimento progressivo dessas estruturas pode fornecer informações valiosas sobre outras doenças neurodegenerativas. Para medir a pressão intraocular basal, ou PIO, dos olhos controles experimentais e contralaterais, coloque o rato anestesiado em decúbito ventral na bancada, de modo que a superfície corneana seja facilmente acessível à ponta do tonômetro. Posicione a ponta do tonômetro de forma que ela toque levemente a zona corneana central perpendicularmente.Em seguida, adquira a medição pressionando o botão de medição. Em seguida, colocar o rato em leve decúbito lateral sob estereomicroscópio e inspecionar o olho experimental em aumento de 40 vezes. Durante o procedimento, mantenha o olho de controle contralateral lubrificado instilando uma gota de carmelose sódica ou hialuronato de sódio.Em seguida, usando pinça curva, empurre suavemente o globo ocular experimental para frente para expor a vasculatura ao redor de 360 graus do limbo. Em seguida, com a outra mão, usando um cautério oftálmico de baixa temperatura, cauterizar suavemente os vasos ao redor da córnea. Cuidado para não cauterizar a periferia da córnea.Confirmar o sucesso do procedimento cirúrgico observando o surgimento de pequenas marcas circulares de cauterização no limbo escleral, a obliteração da vasculatura limbal e a dilatação pupilar no olho operado. Após a cirurgia, verificar a PIO no pós-operatório imediato em ambos os olhos, conforme demonstrado anteriormente. Em seguida, aplicar uma gota de acetato de prednisolona oftálmica na superfície anterior do olho experimental.Após 40 segundos, substitua-o por uma pomada antibiótica oftálmica. Aplicar um acompanhamento clínico diário do olho experimental com medicamentos tópicos compostos por um anti-inflamatório não esteroidal e pomada antibiótica. Para análise da resposta optomotora, colocar o rato para habituação em uma plataforma construída com quatro monitores de computador em um quadrângulo.Mantenha o cursor de cruz vermelha no quadro de vídeo entre os olhos do rato em movimento livre, pois indica o centro do cilindro virtual. Observar a resposta optomotora que consiste em um rastreamento reflexivo da cabeça e pescoço do rato provocado pelas graduações rotatórias. Inicialmente, introduzir um estímulo com baixa frequência espacial, em seguida, aumentar a frequência progressivamente até que o movimento de rastreamento não seja notado.Para registrar o eletrorretinograma padrão, após anestesiar o rato, insira cuidadosamente o eletrodo ativo na periferia temporal da córnea. Além disso, insira o eletrodo de referência no tecido subcutâneo do canto temporal ipsilateral e o eletrodo terra em um dos membros posteriores. Em seguida, posicione o rato a 20 centímetros da tela de estímulo, monitore a linha de base do sinal e inicie a aquisição pressionando o botão Análise no sistema de aquisição.Após o isolamento das retinas, transferi-las para uma placa de cultura de 24 poços contendo PBS de um mililitro, mantendo a retina interna voltada para cima. Permeabilizar o tecido lavando com um tensoativo não iônico a 0,5% diluído em PBS. Em seguida, incubar o tecido e a solução de bloqueio por uma hora à temperatura ambiente com agitação suave.Durante a incubação, preparar a solução primária de anticorpos Brn-3a e armazenar a quatro graus Celsius. Após o bloqueio tecidual, incubar as retinas em 200 microlitros de solução de anticorpos primários a quatro graus Celsius por 72 horas com agitação suave. Em seguida, lave o lenço de papel com PBS.Incubar o tecido em 200 microlitros da solução de anticorpos secundários por duas horas à temperatura ambiente e, em seguida, com solução de contracoloração nuclear por 10 minutos para coloração de núcleos fluorescentes. Após três lavagens com PBS, transfira a retina para uma lâmina de microscópio de vidro usando duas pequenas escovas mantendo o lado vítreo para cima. Posicione o quadrante dorsal da retina para cima na lâmina do microscópio.Finalmente, aplique 200 microlitros de meio de montagem antifade em uma tampa de vidro e coloque-o na retina plana montada para análise microscópica. Sob um microscópio confocal de epifluorescência, usando uma objetiva de aumento de 40 vezes, examine as montagens planas para estimar as células ganglionares da retina. Após a enucleação do globo ocular, remover o segmento proximal da porção intraorbital do nervo óptico, incluindo parte da porção intraocular.Em seguida, coloque imediatamente as amostras em frascos ou tubos contendo 200 a 300 microlitros de fixador a frio. Após duas horas, lavar o tecido com tampão cacodilato de sódio 100 micromolar frio. Em seguida, pós-fixar o tecido por uma hora em tetróxido de ósmio a 1% e cloreto de cálcio nanomolar a quatro graus Celsius sob agitação suave.Após três lavagens com tampão cacodilato de sódio frio, lavar os fragmentos do nervo óptico com água destilada fria antes de incubar durante a noite e acetato de mictório a 1% a quatro graus Celsius. No dia seguinte, após três lavagens com água, desidratar progressivamente o tecido em concentrações crescentes de acetona. Em seguida, realizar três rodadas de incorporação e soluções de acetona de resina epóxi antes de incorporar o tecido em resina epóxi pura por 24 horas.No dia seguinte, retire as amostras do porta-amostras e transfira-as para moldes de incorporação por 48 horas a 60 graus Celsius. Após a polimerização, use um ultramicrótomo para cortar cortes transversais semifinos dos fragmentos do nervo óptico. Em seguida, colete e transfira as seções para uma lâmina de vidro do microscópio.Coloração dos cortes com azul de toluidina e obtenção de imagens em microscópio óptico com aumento de 100 vezes. Para análises ultra-estruturais, execute seções transversais ultrafinas e colete-as em uma grade de cobre. Em seguida, corar os cortes com acetato de mictório e citrato de chumbo para exame de microscopia eletrônica de transmissão.A cauterização completa induziu elevação da PIO imediatamente após a cirurgia em comparação com os olhos controles. O pico da PIO pós-operatória foi observado no primeiro dia e diminuiu gradualmente até os níveis basais no sexto dia. Além disso, a função retiniana foi avaliada comportamental e eletrofisiologicamente usando reflexo optomotor e eletrorretinograma padrão, respectivamente.Após a cirurgia, ambos os parâmetros mostraram duas fases distintas de comprometimento: hipertensão ocular fase aguda no terceiro dia e fase de degeneração secundária no 30º dia. Em comparação com os nervos ópticos de controle, as contagens axonais e as secções semifinas do nervo óptico transversal diminuíram progressivamente após a cirurgia. Micrografias eletrônicas de transmissão de nervos ópticos do olho controle demonstraram fibras mielinizadas densamente embaladas separadas por processos de células gliais finas e microtúbulos axonais e neurofilamentos evidentes.Em contraste, após três dias de hipertensão ocular, algumas fibras degeneradas, vacuolização citoplasmática em processos de células gliais e cromatina condensada em núcleos de células gliais foram observadas. Após sete dias, houve aumento das fibras axonais degeneradas e dos processos hipertônicos das células gliais. E após 14 dias, observou-se maior desarranjo das fibras do nervo óptico associado à invasão de processos celulares gliais entre os axônios.Além disso, a densidade de células ganglionares da retina diminuiu com o tempo, principalmente nos quadrantes dorsais e temporais da retina. Durante a realização deste procedimento, tente tocar suavemente os vasos límbicos com uma ponta de cautério, poupando a periferia do cordão e garantindo que marcas de cauterização contínua sejam observadas ao redor do limbo escleral. Após esse procedimento, uma variedade de métodos pode ser aplicada, como a avaliação bioquímica funcional e imuno-histoquímica das estruturas oculares e outros métodos que possam ser reconhecidos na fisiopatologia do glaucoma.

full-circle-cauterization-limbal-vascular-plexus-for-surgically

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Glaucoma é uma das principais causas de cegueira no mundo. Pressão intraocular elevada é um importante fator de risco. Fotocoagulação a laser hipertensão ocular induzida é um dos modelos animais bem estabelecidos. Este vídeo demonstra como para induzir hipertensão ocular por fotocoagulação com laser de argônio em ratos.

Laser-Induced Ocular Modelo Hipertensão crônica em ratos SD

Fonte: Lani-Louzada, R., et al., Cauterização de círculo completo do plexo vascular límbico para glaucoma induzido cirurgicamente em roedores. J. Vis. Exp. (2022)Este vídeo demonstra a indução e monitoramento da pressão intraocular (PIO) elevada em um modelo de rato. O processo envolve a cauterização dos vasos sanguíneos límbicos, resultando em oclusão do vaso e PIO elevada. O rato é então autorizado a se recuperar e a PIO é monitorada regularmente nos olhos experimental e de controle para...

 Indução de Pressão Intraocular Elevada em Modelo de Rato

Fonte: Lani-Louzada, R., et al. Cauterização de círculo completo do plexo vascular límbico para glaucoma induzido cirurgicamente em roedores. J. Vis. Exp. (2022). Este vídeo demonstra a quantificação de células ganglionares da retina de retinas de ratos quimicamente fixadas submetidas à cauterização de círculo completo do plexo vascular límbico. O processo inclui permeabilização, coloração de anticorpos e contracoloração nuclear, seguida de visualização sob um microscópio de epifluorescência...

Quantificação de células ganglionares da retina após hipertensão ocular induzida por cauterização 

Hipertensão ocular crônica é induzida pelo uso de fotocoagulação a laser da malha trabecular em rato olhos. A pressão intra-ocular (IOP) é ​​elevada durante vários meses após o tratamento com laser. A diminuição da acuidade visual e sensibilidade ao contraste de animais experimentais são monitorados por meio do teste optomotor.

Um modelo de rato induzida por laser de crônica Ocular Hypertension para Caracterizar defeitos visuais

O glaucoma é caracterizado por danos às células ganglionares da retina. A indução de glaucoma em modelos animais pode fornecer informações sobre o estudo desta doença. Aqui, descrevemos um procedimento que induz a perda de RGCs em um modelo de rato in vivo e demonstra a preparação de retinas de montagem inteira para análise.

Glaucoma de indução de Procedimento em um<em&gt; In Vivo</em&gt; Modelo de Rato e Whole mount-Retina Preparação

O seguinte artigo fornece uma técnica fácil, reprodutível para efetivamente criar um modelo do rato sustentável da deficiência límbica (LSCD). Este modelo animal é útil em testar e comparar a eficácia dos tratamentos para as doenças de células estaminais do limbo.

Um procedimento mecânico simples de criar Limbal Deficiência Stem Cell no mouse

Hipertensão ocular crônica é induzida pela aplicação de uma sutura de circumlimbal em ratos e camundongos, levando à deterioração funcional e estrutural das células ganglionares da retina consistentes com glaucoma.

Um modelo de Glaucoma induzido por sutura Circumlimbal em ratos e camundongos

Aqui, descrevemos um protocolo otimizado para oclusão da veia retiniana usando rosa bengala e um sistema de microscópio de imagem retiniana guiado a laser com recomendações para maximizar sua reprodutibilidade em cepas geneticamente modificadas.

Otimização do Modelo de Oclusão de Veia da Retina em Camundongo para Limitar a Variabilidade

Este protocolo descreve um método para induzir uma lesão córnea e límbica precisa e reprodutível em um modelo de camundongo. O protocolo é vantajoso, pois permite uma lesão uniformemente distribuída na córnea e no limbo de camundongos altamente curvos.

Indução de lesão de córnea e límplice alcalino pela técnica punch-trephine em modelo murino

Este protocolo descreve a Trabeculoplastia por Túnel por Trabeculotomo (3T) — uma cirurgia de glaucoma minimamente invasiva que inclui incisão trabecular, dilatação do canal de Schlemm (SC) e implantação de sutura por tensão para restaurar a saída aquosa fisiológica — acompanhada por uma série de casos não comparativa.

Trabeculoplastia por Túnel com Trabeculotomo (3T): Um Protocolo Cirúrgico Passo a Passo para Glaucoma Primário de Ângulo Aberto

Aprenda a cauterização completa do plexo vascular limbal para induzir hipertensão ocular em ratos. Este modelo reprodutível e de baixo custo permite estudar a neurodegeneração glaucomatosa e a fisiopatologia ocular in vivo.

Cauterização em círculo completo do plexo vascular limbal no glaucoma induzido cirurgicamente em roedores

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