Name: Estratégias de inoculação para infectar raízes vegetais com microrganismos transportados pelo solo (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-01T13:20:00.000+00:00
Duration: 8 min 16 s
Description: Aprenda três sistemas de inoculação radicular para estudar interações entre plantas e microrganismos do solo usando Verticillium e Arabidopsis. Esses métodos permitem análises moleculares, citológicas e histológicas.

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Os autores reconhecem Tim Iven e Jaqueline Komorek por trabalhos anteriores sobre esses métodos, o grupo de Wolfgang Dröge-Laser (Departamento de Biologia Farmacêutica da Universidade de Würzburg, Alemanha) por fornecer os equipamentos e os recursos necessários para este trabalho, e Wolfgang Dröge-Laser, bem como Philipp Kreisz (ambos da Universidade de Würzburg) para a revisão crítica do manuscrito. Este estudo foi apoiado pela "Deutsche Forschungsgemeinschaft" (DFG, DR273/15-1,2).

<ol><li>Mendes, R., Garbeva, P., Raaijmakers, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+rhizosphere+microbiome%3A+significance+of+plant+beneficial%2C+plant+pathogenic%2C+and+human+pathogenic+microorganisms%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiology+Review%22%5BJournal%5D)">The rhizosphere microbiome: significance of plant beneficial, plant pathogenic, and human pathogenic microorganisms.</a> FEMS Microbiology Review. 37 (5), 634-663 (2013).</li>
<li>Yadeta, K. A., Thomma, B. P. H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+xylem+as+battleground+for+plant+hosts+and+vascular+wilt+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">The xylem as battleground for plant hosts and vascular wilt pathogens.</a> Frontiers in Plant Science. 4, 97(2013).</li>
<li>Delgado-Baquerizo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+proportion+of+soil-borne+pathogens+increases+with+warming+at+the+global+scale%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Climate+Change%22%5BJournal%5D)">The proportion of soil-borne pathogens increases with warming at the global scale.</a> Nature Climate Change. 10 (6), 550-554 (2020).</li>
<li>Berendsen, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disease-induced+assemblage+of+a+plant-beneficial+bacterial+consortium%5BTitle%5D)+AND+%22The+ISME+Journal%22%5BJournal%5D)">Disease-induced assemblage of a plant-beneficial bacterial consortium.</a> The ISME Journal. 12 (6), 1496-1507 (2018).</li>
<li>Yuan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Root+exudates+drive+the+soil-borne+legacy+of+aboveground+pathogen+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiome%22%5BJournal%5D)">Root exudates drive the soil-borne legacy of aboveground pathogen infection.</a> Microbiome. 6 (1), 156(2018).</li>
<li>Liu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+the+plant+recruitment+of+beneficial+microbes+to+suppress+soil-borne+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytologist%22%5BJournal%5D)">Evidence for the plant recruitment of beneficial microbes to suppress soil-borne pathogens.</a> New Phytologist. 229 (5), 2873-2885 (2021).</li>
<li>Wang, H., Liu, R., You, M. P., Barbetti, M. J., Chen, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogen+biocontrol+using+plant+growth-promoting+bacteria+%28PGPR%29%3A+role+of+bacterial+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22Microorganisms%22%5BJournal%5D)">Pathogen biocontrol using plant growth-promoting bacteria (PGPR): role of bacterial diversity.</a> Microorganisms. 9 (9), 1988(2021).</li>
<li>Inderbitzin, P., Subbarao, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Verticillium+systematics+and+evolution%3A+how+confusion+impedes+Verticillium+wilt+management+and+how+to+resolve+it%5BTitle%5D)+AND+%22Phytopathology%22%5BJournal%5D)">Verticillium systematics and evolution: how confusion impedes Verticillium wilt management and how to resolve it.</a> Phytopathology. 104 (6), 564-574 (2014).</li>
<li>Eynck, C., Koopmann, B., Grunewaldt-Stoecker, G., Karlowsky, P., von Tiedemann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+interactions+of+Verticillium+longisporum+und+V.+dahliae+with+Brassica+napus+with+molecular+and+histological+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Plant+Pathology%22%5BJournal%5D)">Differential interactions of Verticillium longisporum und V. dahliae with Brassica napus with molecular and histological techniques.</a> European Journal of Plant Pathology. 118 (3), 259-274 (2007).</li>
<li>Floerl, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defence+reactions+in+the+apoplastic+proteome+of+oilseed+rape+%28Brassica+napus+var.+napus%29+attenuate+Verticillium+longisporum+growth+but+not+disease+symptoms%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Defence reactions in the apoplastic proteome of oilseed rape (Brassica napus var. napus) attenuate Verticillium longisporum growth but not disease symptoms.</a> BMC Plant Biology. 8, 129(2008).</li>
<li>Leonard, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Verticillium+longisporum+elicits+media-dependent+secretome+responses+with+capacity+to+distinguish+between+plant-related+environments%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Verticillium longisporum elicits media-dependent secretome responses with capacity to distinguish between plant-related environments.</a> Frontiers in Microbiology. 11, 1876(2020).</li>
<li>Depotter, J. R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Verticillium+longisporum%2C+the+invisible+threat+to+oilseed+rape+and+other+brassicaceous+plant+hosts%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant+Pathology%22%5BJournal%5D)">Verticillium longisporum, the invisible threat to oilseed rape and other brassicaceous plant hosts.</a> Molecular Plant Pathology. 17 (7), 1004-1016 (2016).</li>
<li>Fröschel, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+gain-of-function+screen+reveals+redundant+ERF+transcription+factors+providing+opportunities+for+resistance+breeding+toward+the+vascular+fungal+pathogen+Verticillium+longisporum%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant-Microbe+Interactions%22%5BJournal%5D)">A gain-of-function screen reveals redundant ERF transcription factors providing opportunities for resistance breeding toward the vascular fungal pathogen Verticillium longisporum.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions. 32 (9), 1095-1109 (2019).</li>
<li>Zhou, L., Hu, Q., Johansson, A., Dixelius, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Verticillium+longisporum+and+V.+dahliae%3A+infection+and+disease+in+Brassica+napus%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Pathology%22%5BJournal%5D)">Verticillium longisporum and V. dahliae: infection and disease in Brassica napus.</a> Plant Pathology. 55 (1), 137-144 (2006).</li>
<li>Ralhan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+vascular+pathogen+Verticillium+longisporum+requires+a+jasmonic+acid-independent+COI1+function+in+roots+to+elicit+disease+symptoms+in+Arabidopsis+shoots%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">The vascular pathogen Verticillium longisporum requires a jasmonic acid-independent COI1 function in roots to elicit disease symptoms in Arabidopsis shoots.</a> Plant Physiology. 159 (3), 1192-1203 (2012).</li>
<li>Reusche, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stabilization+of+cytokinin+levels+enhances+Arabidopsis+resistance+against+Verticillium+longisporum%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant-Microbe+Interactions%22%5BJournal%5D)">Stabilization of cytokinin levels enhances Arabidopsis resistance against Verticillium longisporum.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions. 26 (8), 850-860 (2013).</li>
<li>Iven, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+activation+and+production+of+tryptophan-derived+secondary+metabolites+in+Arabidopsis+roots+contributes+to+the+defense+against+the+fungal+vascular+pathogen+Verticillium+longisporum%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant%22%5BJournal%5D)">Transcriptional activation and production of tryptophan-derived secondary metabolites in Arabidopsis roots contributes to the defense against the fungal vascular pathogen Verticillium longisporum.</a> Molecular Plant. 5 (6), 1389-1402 (2012).</li>
<li>Reusche, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infections+with+the+vascular+pathogens+Verticillium+longisporum+and+Verticillium+dahliae+induce+distinct+disease+symptoms+and+differentially+affect+drought+stress+tolerance+of+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+and+Experimental+Botany%22%5BJournal%5D)">Infections with the vascular pathogens Verticillium longisporum and Verticillium dahliae induce distinct disease symptoms and differentially affect drought stress tolerance of Arabidopsis thaliana.</a> Environmental and Experimental Botany. 108, 23-37 (2014).</li>
<li>Fröschel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-depth+evaluation+of+root+infection+systems+using+the+vascular+fungus+Verticillium+longisporum+as+soil-borne+model+pathogen%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Methods%22%5BJournal%5D)">In-depth evaluation of root infection systems using the vascular fungus Verticillium longisporum as soil-borne model pathogen.</a> Plant Methods. 17 (1), 57(2021).</li>
<li>Karapapa, V. K., Bainbridge, B. W., Heale, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+and+molecular+characterization+of+Verticillium+longisporum+comb%2C+nov.%2C+pathogenic+to+oilseed+rape%5BTitle%5D)+AND+%22Mycological+Research%22%5BJournal%5D)">Morphological and molecular characterization of Verticillium longisporum comb, nov., pathogenic to oilseed rape.</a> Mycological Research. 101 (11), 1281-1294 (1997).</li>
<li>Poncini, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+roots+of+Arabidopsis+thaliana%2C+the+damage-associated+molecular+pattern+AtPep1+is+a+stronger+elicitor+of+immune+signalling+than+flg22+or+the+chitin+heptamer%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">In roots of Arabidopsis thaliana, the damage-associated molecular pattern AtPep1 is a stronger elicitor of immune signalling than flg22 or the chitin heptamer.</a> PLoS One. 12 (10), 1-21 (2017).</li>
<li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NIH+Image+to+ImageJ%3A+25+years+of+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li>
<li>Fradin, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+dissection+of+Verticillium+wilt+resistance+mediated+by+tomato+Ve1%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Genetic dissection of Verticillium wilt resistance mediated by tomato Ve1.</a> Plant Physiology. 150 (1), 320-332 (2009).</li>
<li>Singh, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+plant+host+Brassica+napus+induces+in+the+pathogen+Verticillium+longisporum+the+expression+of+functional+catalase+peroxidase+which+is+required+for+the+late+phase+of+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant-Microbe+Interactions%22%5BJournal%5D)">The plant host Brassica napus induces in the pathogen Verticillium longisporum the expression of functional catalase peroxidase which is required for the late phase of disease.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions. 25 (4), 569-581 (2012).</li>
<li>Zeise, K., von Tiedemann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+RAPD-PCR+for+virulence+type+analysis+within+Verticillium+dahliae+and+Verticillium+longisporum%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Phytopathology%22%5BJournal%5D)">Application of RAPD-PCR for virulence type analysis within Verticillium dahliae and Verticillium longisporum.</a> Journal of Phytopathology. 150 (10), 557-563 (2002).</li>
<li>Fröschel, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+roots+employ+cell-layer-specific+programs+to+respond+to+pathogenic+and+beneficial+microbes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+%26+Microbe%22%5BJournal%5D)">Plant roots employ cell-layer-specific programs to respond to pathogenic and beneficial microbes.</a> Cell Host & Microbe. 29 (2), 299-310 (2021).</li>
<li>Gigolashvili, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcription+factor+HIG1%2FMYB51+regulates+indolic+glucosinolate+biosynthesis+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">The transcription factor HIG1/MYB51 regulates indolic glucosinolate biosynthesis in Arabidopsis thaliana.</a> The Plant Journal. 50 (5), 886-901 (2007).</li>
<li>Back, M. A., Haydock, P. P. J., Jenkinson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disease+complexes+involving+plant+parasitic+nematodes+and+soilborne+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Pathology%22%5BJournal%5D)">Disease complexes involving plant parasitic nematodes and soilborne pathogens.</a> Plant Pathology. 51 (6), 683-697 (2002).</li>
<li>Behrens, F. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+abscisic+acid+biosynthesis+at+the+early+infection+stage+of+Verticillium+longisporum+in+oilseed+rape+%28Brassica+napus%29%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant+Pathology%22%5BJournal%5D)">Suppression of abscisic acid biosynthesis at the early infection stage of Verticillium longisporum in oilseed rape (Brassica napus).</a> Molecular Plant Pathology. 20 (12), 1645-1661 (2019).</li>
<li>Vorholt, J. A., Vogel, C., Carlström, C. I., Müller, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishing+causality%3A+opportunities+of+synthetic+communities+for+plant+microbiome+research%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+%26+Microbe%22%5BJournal%5D)">Establishing causality: opportunities of synthetic communities for plant microbiome research.</a> Cell Host & Microbe. 22 (2), 142-155 (2017).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Devido às enormes perdas de rendimento causadas pelos fitopatógenos transportados pelo solo1, é necessária uma melhoria das estratégias agrícolas ou variedades de culturas. A visão limitada da patogênese das doenças transmitidas pelo solo dificulta o desenvolvimento de plantas mais resistentes. Os mecanismos subjacentes precisam ser explorados, para os quais uma plataforma metodológica robusta é necessária. Os procedimentos de inoculação relatados mostraram que eventos multifatoriais em interações...

Solos naturais são habitados por um número surpreendente de micróbios que podem ser neutros, prejudiciais ou benéficos para as plantas1. Muitos patógenos vegetais são transportados pelo solo, cercam as raízes e atacam o órgão subterrâneo. Esses microrganismos pertencem a uma grande variedade de clados: fungos, oomycetes, bactérias, nematoides, insetos e alguns vírus 1,2. Uma vez que as condições ambientais favoreçam a infecção, as plantas suscetíveis se tornarão doentes e a produção de culturas diminuirá. Os efeitos das mudanças climáticas, como o aquecimento global e os extremos climáticos, aumentarão a proporção de patógenos vegetais transportados pelo solo3. Portanto, será cada vez mais importante estudar esses micróbios destrutivos e seu impacto na produção de alimentos e rações, mas também nos ecossistemas naturais. Além disso, há mutualistas microbianos no solo que interagem firmemente com raízes e promovem o crescimento, o desenvolvimento e a imunidade das plantas. Quando confrontadas com patógenos, as plantas podem recrutar ativamente oponentes específicos na rizosfera que podem suportar a sobrevivência do hospedeiro suprimindo patógenos 4,5,6,7. No entanto, detalhes mecanicistas e caminhos envolvidos em interações benéficas entre micróbios radiculares ainda são desconhecidos6.
É, portanto, essencial ampliar a compreensão geral das interações raiz-micróbios. Métodos confiáveis para inocular raízes com microrganismos transportados pelo solo são necessários para realizar estudos de modelo e transferir os achados para aplicações agrícolas. Interações benéficas no solo são estudadas, por exemplo, com serndipita indica (anteriormente conhecida como Piriformospora indica), fixação de nitrogênio Rhizobium spp., ou fungos micorrizais, enquanto os patógenos vegetais suportados pelo solo incluem Ralstonia solanacearum, Phytophthora spp., Fusarium spp., e Verticillium spp.1. Os dois últimos são gêneros fúngicos que são distribuídos globalmente e causam doenças vasculares2. Verticillium spp. (Ascomycota) pode infectar centenas de espécies vegetais - em grande parte dicotyledons, incluindo anuários herbáceos, perenes lenhosos e muitas plantasagrícolas 2,8. A hifa de Verticillium entra na raiz e cresce intercelularmente e intracelularmente em direção ao cilindro central para colonizar os vasos xilema 2,9. Nestes vasos, o fungo permanece durante a maior parte de seu ciclo de vida. Como a seiva de xilema é pobre em nutrientes e carrega compostos de defesa vegetal, o fungo deve se adaptar a este ambiente único. Isso é feito pela secreção de proteínas relacionadas à colonização que permitem que o patógeno sobreviva em seuhospedeiro 10,11. Depois de atingir a vasculatura raiz, o fungo pode se espalhar dentro dos vasos xilem acropetalmente para a folhagem, o que leva à colonização sistêmica do hospedeiro 9,12. Neste ponto, a planta é afetada negativamente no crescimentode 9,10,13. Por exemplo, a desnutrição e as folhas amarelas ocorrem, bem como a senescência prematura 13,14,15,16.
Um membro desse gênero é o Verticillium longisporum, que é altamente adaptado aos hospedeiros brassicaceos, como o estupro da oleosa agronomicamente importante, a couve-flor e a planta modelo Arabidopsis thaliana12. Vários estudos combinaram V. longisporum e A. thaliana para obter extensas percepções sobre doenças vasculares transmitidas pelo solo e as respostas de defesa raiz resultantes 13,15,16,17. Testes de suscetibilidade simples podem ser realizados usando o sistema modelo V. longisporum / A. thaliana e recursos genéticos bem estabelecidos estão disponíveis para ambos os organismos. Intimamente relacionado com V. longisporum é o patógeno Verticillium dahliae. Embora ambas as espécies fúngicas realizem um processo de vida vascular semelhante e de invasão, sua eficiência de propagação de raízes para folhas e os sintomas da doença provocada em A. thaliana são diferentes: enquanto V. longisporum geralmente induz senescência precoce, a infecção por V. dahliae resulta em murchar18. Recentemente, um resumo metodológico apresentou diferentes estratégias de inoculação radicular para infectar A. thaliana com V. longisporum ou V. dahliae, auxiliando no planejamento de configurações experimentais19. No campo, V. longisporum ocasionalmente causa danos significativos na produção de estupro da oleosa12, enquanto V. dahliae tem uma gama hospedeira muito ampla composta por várias espécies cultivadas, como videira, batata e tomate8. Isso torna ambos os modelos economicamente interessantes para estudar.
Assim, os protocolos a seguir usam v . longisporum e V. dahliae como patógenos radiculares modelo para exemplificar possíveis abordagens para inoculações radiculares. Arabidopsis (Arabidopsis thaliana), estupro de oleosa (Brassica napus) e tomate (Solanum lycopersicum) foram escolhidos como hospedeiros modelo. Descrições detalhadas das metodologias podem ser encontradas no texto abaixo e no vídeo que acompanha. São discutidas vantagens e desvantagens para cada sistema de inoculação. Em conjunto, essa coleção de protocolos pode ajudar a identificar um método adequado para questões específicas de pesquisa no contexto de interações root-micróbios.

<table><tbody><tr><td>Ágar (Gelrite)</td><td>Carl Roth</td><td>Nr. 0039</td><td>todos os sistemas descritos requerem Gelrite</td></tr><tr><td>Arabidopsis thaliana</td><td>estoque NASC</td> de tipo selvagem <td>Col-0 (N1092)</td><td></td></tr><tr><td>Autoclave</td><td>Systec</td><td>VE-100</td><td></td></tr><tr><td>BlattFlaeche</td><td>Datinf GmbH</td><td>BlattFlaeche</td><td>software para determinar as áreas foliares</td></tr><tr><td> Brassica napus tipo selvagem</td><td>ver Floerl et al., 2008</td> genoma <td>de estupro de ciclo rápido</td><td>ACaacc</td></tr><tr><td>Cefotaxima sódica</td><td>Duchefa</td><td>C0111</td><td></td></tr><tr><td>Frasco de chicana 500 mL</td><td>Duran Group / neoLab</td><td>E-1090</td><td>Balão Erlenmeyer com quatro defletores</td></tr><tr><td>Tubos de coleta 50 mL</td><td>Sarstedt</td><td>62.547.254</td><td>114 x 28 mm</td></tr><tr><td>Caldo de dextrose Czapek médio</td><td>Duchefa</td><td>C1714</td><td></td></tr><tr><td>Câmera digital</td><td>Nikon</td><td>D3100 18-55 VR</td><td></td></tr><tr><td>Exsiccator (Dessecador )</td><td>Duran Group</td><td>200 DN, 5.8 L</td><td>Selo com tampa para segurar cloro gasoso</td></tr><tr><td>Microscópio de fluorescência</td><td>Leica</td><td>Leica TCS SP5 II</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>Carl Roth</td><td>P074.3</td><td></td></tr><tr><td>KNO3</td><td>Carl Roth</td><td>P021.1</td><td>&ge; 99 %</td></tr><tr><td>KOH</td><td>Carl Roth</td><td>6751</td><td></td></tr><tr><td>Leukopor</td><td>BSN medical GmbH</td><td>2454-00 AP</td><td>fita não tecida 2,5 cm x 9,2 m</td></tr><tr><td>MES (ácido 2-(N-morfolino)etanossulfônico)</td><td>Carl Roth</td><td>4256,2</td><td>Pufferan &ge; 99 %</td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Carl Roth</td><td>T888.1</td><td>Sulfato de magnésio-Heptahidratado</td></tr><tr><td>Murashige & Meio Skoog (MS)</td><td>Duchefa</td><td>M0222</td><td>MS incluindo vitaminas</td></tr><tr><td>NaClO</td><td>Carl Roth</td><td>9062.1</td><td></td></tr><tr><td>Câmaras de crescimento Percival</td><td>CLF Plant Climatics GmbH</td><td>AR-66L2</td><td></td></tr><tr><td>Placas de Petri</td><td>Sarstedt</td><td>82.1473.001</td><td>tamanho &Oslash; xH: 92 &vezes; Copos de plástico de 16 mm</td></tr><tr><td>(500 mL, transparente)</td> <td>Pro-pac, caixa de salada x</td><td>5070</td><td>tamanho: 108 &vezes; 81 &vezes; 102 mm</td></tr><tr><td>Filtro de celulose plissado</td><td>Hartenstein</td><td>FF12</td><td>nível de retenção de partículas 8 12 &mu; m</td></tr><tr><td>poly klima câmara de crescimento</td><td>poly klima GmbH</td><td>PK 520 WLED</td><td></td></tr><tr><td>Caldo de Dextrose de Batata meio</td><td>SIGMA Aldrich</td><td>P6685</td><td>para microbiologia</td></tr><tr><td>Potes</td><td>P&ouml; ppelmann GmbH</td><td>TO 7 D ou TO 9,5 D</td><td>&Oslash; 7 cm resp. &Oslash; 9,5 cm</td></tr><tr><td>PromMYB51::YFP</td><td>ver Poncini et al., 2017</td><td>MYB51 reporter line</td><td>YFP (i.e. 3xmVenus with NLS)</td></tr><tr><td>Tubos de reação 2 mL</td><td>Sarstedt</td><td>72.695.400</td><td>PCR Performance tested</td></tr><tr><td>Agitador rotativo (orbital)</td><td>Edmund B&uuml; hler</td><td>SM 30 C control</td><td></td></tr><tr><td>Areia (areia de pássaro)</td> <td>Bistrô para Animais de Estimação, M&uuml; ller Holding</td><td>786157</td><td></td></tr><tr><td>Soil</td><td>Einheitserde spezial</td><td>SP Pikier (SP ED 63 P)</td><td></td></tr><tr><td>Solanum lycopersicum tipo selvagem</td><td>ver Chavarro-Carrero et al., 2021</td><td>Tipo: Moneymaker</td><td></td></tr><tr><td>Câmara de contagem de células Thoma</td><td>Marienfeld</td><td>642710</td><td>profundidade 0,020 mm; 0,0025 mm2</td></tr><tr><td>Água ultrapura (Milli-Q água purificada)</td><td>MERK</td><td>IQ 7003/7005</td><td>água obtida após purificação</td></tr><tr><td>Verticillium dahliae</td><td>ver Reusche et al., 2014</td><td>isolado JR2</td><td></td></tr><tr><td>Verticillium longisporum</td><td>Zeise e von Tiedemann, 2002</td><td>cepa Vl43</td><td></td></tr></tbody></table>

estratégias de inoculação para infectar raízes vegetais com microrganismos transportados pelo solo

Inoculation Strategies to Infect Plant Roots with Soil-Borne Microorganisms

A rizosfera abriga uma comunidade microbiana altamente complexa na qual as raízes das plantas são constantemente desafiadas. As raízes estão em contato próximo com uma grande variedade de microrganismos, mas estudos sobre interações transmitidas pelo solo ainda estão por trás daqueles realizados em órgãos acima do solo. Embora algumas estratégias de inoculação para infectar plantas modelo com patógenos radiculares modelos sejam descritas na literatura, ainda é difícil obter uma visão geral metodológica abrangente. Para resolver esse problema, três diferentes sistemas de inoculação radicular são precisamente descritos que podem ser aplicados para obter insights sobre a biologia das interações root-micróbios. Para ilustração, as espécies de Verticillium (ou seja, V. longisporum e V. dahliae) foram empregadas como patógenos de modelo invasores radiculares. No entanto, os métodos podem ser facilmente adaptados a outros micróbios colonizadores radiculares - tanto patogênicos quanto benéficos. Ao colonizar a planta xilema, fungos vasculares transmitidos pelo solo, como Verticillium spp. exibem um estilo de vida único. Após a invasão radicular, eles se espalham pelos vasos xilema acropetalmente, chegam ao tiro e provocam sintomas da doença. Três espécies representativas de plantas foram escolhidas como hospedeiras-modelo: Arabidopsis thaliana, estupro de oleosa economicamente importante (Brassica napus) e tomate (Solanum lycopersicum). Protocolos passo a passo são dados. Resultados representativos de ensaios de patogenicidade, análises transcritivas de genes marcadores e confirmações independentes por construções de repórteres são mostrados. Além disso, as vantagens e desvantagens de cada sistema de inoculação são exaustivamente discutidas. Esses protocolos comprovados podem auxiliar no fornecimento de abordagens para perguntas de pesquisa sobre interações entre micróbios radiculares. Saber como as plantas lidam com micróbios no solo é crucial para o desenvolvimento de novas estratégias para melhorar a agricultura.

Seguindo o protocolo, as plantas foram cultivadas e inoculadas com V. longisporum (cepa Vl4325) ou V. dahliae (isolar JR218). Vários cenários foram projetados para provar a eficácia e destacar algumas capacidades dos protocolos determinados. Resultados representativos são mostrados.
A indução expressional de genes envolvidos na biossíntese indol-glucosinolato antimicrobiana (IG) é um indicador confiável para a avaliação...

Este protocolo apresenta um resumo detalhado das estratégias para inocular raízes vegetais com micróbios transportados pelo solo. Exemplificados para os fungos Verticillium longisporum e Verticillium dahliae, três diferentes sistemas de infecção radicular são descritos. Potenciais aplicações e possíveis análises a jusante são destacadas, e vantagens ou desvantagens são discutidas para cada sistema.

Estratégias de inoculação para infectar raízes vegetais com microrganismos transportados pelo solo

The rhizosphere harbors a highly complex microbial community in which plant roots are constantly challenged. Roots are in close contact with a wide ...

Embora inúmeros micróbios colonizem raízes vegetais, essas interações são difíceis de analisar à medida que acontecem no subsolo. Para facilitar isso, esta coleção de protocolos fornece uma visão geral das estratégias para vacinar raízes vegetais com micróbios transportados pelo solo. A inoculação radicular é a base para estudar interações de micróbios radiculares, e usando as seguintes técnicas, as interações podem ser estudadas em nível molecular, citológico ou histológico.Explicamos três sistemas de inoculação usando verticillium como micróbio invasor de raízes, e a planta modelo, arabidopsis. No entanto, a transferência dos métodos para outras plantas, como o estupro de tomate ou obsmes, e para outros micróbios radiculares, por exemplo, serendipita benéfica, é possível. Prepare o verticillium inoculum com antecedência, culminando a micélia em PDB e induzindo esporulação e caldo de dextrose de Czapek.Em seguida, comece despejando o meio autoclaved em placas de Petri. Após o endurecimento do meio, reembale as placas de Petri em um saco plástico estéril e armazene-as de cabeça para baixo durante a noite na geladeira a quatro a 10 graus Celsius. Corte e remova um canal de infecção

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Ambiente

Comece com mudas de arroz pré-germinadas em condições escuras e assépticas para garantir uma germinação uniforme.Transferir estas plântulas para um balão contendo um meio semi-sólido rico em nutrientes, pré-inoculado com uma bactéria de ensaio.À medida que a planta cresce, as raízes liberam compostos quimiotáticos no meio circundante.Esses compostos estimulam a proliferação bacteriana, levando à adesão, multiplicação e formação de colônias na superfície da raiz.À medida que as raízes se...

Colonização endofítica mediada por raízes de bactérias benéficas em arroz

Fonte: Yi, Y., et al. Interação planta-micróbio: resposta transcricional de Bacillus mycoides ao exsudato da raiz da batata J. Vis. Exp. (2018)Este vídeo demonstra a preparação e o tratamento de culturas de Bacillus mycoides para estudar as interações planta-micróbio. Ele descreve as etapas desde a risca de uma cultura de estoque e incubação em meio líquido até a exposição das bactérias aos exsudatos radiculares das plantas sob agitação. O processo culmina na colheita e congelamento instantâneo...

Tratamento de bactérias com exsudatos de raízes de plantas para emular interações planta-micróbio in vitro

Fonte: Rufián, J. S., et.al. Análise de célula única da expressão dos genes de Pseudomonas syringae no tecido vegetal. J. Vis. Exp. (2022)Este vídeo demonstra um método de infiltração a vácuo para introduzir um patógeno bacteriano nas folhas das plantas de Arabidopsis . A abordagem utiliza uma suspensão bacteriana preparada e pulsos de vácuo para permitir uma entrada uniforme através dos estomas, resultando em infecção controlada nas folhas.

Inoculação de um patógeno bacteriano nas folhas de Arabidopsis por infiltração a vácuo

Este protocolo demonstra dois métodos de inoculação de introduzir o entomopatógeno...

Estabelecer Entomopatógenos fúngicas como endófitos: Rumo Controle Biológico endofítico

Descreve-se o uso de um método de injeção de agulha para inocular plantas de milho e teosinto com o pato patogênico biotrófico Ustilago maydis.  O método de inoculação da injeção de agulha facilita a entrega controlada do patógeno fúngico entre as folhas da planta onde o patógeno entra na planta através da formação de appresoria. Este método é altamente eficiente, permitindo inoculações reprodutíveis com u. maydis.

Um método rápido e eficiente para avaliar a patogenicidade dos maydis ustilago nas linhas de milho e teosinte

Crescimento de plantas truncatula Medicago em simbiose com as bactérias fixadoras de nitrogênio meliloti Sinorhizobium em microcosmos, estéreis individuais feitas a partir de placas de laboratório padrão permite o exame freqüente de sistemas de raízes e nódulos, sem comprometer a esterilidade. As plantas podem ser mantidos em câmaras de crescimento para estes até 9 semanas.

Single-plantas, estéreis Microcosmos para a nodulação e crescimento da planta da leguminosa<em&gt; Medicago truncatula</em&gt; Com o rizóbio Symbiont<em&gt; Sinorhizobium meliloti</em

Agroinfiltração e agroinfecção PVX são ensaios funcionais de rotina para expressão ectópica transitória de genes nas plantas. Esses métodos são ensaios eficientes em estratégias de efeitoomia (resistência rápida e descoberta genética de avirulência) e cruciais para pesquisas modernas em patologia molecular vegetal. Eles atendem à demanda por uma análise funcional robusta de alto rendimento nas plantas.

Agroinfiltração e Agroinfecção PVX em Batata e Nicotiana benthamiana

O sistema de cocultivação hidropônico descrito suporta plantas intactas com telas de malha metálica e as coculata com bactérias. O tecido vegetal, as bactérias e as moléculas segregadas podem então ser colhidas separadamente para análises a jusante, permitindo simultaneamente que as respostas moleculares de ambos os hospedeiros de plantas e micróbios ou microbiomas interativos sejam investigadas.

Um sistema de co-cultivo hidropônico para análises simultâneas e sistemáticas de interações moleculares e sinalizadoras de plantas / micróbios

A pinça da cabeça basal da planta de pimenta preta é um método breve e de economia de tempo para danificá-la. Aqui, fornecemos passos detalhados com um vídeo para infectar plantas de pimenta preta.

Um método eficaz de inoculação para Phytophthora capsici em plantas de pimenta preta

Gerenciar o murmúrio fusarium de melancia requer o conhecimento das raças patógenas presentes. Aqui, descrevemos os métodos de inoculação de root-dip, infestado de kernel e métodos modificados de inoculação de mergulho de bandeja para demonstrar sua eficácia na digitação racial do fungo patogênico Fusarium oxysporum f. sp niveum (Fon).

Um Contraste de Três Técnicas de Inoculação usado para determinar a raça do fusarium desconhecido oxysporum f.sp. niveum Isolados

Aprenda três sistemas de inoculação radicular para estudar interações entre plantas e microrganismos do solo usando Verticillium e Arabidopsis. Esses métodos permitem análises moleculares, citológicas e histológicas.

Estratégias de inoculação para infectar raízes vegetais com microrganismos transportados pelo solo

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