Name: Isolamento e Triagem da Biodiversidade do Solo para Fungos Envolvidos na Degradação de Materiais Recalcitrantes (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 21 s
Description: Aprenda a isolar fungos do solo com potencial de biorremediação para degradar poluentes recalcitrantes como hidrocarbonetos e plásticos. Este protocolo de baixo custo utiliza meios seletivos e ensaios enzimáticos para identificar cepas promissoras.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Reconhecemos a Scuola di Alta Formazione Dottorale (SAFD) da Universidade de Pavia e o Professor Solveig Tosi por proporcionarem a oportunidade para este trabalho.

1. Seleção de cepas fúngicas capazes de degradar materiais recalcitrantes do solo
<ol><li>Preparação de solução antibiótica.<ol>
<li>Coloque penicilina (50 mg/L), estreptomicina (40 mg/L), clorofitracíclina (40 mg/L), neomicina (100 mg/L) e clorofifenicol (100 mg/L) em 250 mL de água estéril desionizada.</li>
		<li>Antes de adicionar clororamfenicol à solução antibiótica, dissolva-o em 3 mL de ≥99% de etanol.</li>
		<li>Coloque a solução de antibióticos em um agitador magnético (sem calor) com uma barra de agitação magnética dentro da solução por 10 minutos. Armazene a 4 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparação da mídia de crescimento.<ol>
<li>Coloque 1 g de ácido húlico comercial, 3,26 g de caldo Bushnell-Haas (BH), e 15 g de ágar em 1 L de água desionizada e autoclave-o por 20 min a 121 °C (ágar ácido húrico).</li>
		<li>Coloque o ágar ácido húlico nas placas de Petri sob um armário de fluxo laminar.</li>
		<li>Coloque 4 g de lignocelulose, 3,26 g de BH, e 15 g de ágar em 1 L de água desionizada e autoclave-o por 20 min a 121 °C (lignocellulose agar).</li>
		<li>Prato o ágar lignocellulose em pratos Petri sob um armário de fluxo laminar.</li>
		<li>Sob um gabinete de fluxo laminar, depois que a mídia se solidificar nas placas de Petri, transfira 1 mL da solução antibiótica para as placas preparadas usando uma seringa estéril com um filtro de 0,2 μm para esterilizá-la.</li>
		<li>Distribua a solução de antibiótico uniformemente nas superfícies da placa usando um espalhador de células em forma de L descartável e deixe-a secar no ar sob o armário de fluxo laminar.</li>
		<li>Coloque 20 g de caldo extrato de malte e 15 g de ágar em 1 L de água deionizada e autoclave-o por 20 min a 121 °C (ágar extrato de malte - MEA).</li>
		<li>Coloque o MEA em pratos petri sob um armário de fluxo laminar.</li>
	</ol></li>
	<li>Amostragem de solo e diluições do solo.<ol>
<li>Prove o solo de interesse a uma profundidade de 10 cm, removendo quaisquer plantas, grama e folhas mortas da camada superior, e coloque-o em sacos de polietileno estéreis.</li>
		<li>Depois de chegar ao laboratório, peneirar o solo usando uma malha de 2 mm, removendo quaisquer raízes e detritos vegetais.</li>
		<li>Se não for possível prosseguir com a análise a jusante imediatamente, armazene as amostras de solo peneiradas a 4 °C.</li>
		<li>Trabalhando sob um gabinete de fluxo laminar, coloque 1 g do solo peneirado em um tubo estéril de 15 mL com 10 mL de água deionizada estéril (1 x 10-1 diluição). Agite o tubo horizontalmente por 30 minutos.</li>
		<li>Sob um gabinete de fluxo laminar, antes que a suspensão se instale, pegue 1 mL da diluição 1 x 10-1 com uma pipeta estéril e transfira-a para um 9 mL de água deionizada em branco (1 x 10-2 diluição). Vórtice completamente.</li>
		<li>Antes que a suspensão se instale, pegue 1 mL da diluição 1 x 10-2 com uma pipeta estéril e transfira para um 9 mL de água em branco deionizado (diluição de 1 x 10-3 ). Vórtice completamente.</li>
	</ol></li>
	<li>Emplacando diluições do solo em mídia seletiva.<ol>
<li>Trabalhando sob um gabinete de fluxo laminar, colete 100 μL da diluição 1 x 10-3 usando uma micropipette com um ponto estéril e transfira-o para uma placa de ágar petri úmida. Faça isso por pelo menos 4 ou 5 pratos de Petri.</li>
		<li>Distribua a diluição uniformemente na superfície da placa de Petri usando um espalhador de células em forma de L descartável estéril.</li>
		<li>Deixe-o seco por 10-15 min sob o armário de fluxo laminar.</li>
		<li>Repetição passos 1.4.1.-1.4.3. usando pratos lignocellulose Petri.</li>
		<li>Incubar a 25 °C no escuro por uma máxima de 15 dias.</li>
	</ol></li>
	<li>Isolamento de colônias fúngicas cultivadas da mídia seletiva à mídia de crescimento.<ol>
<li>A partir de 3 dias após a preparação, verifique as placas de petri de mídia seletiva preparadas diariamente para qualquer crescimento de colônia fúngica por um máximo de 15 dias.</li>
		<li>Verifique todas as colônias fúngicas presentes para semelhanças. Se necessário, prepare um slide a ser observado sob um microscópio leve. NOTA: O objetivo é isolar o maior número de colônias fúngicas, mas é necessário evitar sempre isolar a mesma cepa fúngica de diferentes placas, por isso este cheque é muito importante. Procure colônias com diferentes macro e micromorfologia.</li>
		<li>Sob um gabinete de fluxo laminar ou em um queimador Bunsen, isole cada cepa fúngica escolhida removendo suavemente uma pequena parte do micélio da colônia com uma agulha de inoculação estéril e transferindo-a para uma nova placa DED. NOTA: Nesta fase, é muito importante ser delicado e preciso, pois há um alto risco de contaminação das outras colônias fúngicas presentes na placa de Petri original. Se mais de uma cepa fúngica crescer na placa MEA inoculada, repita o passo 1.5.3.</li>
		<li>Incubar a 25 °C no escuro por 7 dias. Estas são as cepas fúngicas a serem testadas mais adiante em substâncias recalcitrantes específicas.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Testes de crescimento em substâncias recalcitrantes
<ol><li>Teste de crescimento em petrolatum.<ol>
<li>Transfira 20 mL de BH líquido (3,26 g/L de BH) em frascos de 50 mL e esterilize-os autoclaving a 121 °C por 20 min.</li>
		<li>Transfira 7 mL de água deionizada em frascos de vidro de 15 mL e adicione alguns pedaços de tampas de vidro quebradas em cada frasco.</li>
		<li>Esterilizá-los autoclaving a 121 °C por 20 min.</li>
		<li>Sob o gabinete de fluxo laminar, adicione 1 mL de petrolatum a cada frasco BH de 50 mL usando uma pipeta estéril. Mantenha alguns frascos com apenas BH como controle negativo.</li>
		<li>Sob o gabinete de fluxo laminar, remova o micélio na superfície do meio das placas MEA com as cepas fúngicas escolhidas (preparadas na Etapa 1.5.3.) usando uma agulha estéril e transfira-a para frascos de vidro de 15 mL com as tampas quebradas.</li>
		<li>Agitar cada frasco em uma batedeira de vórtice por 2 minutos, permitindo que as tampas quebradas cortem o cubo da colônia fúngica, fazendo uma suspensão fúngica.</li>
		<li>Inocular cada frasco de petrolatum com 200 μL de suspensão fúngica. Faça duas réplicas para cada cepa fúngica.</li>
		<li>Para o controle negativo, coloque 200 μL de suspensão fúngica em frascos apenas líquidos BH. Além disso, mantenha um par de frascos com petrolato sem qualquer inoculação fúngica para verificar se há contaminação no meio.</li>
		<li>Incubar os frascos a 25 °C no escuro e verificar após 15 dias e 30 dias a partir do inóculo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Teste de crescimento em óleo de motor usado.<ol>
<li>Coloque 3,26 g de BH e 15 g de ágar em 1 L de água deionizada e autoclave-o por 20 min a 121 °C (BHA).</li>
		<li>Coloque a BHA em pratos de Petri sob um armário de fluxo laminar.</li>
		<li>Quando tiver solidificado, transfira 500 μL de óleo de motor usado para as placas BHA Petri e distribua-o uniformemente nas superfícies da placa usando um espalhador de células descartável estéril em forma de L.</li>
		<li>Inocular cada placa BHA de óleo de motor usado com cada cepa fúngica, coletando o micélio das placas preparadas na Etapa 1.5.3. Trabalhe em um queimador Bunsen ou sob um capô de fluxo laminar para evitar contaminação. Faça duas réplicas para cada cepa fúngica.</li>
		<li>Para o controle negativo, inocular as placas de Petri apenas com BHA. Além disso, mantenha um par de pratos BHA Petri de óleo de motor usado sem qualquer inoculação fúngica para verificar se há contaminação no meio.</li>
		<li>Incubar as placas de Petri a 25 °C no escuro e verificar após 15 dias e 30 dias a partir do inóculo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Teste de crescimento em plásticos.<ol>
<li>Transfira 200 μL de suspensão fúngica (Etapas 2.1.5.-2.1.6.) em uma placa de 96 microwell. Faça três réplicas da combinação fúngica de plástico de tensão.</li>
		<li>Para cada poço com a suspensão fúngica, adicione 10 mg de um tipo diferente de pó plástico (polietileno tereftalato - PET, cloreto de polivinil - PVC, polietileno de alta densidade - HDPE, poliestireno - PS, poliuretano - PUR).</li>
		<li>Para o controle negativo, em vez de adicionar o pó plástico, adicione 200 μL de solução BH esterilizada ao poço com a suspensão fúngica. Além disso, para cada tipo de pó plástico, encha um poço com 200 μL de solução bh esterilizada e 10 mg de cada pó plástico para verificar se há contaminação do meio.</li>
		<li>Incubar as placas de microwell a 25 °C no escuro e verificar-as após 15 dias e 30 dias a partir do inóculo.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Testes enzimáticos qualitativos
<ol><li>Enzimas ligninolíticas qualitativas testam colorimétricos.<ol>
<li>Coloque 27 g de caldo de dextrose de batata (PD) e 15 g de ágar em 1 L de água desionizada e autoclave-o por 20 min a 121 °C (PDA).</li>
		<li>Quando o meio tiver esfriado um pouco, mas ainda estiver líquido, adicione ácido gálico (5 g/L) sob um capô de fluxo laminar e coloque o meio em pratos de Petri.</li>
		<li>Inocular as placas de PDA + ácido gálico com cada cepa fúngica, coletando o micélio das placas preparadas na Etapa 1.5.3. Trabalhe em um queimador Bunsen ou sob um capô de fluxo laminar para evitar contaminação.</li>
		<li>Como controles negativos, prepare pratos de Petri com apenas PDA (sem ácido gálico) e inocula-os com as cepas fúngicas (uma para cada cepa fúngica), bem como uma placa de Petri com PDA + ácido gálico e sem inoculação fúngica.</li>
		<li>Incubar as placas de Petri a 25 °C no escuro e verificar após 7 dias do inóculo.</li>
	</ol></li>
	<li>Teste colorimétrico de laccases qualitativas.<ol>
<li>Coloque 27 g de PD e 15 g de ágar em 1 L de água desionizada e autoclave-o por 20 min a 121 °C (PDA).</li>
		<li>Quando o meio esfriar um pouco, mas ainda estiver líquido, adicione guaiacol (400 μL/L) sob um capô de fluxo laminar e emplaque-o em pratos de Petri.</li>
		<li>Inocular as placas PDA + guaiacol com cada cepa fúngica, coletando o micélio das placas preparadas no Passo 1.5.3. Trabalhe em um queimador Bunsen ou sob um capô de fluxo laminar para evitar qualquer contaminação.</li>
		<li>Como controles negativos, prepare pratos de Petri com apenas PDA (sem guaiacol) e inocula-os com as cepas fúngicas (uma para cada cepa fúngica), bem como uma placa de Petri com PDA + guaiacol e sem inoculação fúngica.</li>
		<li>Incubar as placas de Petri a 25 °C no escuro e verificar após 7 dias do inóculo.</li>
	</ol></li>
	<li>Teste de proteases qualitativas.<ol>
<li>Prepare o meio YES adicionando K2HPO4 (1 g/L) , KH2PO4 (0,5 g/L), MgSO4·7H2O (0,5 g/L), MnCl2·4H2O (0,001 g/L), CuCl2·2H2O (1.4 x 10-5 g/L), ZnCl2 (1.1 x 10-5 g/L), CoCl2·6H2O (2 x 10-5 g/L), Na2MoO4·2H2O (1,3 x 10-5 g/L), FeCl3·6H2O (7,5 x 10-5 g/L) e gelatina/peptone (0,02 g/L) à água desionizada.</li>
		<li>Coloque o meio SIM em um agitador magnético (sem calor) com uma barra de agitação magnética dentro do meio por 10 minutos.</li>
		<li>Quando todos os sais tiverem dissolvido no meio, transfira 5 mL da solução em frascos de vidro estéreis de 20 mL e autoclave-os por 20 min a 121 °C.</li>
		<li>Para o controle negativo, prepare cerca de 20 mL de frascos de vidro estéreis com solução de 5 mL de BH e autoclave-os por 20 min a 121 °C.</li>
		<li>Sob um gabinete de fluxo laminar, transfira 200 μL de suspensão fúngica (Etapas 2.1.5.-2.1.6.) para cada cepa para os frascos médios esterilizados YES (faça pelo menos 2 réplicas por cepa fúngica). Para cada cepa fúngica, adicione 200 μL da mesma suspensão fúngica aos frascos esterilizados de BH para ter um controle negativo.</li>
		<li>Incubar os frascos a 25 °C no escuro por 21 dias e verificar a cada 7 dias.</li>
	</ol></li>
	<li>Teste de esterases qualitativas.<ol>
<li>Prepare o meio Tween 80 adicionando peptone (10 g/L), NaCl (5 g/L), CaCl2 (0,1 g/L) e 10 mL de Tween 80 a 1 L de água desionizada.</li>
		<li>Coloque o meio Tween 80 em um agitador magnético (sem calor) com uma barra de agitação magnética dentro do meio por 10 minutos.</li>
		<li>Quando tudo estiver derretido dentro do meio, transfira 5 mL da solução em frascos de vidro estéreis de 20 mL e autoclave-os por 20 min a 121 °C.</li>
		<li>Para o controle negativo, prepare cerca de 20 mL de frascos de vidro estéreis com solução de 5 mL de BH e autoclave-os por 20 min a 121 °C.</li>
		<li>Sob um gabinete de fluxo laminar, transfira 200 μL de suspensão fúngica (Etapas 2.1.5.-2.1.6.) para cada cepa para os frascos médios esterilizados Tween 80 (faça pelo menos 2 réplicas por cepa fúngica). Para cada cepa fúngica, adicione 200 μL da mesma suspensão fúngica aos frascos esterilizados de BH para controle negativo.</li>
		<li>Incubar os frascos a 25 °C no escuro por 21 dias e verificar a cada 7 dias.</li>
	</ol></li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

A rica biodiversidade do solo é uma fonte abundante de fungos que possuem inúmeras habilidades metabólicas, algumas das quais podem ser potenciais candidatas à bioremediação. Testes de mídia seletiva (Seção 1 do protocolo) são métodos fáceis de executar e eficazes para isolar fungos capazes de crescer em polímeros complexos naturais como sua única fonte de carbono. Fungos podem produzir hidrolases extracelulares, não específicas e oxidoreductases30 , como as enzimas ligninolíticas laccases e perox...

O solo é um componente fundamental da vida na Terra e é a base de muitos ecossistemas. Os minerais, matéria orgânica e microrganismos no solo podem ser considerados como um sistema, com associações próximas e interações ocorrendo entre eles. As interações desses compostos têm um impacto importante nos processos terrestres, na qualidade ambiental e na saúde do ecossistema1. A poluição do solo apresenta sérios problemas ambientais em todo o mundo. A aplicação indiscriminada, a longo prazo e excessiva de substâncias recalcitrantes e tóxicas, como pesticidas, produtos petrolíferos, plásticos e outros produtos químicos, tem efeitos sérios na ecologia do solo e, como resultado, pode alterar a microbiota do solo. As comunidades microbianas nos solos são compostas por uma ampla gama de organismos em diferentes estados fisiológicos, sendo a maioria bactérias e fungos. Muitos dos contaminantes nos solos têm estabilidade de médio a longo prazo, e sua persistência pode levar ao desenvolvimento de mecanismos adaptativos que permitem aos microrganismos utilizar substâncias recalcitrantes como nutrientes 2,3. Esses microrganismos podem, portanto, ser considerados para técnicas de bioremediação.
A bioremediação tenta mitigar os efeitos da poluição usando microrganismos e suas enzimas para a degradação ou transformação de resíduos em compostos menos tóxicos ou não tóxicos. Várias espécies de arqueias, bactérias, algas e fungos possuem essa capacidade de bioremediação4. Como resultado de suas ações biodegradativas particulares, os fungos são especialmente organismos promissores para a bioremediação. Eles podem atacar diferentes substratos usando sua rede hignótica, permitindo-lhes penetrar a matriz do solo de forma mais eficiente do que outros microrganismos. Além disso, eles podem alcançar interstícios inacessíveis onde contaminantes são difíceis de remover5, e também podem sobreviver a baixos níveis de umidade6. Além disso, os fungos sintetizam diferentes fitas de enzimas inespecíficas, geralmente para degradar substâncias recalcitrantes naturais como celulose, lignina e ácidos húricos. Aqueles que não possuem o substrato alvo podem estar envolvidos na degradação de uma ampla gama de poluentes recalcitrantes, como hidrocarbonetos, plásticos e pesticidas 7,8,9,10. Portanto, embora muitas espécies fúngicas já tenham sido relatadas como agentes de bioremediação, há um interesse crescente em explorar espécies que ainda não foram estudadas para selecionar candidatos para a bioremediação de substâncias contaminantes recalcitrantes. As espécies já conhecidas por terem propriedades de bioremediação pertencem ao filo Ascomycota 11,12,13, Basidiomycota14,15 e Mucoromycota. Por exemplo, os gêneros Penicillium e Aspergillus são bem conhecidos por estarem envolvidos na degradação dos hidrocarbonetos alifáticos13, diferentes polímeros plásticos 16,17,18, metais pesados19 e corantes20. Da mesma forma, estudos realizados em fungos basidiomycetes, como Phanerochaete chrysosporium e Trametes versicolor, revelaram seu envolvimento na oxidação de materiais recalcitrantes como hidrocarbonetos aromáticos13 e plásticos21. Outro exemplo de fungos envolvidos nos processos de biodegradação são os zigomycetes Rhizopus spp., Mucor spp., e Cunninghamella spp.22,23. Em particular, Cunninghamella é capaz de oxidase hidrocarbonetos aromáticos e é considerado um organismo modelo para estudar a desintoxicação de produtos de uma ampla gama de xenobióticos13.
Existem várias enzimas fúngicas envolvidas nos principais processos degradativos de materiais recalcitrantes24,25, como esterase, laccase, peroxidase e protease. Laccases são oxidações contendo cobre produzidas na célula e posteriormente secretadas, que permitem a oxidação de uma variedade de compostos fenólicos e aromáticos. Eles podem degradar ortos e para difenóis, os fenóis que contêm grupo amino, lignina e as diaminas contendo o grupo aryl26. Peroxidases usam peróxido de hidrogênio como mediador para degradar a lignina e outros compostos aromáticos. Existem muitas peroxidases diferentes, mas as que têm maior potencial para degradar substâncias tóxicas são a lignina peroxidase e a peroxidase de manganês27.
Esterases e proteases pertencem ao grupo de enzimas extra ou ecto-celular, que agem fora de suas células de origem, mas ainda estão ligadas a elas. Essas enzimas podem catalisar a hidrólise de grandes moléculas recalcitrantes em moléculas menores. Devido à sua baixa especificidade de substrato, essas enzimas podem desempenhar um papel fundamental na bioremediação de diversos poluentes, como corantes têxteis, efluentes liberados das indústrias de celulose e papel e bronzeamento de couro, produtos petrolíferos, plásticos e pesticidas 28,29,30.
Uma série de métodos de triagem para selecionar para cepas fúngicas bioremediativas já foram publicados. Por exemplo, o meio ágar à base de palha tem sido usado para triagem para fungos de podridão branca com alto potencial na degradação aromática policíclica (PAH)31; e pequenos pedaços de madeira podre foram colocados no ágar extrato de malte (MEA) para isolar fungos apodrecidos de madeira32. No entanto, a maioria dos métodos já propostos seleciona fungos muito específicos para sua atividade de interesse. Esta pesquisa propõe uma abordagem mais ampla para a seleção de fungos do solo com uma gama mais ampla de ação. O método baseia-se no revestimento inicial de diluições seriais de amostras de solo em um meio alterado com ácidos húlicos ou lignocelulose misturado com antibióticos para selecionar fungos com a capacidade de degradar essas substâncias recalcitrantes naturais. Os ácidos húricos e a lignocelulose, na verdade, são substâncias extremamente resistentes à biodegradação, pois possuem estruturas moleculares muito complexas, o que permite que sejam excelentes indicadores da capacidade degradante dos fungos testados33,34. Posteriormente, os fungos selecionados nos primeiros testes são examinados para identificar aqueles com potencial para degradar poluentes específicos, como petrolatum, óleo de motor usado e plásticos. Finalmente, são realizados testes enzimáticos qualitativos para detectar cepas fúngicas capazes de produzir enzimas envolvidas nos processos de biodegradação de substâncias recalcitrantes. Para isso, são realizados testes de protease e esterase, enquanto o ácido gálico e o guaiacol são utilizados como indicadores de laccase e outras produções ligninolíticas35,36. Esses substratos são usados porque uma forte correlação foi encontrada entre a capacidade dos fungos de oxidar-os à sua forma de cor marrom e a posse da capacidade ligninolítica 37,38,39.
Através desses protocolos, é possível isolar cepas fúngicas com alto potencial degradante e um amplo espectro de ação diretamente das amostras do solo. O isolamento dessas cepas fúngicas poderia ajudar a encontrar novos candidatos para fins de bioremediação.

<table><tbody><tr><td>Placa de 96 micropoços</td><td>Greiner bio-one</td><td>650185</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>VWR</td><td>84609.05</td><td></td></tr><tr><td>Caldo Bushnell-Haas</td><td>Fluka</td><td>B5051</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5670</td><td></td></tr><tr><td>Cloroanfenicol</td><td>Eurobio</td><td>GABCRL006Z</td><td></td></tr><tr><td>Clortetraciclina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td>Y0001451</tr><tr><td>CoCl2&middot; 6H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8661</td><td></td></tr><tr><td>CuCl2&middot; 2H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3279</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>VWR Chemicals</td><td>20821.296</td><td></td></tr><tr><td>FeCl3&middot; 6H2O</td> Filtro <td>236489</td><td></td><td>Sigma-Aldrich</td></tr><tr><td>0.2 &micro; m</td><td>Whatman</td><td>10462200</td><td></td></tr><tr><td>ácido gálico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7384</td><td></td></tr><tr><td>Lamínulas de vidro</td><td>Biosigma</td><td>VBS634</td><td></td></tr><tr><td>Frascos de vidro 15 mL</td><td>SciLabware</td><td>P35467</td><td></td></tr><tr><td>guaiacol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5502</td><td></td></tr><tr><td>Polietileno de alta densidade (HDPE)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>434272</td><td></td></tr><tr><td>Ácidos húmicos</td><td>Aldrich Chemistry</td><td>53680</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8281</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>Lignocelulose</td><td>/</td><td>/</td><td>Resíduos da produção de bioetanol esterilizado</td></tr><tr><td>Espalhador de células em forma de L</td><td>Laboindustria S.p.a</td><td>21133</td><td></td></tr><tr><td>agitador magnético</td><td>A.C.E.F</td><td>8235</td><td></td></tr><tr><td>Caldo de Extrato de Malte</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>70146</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4&middot; Micropipeta 7H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2643</td><td></td></tr><tr><td>1000 &mu; Micropipeta L</td><td>Gilson</td><td>FA10006M</td><td></td></tr><tr><td>200&nbsp; &mu; L</td><td>Gilson</td><td>FA10005M</td><td></td></tr><tr><td>MnCl2&middot; 4H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5005</td><td></td></tr><tr><td>Na2MoO4&middot; 2H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1651</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5886</td><td></td></tr><tr><td>Neomicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N0401000</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1504489</td><td></td></tr><tr><td>peptona</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>83059</td><td></td></tr><tr><td>Polietileno tereftalato (PET)</td><td>Goodfellow</td><td>ES306031</td><td></td></tr><tr><td>Placas de Petri</td><td>Laboindustria S.p.a</td><td>21050</td><td></td></tr><tr><td>Petrolato (líquido de parafina)</td><td>A.C.E.F</td><td></td><td></td></tr> 009661 <tr><td>Caldo de batata dextrose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6685</td><td></td></tr><tr><td>Poliestireno (PS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>331651</td><td></td></tr><tr><td>Poliuretano (PUR)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>GF20677923</td><td></td></tr><tr><td>Policloreto de vinila ( PVC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>81388</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de falcão estéril</td><td>Greiner bio-one</td><td>227 261</td><td></td></tr><tr><td>Frascos de vidro estéreis 20 mL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SU860051</td><td></td></tr><tr><td>Ponto estéril 1000&nbsp; &mu; L</td><td>Gilson</td><td>F172511</td><td></td></tr><tr><td>Ponto estéril 200&nbsp; &mu; L</td><td>Gilson</td><td>F172311</td><td></td></tr><tr><td>Sacos de polietileno estéril</td><td>WHIRL-PAK</td><td>B01018</td><td></td></tr><tr><td>seringa estéril</td><td>Rays</td><td>5523CM25</td><td></td></tr><tr><td>Estreptomicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S-6501</td><td></td></tr><tr><td>Tween 80</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1754</td><td></td></tr><tr><td>Óleo de motor usado</td><td>/</td><td>/</td><td>mistura complexa de hidrocarbonetos, aditivos para motores e metais, fornecida por uma empresa privada italiana</td></tr><tr><td>Frascos 50 mL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>33108-U</td><td></td></tr><tr><td>ZnCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z0152</td><td></td></tr></tbody></table>

isolamento e triagem da biodiversidade do solo para fungos envolvidos na degradação de materiais recalcitrantes

Isolation and Screening from Soil Biodiversity for Fungi Involved in the Degradation of Recalcitrant Materials

A poluição ambiental é um problema crescente, e identificar fungos envolvidos no processo de bioremediação é uma tarefa essencial. O solo abriga uma incrível diversidade de vida microbiana e pode ser uma boa fonte desses fungos bioremediativos. Este trabalho tem como objetivo buscar fungos do solo com potencial de bioremediação utilizando diferentes testes de triagem. A mídia de cultura mineral complementada com substâncias recalcitrantes como única fonte de carbono foi usada como teste de crescimento. Primeiro, as diluições do solo foram banhadas em placas de Petri com meio mineral alterado com ácidos húlicos ou lignocelulose. As colônias fúngicas em crescimento foram isoladas e testadas em diferentes substratos, como misturas complexas de hidrocarbonetos (petrolatum e óleo de motor usado) e pós de diferentes polímeros plásticos (PET, PP, PS, PUR, PVC). Testes enzimáticos qualitativos estiveram associados aos testes de crescimento para investigar a produção de esterases, laccases, peroxidases e proteases. Essas enzimas estão envolvidas nos principais processos de degradação do material recalcitrante, e sua secreção constitutiva pelas cepas fúngicas examinadas poderia ter o potencial de ser explorada para a bioremediação. Mais de 100 cepas foram isoladas e testadas, e vários isolados com bom potencial de bioremediação foram encontrados. Em conclusão, os testes de triagem descritos são um método fácil e de baixo custo para identificar cepas fúngicas com potencial de bioremediação do solo. Além disso, é possível adequar os testes de triagem para diferentes poluentes, de acordo com as exigências, adicionando outras substâncias recalcitrantes aos meios de cultura mínimos.

Os métodos de mídia seletiva (Seção 1 do protocolo) permitiram a triagem da rica biodiversidade do solo e os fungos com alto potencial de bioremediação. Com o ácido húlico e a mídia lignocelulose, mais de 100 cepas fúngicas foram isoladas. Esses fungos produziram enzimas envolvidas na biodegradação de materiais recalcitrantes naturais, que possuem uma estrutura química semelhante a muitos poluentes. No entanto, as cepas fúngicas isoladas com as mídias seletivas precisavam de uma triagem adicional. Especificamente, os tes...

Aqui, apresentamos um protocolo de triagem da biodiversidade do solo para procurar cepas fúngicas envolvidas na degradação de materiais recalcitrantes. Primeiro, as cepas fúngicas capazes de crescer em ácidos húlicos ou lignocelulose são isoladas. Sua atividade é então testada tanto em ensaios enzimáticos quanto em poluentes como hidrocarbonetos e plásticos.

Isolamento e Triagem da Biodiversidade do Solo para Fungos Envolvidos na Degradação de Materiais Recalcitrantes

Environmental pollution is an increasing problem, and identifying fungi involved in the bioremediation process is an essential task. Soil hosts an ...

Este protocolo é significativo porque isola cepas fúngicas com alto potencial degradativo diretamente das amostras do solo para serem consideradas como candidatos para fins de bioremediação. Este protocolo é uma triagem de baixo custo para encontrar fungos com potencial de bioremediação. Além disso, dá resultados fáceis de interpretar.Uma vez que esta técnica envolve o manuseio de microrganismos, é muito importante trabalhar na esterilidade usando um armário de fluxo laminar ou um queimador Bunsen para evitar contaminação. Para começar, prove o solo de interesse e peneira o solo usando uma malha de dois milímetros para remover quaisquer raízes e detritos vegetais. Sob um gabinete de fluxo laminar, adicione um grama do solo peneirado em um tubo estéril de 15 mililitros.Em seguida, adicione 10 mililitros de água deionizada estéril para fazer uma diluição de 10 a menos uma. Agite o tubo horizontalmente por 30 minutos. Antes que a suspensão se instale, pegue um mililitro de 10 a menos uma diluição com uma pipeta estéril e transfira para um nove mililitro de água deionizada em branco para fazer 10 para a diluição menos dois.Vórtice a suspensão completamente. Da mesma forma, faça uma diluição de 10 a menos três de um tubo de diluição de 10 para menos dois. Para emplacamento de diluições de solo em mídia seletiva, colete 100 microliters da diluição de 10 a menos três usando uma micropipette com um ponto estéril e transfira-o para uma placa de ágar petri húnica.Distribua a diluição uniformemente na superfície do prato usando um espalhador de células estéril, descartável, em forma de L. Prepare de quatro a cinco desses pratos. Da mesma forma, prepare pratos de lignocelulose de um tubo de diluição de 10 a menos três.Deixe os pratos secarem por 10 a 15 minutos antes de incubar a 25 graus Celsius no escuro por 15 dias. Verifique todas as colônias fúngicas presentes para semelhanças. Se necessário, prepare um slide a ser observado sob um microscópio leve.Sob um gabinete de fluxo laminar ou em um queimador Bunsen, isole cada cepa fúngica escolhida removendo suavemente uma pequena parte do micélio da colônia com uma agulha de inoculação estéril. Transfira a colônia isolada para um novo ágar extrato de malte, ou MEA, prato. Transfira 20 mililitros de Bushnell Haas, ou meio BH, em frascos de vidro de 50 mililitros.Transfira sete mililitros de água deionizada em frascos de 15 mililitros e adicione pedaços de tampa de vidro quebrada em cada frasco. Esterilize os frascos autoclavando a 121 graus Celsius por 20 minutos. Para testar o crescimento no petrolato, adicione um mililitro de petrolatum a cada frasco BH de 50 mililitros usando uma pipeta estéril sob o armário de fluxo laminar.Mantenha alguns frascos com apenas BH como controle negativo. Remova o micélio na superfície do meio da placa MEA com a cepa fúngica escolhida usando uma agulha estéril e transfira-o para um frasco de vidro de 15 mililitros com os deslizamentos de cobertura quebrados. Agitar o frasco em um misturador de vórtice por dois minutos, permitindo que a tampa quebrada deslize para cortar o cubo da colônia fúngica, fazendo uma suspensão.Inocular cada frasco de petrolatum com suspensão de 200 microliters. Faça duas réplicas para cada cepa fúngica. Para o controle negativo, adicione 200 microliters de suspensão fúngica no frasco contendo apenas meio BH.Além disso, mantenha o frasco com petrolato sem qualquer inoculação fúngica para verificar se há contaminação no meio. Incubar os frascos a 25 graus Celsius no escuro e observá-los após 15 e 30 dias do inóculo. Para testar o crescimento do óleo do motor usado, transfira 500 microliters de óleo usado do motor para a placa BHA Petri e distribua o óleo uniformemente.Em seguida, inocular a placa com tensão fúngica coletando o micélio das placas MEA. Para testar o crescimento em plásticos, transfira 200 microliters de suspensão fúngica para uma placa de 96 microwell. Faça três réplicas da combinação fúngica de plástico de tensão.Adicione 10 miligramas de um pó plástico diferente a cada poço com a suspensão fúngica. Para o controle negativo, adicione 200 microliters de BH médio ao poço com a suspensão fúngica. Além disso, para cada pó plástico, encha um poço com 200 microlitres de solução BH e 10 miligramas de cada pó plástico para verificar se há contaminação.Incubar as placas a 25 graus Celsius no escuro e observá-las após 15 e 30 dias. Para o teste calorimétrico de laccases qualitativos, prepare um litro de ágar de dextrose de batata, ou PDA, e autoclave por 20 minutos. Depois de autoclaving, quando o meio esfriou, mas ainda é líquido, adicione 400 microliters de guaiacol sob um capô de fluxo laminar e emplaque-o em placas de Petri.Inocular a placa de guaiacol PDA com cepa fúngica coletando o micélio da placa MEA. Para controles negativos, prepare as placas PDA com cada cepa fúngica e uma placa com PDA e guaiacol. Incubar as placas a 25 graus Celsius no escuro e observá-las após sete dias.Para o teste qualitativo de esterases, prepare um litro de meio Tween 80. Em seguida, coloque o meio em um agitador magnético sem aquecimento com uma barra de agitação dentro do meio. Após 10 minutos, quando tudo estiver derretido, transfira cinco mililitros do meio em frascos estéreis de 20 mililitros e autoclave.Adicione 200 microliters de suspensão fúngica ao frasco médio esterilizado Tween 80. Para o controle negativo, adicione cinco mililitros de meio BH autoclaved em um frasco de 20 mililitros. Em seguida, adicione 200 microliters de suspensão fúngica ao frasco.Incubar os frascos a 25 graus Celsius no escuro por 21 dias e observá-los a cada sete dias. A porcentagem de cepas fúngicas capazes de crescer em petrolatum, óleo de motor usado e pós plásticos como sua única fonte de carbono com diferentes graus de sucesso foi avaliada. A capacidade dos fungos de explorar o petrolatum foi avaliada como a diferença no crescimento das colônias entre BH controlada e contendo petrolatum.Quase 75% das cepas testadas foram capazes de usar o petrolato como sua única fonte de carbono e 21% apresentaram crescimento máximo. O crescimento das placas contendo apenas BHA e na presença de óleo do motor também foi monitorado. Quase 90% das cepas cresceram com óleo de motor usado, com 39% mostrando crescimento máximo.A formação de um halo acin marrom-vermelho ao redor da colônia fúngica indicou maior produção de laccases e outras enzimas ligninolíticas. Aproximadamente 60% dos fungos foram capazes de produzir laccases. Além disso, 17% das cepas produziram um intenso halo escuro ao redor da colônia no meio guaiacol.A atividade de Esterases foi avaliada pela formação de um precipitado branco em Tween 80 médio. Quase 60% das cepas apresentaram atividade de esterases e 13% demonstraram maior formação precipitada. Este protocolo pode ser adaptado para tela para fungos capazes de degradar qualquer poluente adicionando a substância recalcitrante de interesse a um meio de cultura mínimo.

isolation-screening-from-soil-biodiversity-for-fungi-involved

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Fonte: Villela, H. D. M. , et al. Prospectação de Cepas Microbianas para Biorremediação e Desenvolvimento de Probióticos para Pesquisa e Preservação de Metaorganismos. J. Vis. Exp. (2019).Este vídeo demonstra o isolamento de bactérias marinhas degradadoras de poluentes por diluição em série, seleção de colônias e crescimento em meio contendo EE2. Ao usar EE2 como única fonte de carbono, o protocolo identifica cepas bacterianas capazes de metabolizar esse poluente ambiental.

Triagem de Bactérias Marinhas para o Isolamento de Cepas Degradantes de Poluentes

Filmes plásticos rotulados como "biodegradável" estão disponíveis comercialmente para uso agrícola como coberturas. Preparo representa um método de eliminação atraente, mas a degradação sob condições de campo é mal compreendida. O objetivo deste estudo foi desenvolver métodos para isolar fungos de solo nativo e bactérias que colonizam filmes mulch plástico após o enterro de campo.

Isolamento de microrganismos do solo nativas com potencial para romper as biodegradáveis ​​Palha filmes plásticos usados ​​na agricultura

Aqui apresentamos um protocolo baseado no sistema de isca mealworm (Tenebrio molitor)-isca que foi utilizado para isolar e selecionar fungos entomopatômicos (EPF) a partir de amostras de solo. Uma fórmula eficaz de número de conidia (ECN) é usada para selecionar EPF tolerante ao alto estresse com base em características fisiológicas para controle microbiano de pragas no campo.

Isolamento e Seleção de Fungos Entomopatômicos de Amostras de Solo e Avaliação da Virulência Fúngica contra Pragas de Insetos

Colônias fúngicas entomopatômicas são isoladas de amostras de solo tropical usando isca tenebrio , isca de Galleria , bem como meio artificial seletivo, ou seja, ágar de dextrose de batata enriquecido com extrato de levedura suplementado com clorofenicol, tiaabzolendae e ciclohexmida (meio CTC).

Comparação de métodos para isolar fungos entomopatômicos de amostras de solo

Este protocolo é um método eficaz e rápido de cultivo de leveduras e o molde Aspergillus fumigatus de grandes conjuntos de amostras de solo em apenas 7 dias. Os métodos podem ser facilmente modificados para acomodar uma gama de mídias de incubação e temperaturas conforme necessário para experimentos.

Isolamento de Leveduras culturais e moldes de solos para investigar estrutura populacional fúngica

O isolamento de micróbios resistentes a metais pesados de fontes geotérmicas é um tema quente para o desenvolvimento de bioremediação e monitoramento ambiental de biossistemas. Este estudo fornece uma abordagem metodológica para isolar e identificar bactérias tolerantes a metais pesados a partir de fontes termais.

Bioprospecção de microrganismos extreílicos para enfrentar a poluição ambiental

O presente artigo tem como objetivo fornecer protocolos detalhados e adequados para o isolamento de fungos endofíticos associados a plantas, preservação a longo prazo de isolados, caracterização morfológica e extração de DNA total para posterior identificação molecular e análises metagenômicas.

Isolamento, caracterização e extração de DNA total para identificação de fungos endofíticos em plantas micoheterotróficas

Este protocolo descreve o projeto e o uso de um chip de isolamento (iChip) para o cultivo in situ de micróbios recalcitrantes do solo em seu ambiente natural. Também descreve o cultivo in situ de bactérias do solo produtoras de antimicrobianos. O protocolo pode ser adaptado para recuperar bactérias de diversos nichos com outras propriedades desejáveis.

In situ Isolamento e Cultura de Bactérias Recalcitrantes do Solo usando um Chip de Isolamento (iChip)

Este vídeo mostra um procedimento para isolar protoplastos intactos a partir de tecidos de 14 dias de idade, mudas de Arabidopsis. Dado que o protoplastos isolados permanecem intactos por pelo menos 96h e são isoladas de mudas, em vez de um mês de idade plantas maduras, esse procedimento agiliza ensaios exigindo protoplastos intactos.

Isolamento de Protoplastos de tecidos de 14 dias de idade, mudas de Arabidopsis thaliana</em

Uma busca fundamentais em biologia celular é definir os mecanismos subjacentes à identidade dos organelos que tornam as células eucarióticas. Aqui é proposto um método para identificar os genes responsáveis ​​pela integridade morfológica e funcional de organelas vegetais utilizando microscopia de fluorescência e as ferramentas a próxima geração de sequenciação.

Microscopia de fluorescência de Triagem e seqüenciamento da próxima geração: Ferramentas úteis para a identificação de genes envolvidos na integridade das Organelas

Aprenda a isolar fungos do solo com potencial de biorremediação para degradar poluentes recalcitrantes como hidrocarbonetos e plásticos. Este protocolo de baixo custo utiliza meios seletivos e ensaios enzimáticos para identificar cepas promissoras.

Isolamento e Triagem da Biodiversidade do Solo para Fungos Envolvidos na Degradação de Materiais Recalcitrantes

Explorar mais vídeos