Name: Óptica não linear livre de rótulos para o estudo de defeitos dependentes de tubulina na mielina central (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-03-24T12:20:00.000+00:00
Duration: 8 min 7 s
Description: Aprenda microscopia de geração de segundo harmônico para detectar oligodendrócitos em modelos de tubulinopatia. Este método avançado permite estudar dinâmica de microtúbulos em doenças neurológicas sem marcação.

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Este trabalho foi apoiado pelo Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT) através das seguintes subvenções: infraestructura 226450 ao VP-CIO, infraestructura 255277 a V.P. e FORDECYT-PRONACES/194171/2020 a V.H. Reconhecemos o apoio de Juvenal Hernández Guevara no CIO na produção de vídeos.

Todos os procedimentos descritos foram feitos em conformidade com as leis e códigos aprovados no sétimo título do Regulamento da Lei Geral de Saúde Relativa à Pesquisa em Saúde do Governo Mexicano (NOM-062-ZOO-1999) e de acordo com as recomendações do Guia dos Institutos Nacionais de Saúde para o Cuidado e Uso de Animais Experimentais e foram aprovados pelo comitê institucional de bioética em pesquisa da Universidad de Guanajuato e Benemérita Universidad Autónoma de Puebla.
1. Configurações do microscópio
<ol><li>Ligue o sistema de microscopia.</li>
	<li>Ligue o laser pulsado para garantir que ele estará pronto para lascar em um nível de potência ideal e constante após a extração e preparação da amostra.</li>
	<li>Ajuste o laser para 810 nm. Para estudar os microtúbulos tissulares, utiliza-se 10%-20% da potência laser disponível, o que, no sistema descrito, corresponde a 13-26 mW medidos no plano focal posterior da objetiva.</li>
	<li>Certifique-se de que o microscópio esteja alinhado a Köhler (Arquivo Suplementar 1), com o objetivo que será usado para a imagem SHG. NOTA: Isto é importante uma vez que, na configuração comercial utilizada neste trabalho, a detecção é realizada no modo de transmissão e através do condensador.</li>
	<li>Remova filtros indesejados do caminho de detecção óptica (Figura 1A).</li>
	<li>Certifique-se de que o diafragma do condensador esteja totalmente aberto para garantir que nenhuma luz seja parada desnecessariamente nesse nível.</li>
	<li>Prepare uma objetiva de imersão em óleo de abertura numérica (NA) de 25x/0,8 com uma pequena gota de óleo de imersão na lente. NOTA: Este objetivo foi utilizado para melhor corresponder ao condensador NA, que foi de 0,55 (idealmente, NAcond≥ NAobj).</li>
</ol>2. Controles preliminares do microscópio
NOTA: Execute os controles preliminares do microscópio uma vez, a menos que a configuração seja modificada.
<ol><li>Imagem amido de milho seco ensanduichado entre lâminas de vidro com parâmetros SHG para gerar imagens SHG que revelam a direção da polarização do laser. Siga as etapas relatadas no Arquivo Suplementar 2, exceto para a potência do laser, que é inferior a 5% para o amido de milho.</li>
	<li>Pegue uma imagem de grãos esparsos de amido de milho e marque a orientação dos lóbulos SHG no plano x-y. Essa orientação corresponde à orientação do laser (Figura 2A).</li>
	<li>Como controle, pegue outra imagem da mesma amostra, inserindo no caminho óptico uma placa de meia onda (posição mostrada na Figura 1A) para alterar a direção de oscilação do laser. A imagem resultante exibe lóbulos de sinal SHG girados (Figura 2B, C).</li>
	<li>Se estiver usando um tipo diferente de filtro passa-banda para o SHG, verifique se ele tem propriedades de transmissão ideais comparando as imagens (Figura 2D, E) e as intensidades de sinal pixel por pixel ao longo de uma varredura de linha (Figura 2F).</li>
</ol>3. Extração de tecidos
NOTA: Use sempre ferramentas limpas para realizar os procedimentos cirúrgicos.
<ol><li>Use ratos taiep de 6 a 12 meses de idade e controles Sprague-Dawley (WT) com idade correspondente.</li>
	<li>Anestesiar os animais com uma injeção i.p. de uma mistura de cetamina-xilazina (0,125 mg/Kg e 5 mg/Kg) diluída numa solução de NaCl estéril a 0,9%.<ol><li>Verifique os reflexos de dor e prossiga apenas se eles estiverem ausentes.</li>
	</ol></li>
	<li>Sacrifice o animal via decapitação.</li>
	<li>Uma vez que a cabeça esteja isolada, abra os ossos da abóbada craniana cuidadosamente ao longo da linha média, começando do ponto mais caudal no topo em direção ao nariz, das cavidades orbitais em direção à linha média e, em seguida, do ponto mais caudal até abaixo do cérebro e do cerebelo. NOTA: Cortadores de ossos e Rongeurs permitem a remoção adequada dos ossos da cabeça sem danificar as estruturas cerebrais.</li>
	<li>Solte o cérebro e o cerebelo do osso. Os dois hemisférios poderiam ser separados. Se os hemisférios estiverem divididos, use uma metade para imagens SHG e fixe a outra metade em paraformaldeído a 3,7% em solução salina tamponada com fosfato (PBS) por 20 minutos dentro de um exaustor químico para posterior seccionamento e coloração.</li>
</ol>4. Seccionamento do vibratome
<ol><li>Prepare uma bandeja tampão vibratome cheia de solução salina balanceada (HBSS) quente (37 °C).</li>
	<li>Fixe o cérebro à placa da amostra usando cola de cianoacrilato através de um pedaço de fita adesiva. A porção/região mais caudal entra em contato com a cola para que as seções coronais utilizáveis da porção oposta e rostral possam ser cortadas.<ol><li>Permitir ~10 s para que a cola polimerize para obter a fixação efetiva da amostra. NOTA: Os melhores resultados são obtidos quando o cérebro é orientado de modo que a lâmina corte "de cima para baixo" em vez de "de um lado para o outro" (Figura 1B).</li>
	</ol></li>
	<li>Transfira a placa da amostra para o seu suporte magnético dentro da bandeja tampão.</li>
	<li>Comece a cortar seções de 300-500 μm até que as fatias produzidas abranjam toda a superfície do cérebro.</li>
	<li>Neste ponto, reduza a espessura da seção para 160 μm.</li>
	<li>Uma vez que uma seção completa de 160 μm seja cortada ao nível do corpo caloso, recupere-a com uma pipeta Pasteur de vidro modificada com um grande orifício inflamado (Figura 1C).</li>
	<li>Transfira-o para uma placa de Petri limpa com novo HBSS quente ou diretamente para o suporte de vidro para microscopia (coverslip ou prato com fundo de vidro). NOTA: Para as condições experimentais descritas, a adição de uma folha de cobertura acima da amostra é prejudicial para a imagem.</li>
</ol>5. Transferência para o microscópio
<ol><li>Se o microscópio estiver em uma sala diferente, prepare uma caixa isolada com pacotes de gel aquecidos para transferir as seções de tecido, mantendo a temperatura. A caixa também serve para manter as seções quentes até que sejam fotografadas.</li>
	<li>Coloque a amostra sob o microscópio e certifique-se de que ela está posicionada adequadamente sob a objetiva por observação direta através dos óculos com luz transmitida. NOTA: O objetivo é alinhar as estruturas emissoras previstas com a direção de oscilação do laser para maximizar o sinal SHG emitido (e, portanto, detectado).</li>
	<li>Remova o excesso de HBSS para que uma película líquida fina cubra toda a amostra. Verifique visualmente o filme líquido a cada poucos minutos para evitar a evaporação excessiva e a secagem da amostra. NOTA: Nas condições descritas, uma seção é usada por não mais de 20 minutos. A secagem da amostra causa efeitos artifactuais drásticos (Figura 1A suplementar). Em vez de adicionar mais HBSS, recomenda-se a imersão periódica da seção em meio quente e fresco se forem necessários tempos de imagem mais longos. O uso de câmaras de perfusão e cola ou agarose de baixa fusão para imobilizar o tecido também é recomendado quando experimentos mais longos devem ser feitos.</li>
	<li>Prepare o estágio do microscópio para imagens não desenterradas, o que pode incluir fechar todas as portas da câmara de incubação escura ou cobrir a câmara de incubação com um tecido revestido de poliuretano de nylon preto.</li>
</ol>6. Imagens
<ol><li>Selecione o modo de imagem "não descartado" ao longo do caminho de transmissão. Desta forma, a captura do sinal SH fraco da tubulina será otimizada.</li>
	<li>Selecione o objetivo LCI Plan-Neofluar 25x/0.8 NA.</li>
	<li>Defina uma potência do laser entre 13 mW e 26 mW, com um tempo de permanência de pixels de 12,6 μs. Tire imagens não maiores que 512 pixels x 512 pixels, com velocidade 5 e média 2, para um tempo médio de aquisição de cerca de 15 s. NOTA: O uso de potências de laser mais altas e/ou tempos de permanência mais longos pode danificar a amostra (Figura 1B Suplementar).</li>
	<li>Tire imagens primeiro usando um filtro passa-curto de 485 nm (SP485) e, em uma segunda etapa, adicione um filtro passa-banda nítido de 405 nm (BP405; Figura 3). Siga as etapas relatadas no Arquivo Suplementar 2. NOTA: Imagens de pseudo-campo brilhante podem ser tiradas através do mesmo detector usando a luz laser residual de uma linha visível (lasers de 405 nm ou 488 nm funcionam melhor).</li>
</ol>7. Processamento do cerebelo
<ol><li>Primeiro, corte o cerebelo com um bisturi em dois hemisférios e, em seguida, cole-os ao suporte do vibratome pela porção média (a parte plana obtida após o corte).</li>
	<li>Seção e imagem do cerebelo da mesma forma que foi descrito para o cérebro (seções de 160 μm, mesmas configurações de vibratome, mesma lâmina, mesmas configurações de microscópio, etc.). NOTA: Devido à anatomia do cerebelo, sua orientação no momento da seccionamento não é crítica; na maioria das fatias geradas longe da superfície, haverá folia seccionada bem na substância branca.</li>
</ol>

<ol><li>Palmiter, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+lineage+ablation+in+transgenic+mice+by+cell-specific+expression+of+a+toxin+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cell lineage ablation in transgenic mice by cell-specific expression of a toxin gene.</a> Cell. 50 (3), 435-443 (1987).</li>
<li>Banerjee, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+monoclonal+antibody+against+the+type+II+isotype+of+beta-tubulin.+Preparation+of+isotypically+altered+tubulin%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A monoclonal antibody against the type II isotype of beta-tubulin. Preparation of isotypically altered tubulin.</a> The Journal of Biological Chemistry. 263 (6), 3029-3034 (1988).</li>
<li>Banerjee, A., Roach, M. C., Trcka, P., Luduena, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+a+monoclonal+antibody+specific+for+the+class+IV+isotype+of+beta-tubulin.+Purification+and+assembly+of+alpha+beta+II%2C+alpha+beta+III%2C+and+alpha+beta+IV+tubulin+dimers+from+bovine+brain%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Preparation of a monoclonal antibody specific for the class IV isotype of beta-tubulin. Purification and assembly of alpha beta II, alpha beta III, and alpha beta IV tubulin dimers from bovine brain.</a> The Journal of Biological Chemistry. 267 (8), 5625-5630 (1992).</li>
<li>Banerjee, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+%CE%B2v+tubulin+in+the+cochlea+and+cultured+cells+with+a+novel+monoclonal+antibody%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Motility+and+the+Cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">Localization of βv tubulin in the cochlea and cultured cells with a novel monoclonal antibody.</a> Cell Motility and the Cytoskeleton. 65 (6), 505-514 (2008).</li>
<li>Cross, A. R., Williams, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinky+microtubules%3A+Bending+and+breaking+induced+by+fixation+in+vitro+with+glutaraldehyde+and+formaldehyde%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Motility+and+the+Cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">Kinky microtubules: Bending and breaking induced by fixation in vitro with glutaraldehyde and formaldehyde.</a> Cell Motility and the Cytoskeleton. 20 (4), 272-278 (1991).</li>
<li>Van Steenbergen, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+understanding+of+label-free+second+harmonic+imaging+of+microtubules%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Molecular understanding of label-free second harmonic imaging of microtubules.</a> Nature Communications. 10 (1), 3530(2019).</li>
<li>Campagnola, P. J., Clark, H. A., Mohler, W. A., Lewis, A., Loew, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Second-harmonic+imaging+microscopy+of+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Optics%22%5BJournal%5D)">Second-harmonic imaging microscopy of living cells.</a> Journal of Biomedical Optics. 6 (3), 277(2001).</li>
<li>Campagnola, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+high-resolution+second-harmonic+generation+imaging+of+endogenous+structural+proteins+in+biological+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional high-resolution second-harmonic generation imaging of endogenous structural proteins in biological tissues.</a> Biophysical Journal. 82 (1), 493-508 (2002).</li>
<li>Yu, C. -H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+microtubule+polarity+in+spindles+with+second-harmonic+generation%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Measuring microtubule polarity in spindles with second-harmonic generation.</a> Biophysical Journal. 106 (8), 1578-1587 (2014).</li>
<li>Bancelin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+microtubules+polarity+in+mitotic+spindles+in+situ+using+Interferometric+Second+Harmonic+Generation+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Probing microtubules polarity in mitotic spindles in situ using Interferometric Second Harmonic Generation Microscopy.</a> Scientific Reports. 7, 6758(2017).</li>
<li>Dombeck, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uniform+polarity+microtubule+assemblies+imaged+in+native+brain+tissue+by+second-harmonic+generation+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Uniform polarity microtubule assemblies imaged in native brain tissue by second-harmonic generation microscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (12), 7081-7086 (2003).</li>
<li>Psilodimitrakopoulos, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estimation+of+the+effective+orientation+of+the+SHG+source+in+primary+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Estimation of the effective orientation of the SHG source in primary cortical neurons.</a> Optics Express. 17 (16), 14418(2009).</li>
<li>Sharoukhov, D., Bucinca-Cupallari, F., Lim, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule+imaging+reveals+cytoskeletal+deficit+predisposing+the+retinal+ganglion+cell+axons+to+atrophy+in+DBA%2F2J%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Opthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Microtubule imaging reveals cytoskeletal deficit predisposing the retinal ganglion cell axons to atrophy in DBA/2J.</a> Investigative Opthalmology & Visual Science. 59 (13), 5292(2018).</li>
<li>Alata, M., Piazza, V., Eguibar, J. R., Cortes, C., Hernandez, V. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((H-ABC+tubulinopathy+revealed+by+label-free+second+harmonic+generation+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">H-ABC tubulinopathy revealed by label-free second harmonic generation microscopy.</a> Scientific Reports. 12, 14417(2022).</li>
<li>Duncan, I. D., Lunn, K. F., Holmgren, B., Urba-Holmgren, R., Brignolo-Holmes, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+taiep+rat%3A+A+myelin+mutant+with+an+associated+oligodendrocyte+microtubular+defect%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurocytology%22%5BJournal%5D)">The taiep rat: A myelin mutant with an associated oligodendrocyte microtubular defect.</a> Journal of Neurocytology. 21 (12), 870-884 (1992).</li>
<li>Duncan, I. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mutation+in+the+Tubb4a+gene+leads+to+microtubule+accumulation+with+hypomyelination+and+demyelination%3A+Tubb4a+Mutation%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Neurology%22%5BJournal%5D)">A mutation in the Tubb4a gene leads to microtubule accumulation with hypomyelination and demyelination: Tubb4a Mutation.</a> Annals of Neurology. 81 (5), 690-702 (2017).</li>
<li>Garduno-Robles, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MRI+features+in+a+rat+model+of+H-ABC+tubulinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">MRI features in a rat model of H-ABC tubulinopathy.</a> Frontiers in Neuroscience. 14, 555(2020).</li>
<li>Lopez-Juarez, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Auditory+impairment+in+H-ABC+tubulinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Auditory impairment in H-ABC tubulinopathy.</a> Journal of Comparative Neurology. 529 (5), 957-968 (2021).</li>
<li>Alata, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Longitudinal+evaluation+of+cerebellar+signs+of+H-ABC+tubulinopathy+in+a+patient+and+in+the+taiep+model%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neurology%22%5BJournal%5D)">Longitudinal evaluation of cerebellar signs of H-ABC tubulinopathy in a patient and in the taiep model.</a> Frontiers in Neurology. 12, 702039(2021).</li>
<li>Parodi, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonlinear+optical+microscopy%3A+From+fundamentals+to+applications+in+live+bioimaging%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioengineering+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Nonlinear optical microscopy: From fundamentals to applications in live bioimaging.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 585363(2020).</li>
<li>Lefort, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+biomedical+multiphoton+microscopy+and+its+laser+sources%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physics+D%3A+Applied+Physics%22%5BJournal%5D)">A review of biomedical multiphoton microscopy and its laser sources.</a> Journal of Physics D: Applied Physics. 50 (42), 423001(2017).</li>
<li>Campagnola, P. J., Loew, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Second-harmonic+imaging+microscopy+for+visualizing+biomolecular+arrays+in+cells%2C+tissues+and+organisms%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Second-harmonic imaging microscopy for visualizing biomolecular arrays in cells, tissues and organisms.</a> Nature Biotechnology. 21 (11), 1356-1360 (2003).</li>
<li>vander Knaap, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+syndrome+characterized+by+hypomyelination+with+atrophy+of+the+basal+ganglia+and+cerebellum%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Neuroradiology%22%5BJournal%5D)">New syndrome characterized by hypomyelination with atrophy of the basal ganglia and cerebellum.</a> American Journal of Neuroradiology. 23 (9), 1466(2002).</li>
<li>Stoller, P., Kim, B. -M., Rubenchik, A. M., Reiser, K. M., Da Silva, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polarization-dependent+optical+second-harmonic+imaging+of+a+rat-tail+tendon%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Optics%22%5BJournal%5D)">Polarization-dependent optical second-harmonic imaging of a rat-tail tendon.</a> Journal of Biomedical Optics. 7 (2), 205(2002).</li>
<li>Brown, E. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+measurement+of+gene+expression%2C+angiogenesis+and+physiological+function+in+tumors+using+multiphoton+laser+scanning+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">In vivo measurement of gene expression, angiogenesis and physiological function in tumors using multiphoton laser scanning microscopy.</a> Nature Medicine. 7 (7), 864-868 (2001).</li>
<li>Chakraborti, S., Natarajan, K., Curiel, J., Janke, C., Liu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+emerging+role+of+the+tubulin+code%3A+From+the+tubulin+molecule+to+neuronal+function+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">The emerging role of the tubulin code: From the tubulin molecule to neuronal function and disease.</a> Cytoskeleton. 73 (10), 521-550 (2016).</li>
</ol>

Os autores não têm interesses financeiros concorrentes.

A microscopia SHG faz parte de um grupo de técnicas de óptica não linear, que incluem microscopia de excitação de dois fótons, microscopia de terceira geração harmônica e microscopia coerente de espalhamento Raman anti-Stokes, que contribuíram para expandir a gama de aplicações da microscopia óptica convencional para as ciências da vida20.
Especificamente, a maior força e fraqueza da microscopia SHG referem-se à mesma condição: o gerador de sinal é não-centrossimétrico<...

A imagem óptica de estruturas citoesqueléticas em tecidos e preparações de órgãos não é uma tarefa fácil. Os filamentos citoesqueléticos são onipresentes, portanto, se a coloração genérica for realizada, por exemplo, contra alfa-tubulina ou beta-actina ou potencialmente queratina em uma amostra epitelial, o sinal provavelmente será distribuído de forma bastante homogênea por toda a amostra. Para restringir a coloração a um subconjunto mais significativo de componentes celulares, pode-se usar camundongos transgênicos com expressão direcionada1 ou planejar o uso de anticorpos específicos de isoformas. Embora muito poucos destes últimos estejam no mercado (e muito poucos existam em todos os 2,3,4), um modelo animal transgênico pode estar disponível. No entanto, ele precisa ser adquirido pelo laboratório e devidamente alojado, com todos os gastos envolvidos no processo. Certos anticorpos ou produtos químicos, por exemplo, drogas conjugadas com fluoróforos, como faloidina ou paclitaxel, podem ser parcial ou totalmente incompatíveis com o uso em células ou tecidos vivos, limitando assim sua aplicabilidade apenas a estudos de amostras fixas.
No caso da tubulina, um aspecto adicional deve ser levado em consideração, que é a sensibilidade do polímero à fixação. A fixação química convencional com formaldeído é conhecida por não ser adequada para preservar de forma ideal a integridade dos microtúbulos5. Além disso, um relatório recente confirma que a reticulação de formaldeído induz mudanças sutis na ultraestrutura do microtúbulo, semelhante ao que acontece com a ligação de algumas drogas ou moléculas fisiológicas, como o GTP6.
A visualização direta de microtúbulos em amostras não coradas e não fixas é, portanto, muitas vezes desejável. Para conseguir isso, uma solução técnica é a microscopia de segunda geração harmônica (SHG)7, que se baseia na capacidade de feixes de microtúbulos paralelos de atuar como harmonóforos e emitir luz duplicada de frequência quando adequadamente iluminados com um laser infravermelho intenso e pulsado. Embora um segundo sinal harmônico mais forte e estável possa ser gerado a partir do colágeno e da miosina, que são os únicos outros dois materiais biológicos conhecidos por serem capazes de duplicação de frequência, o sinal da tubulina tem sido usado até o momento principalmente para estudar os rearranjos do fuso mitótico 8,9,10 e a morfologia dos microtúbulos axonais11,12,13.
Neste trabalho, apresentamos um novo uso da microscopia SHG como ferramenta diagnóstica para distinguir tecidos do sistema nervoso central (SNC) afetados pela tubulinopatia da tubulina beta 4 A (TUBB4A) de suas contrapartes saudáveis14. Algumas das mutações que ocorrem nessa isoforma predominantemente neural da tubulina, como as que causam hipomielinização e atrofia dos gânglios da base e do cerebelo (H-ABC), induzem o superenchimento de microtúbulos nos oligodendrócitos15,16; as alterações citoesqueléticas, por sua vez, estão associadas a efeitos a jusante, como a dismielinização, com profundo comprometimento das vias motora e sensorial16,17,18,19. O modelo murino de taiep utilizado neste trabalho apresenta conteúdo anormal de microtúbulos nos oligodendrócitos e recapitula a maioria dos sintomas sensório-motores de pacientes com H-ABC17. O protocolo explica como visualizar estruturas como o corpo caloso e o cerebelo, que geralmente são altamente mielinizadas e que são severamente afetadas em pacientes humanos, bem como no rato taiep 19, para destacar as diferenças nos sinais de HAS entre tecidos saudáveis e mutantes.

<table><tbody><tr><td>Filtro passa-banda de banda única BrightLine(R) de 405/10 nm&nbsp;</td><td>Semrock</td><td>FF01-405/10-25</td><td>32 mm de diâmetro, com anel de caixa</td></tr><tr><td>Nylon preto, tecido revestido de poliuretano</td><td>Thorlabs</td><td>BK5</td><td>5' x 9' (1,5 m x 2,7 m) x 0,005" (0,12 mm) de espessura&nbsp;</td></tr><tr><td>Lâminas para vibratomo</td><td>qualquer comercial; por exemplo, Espada Wilkinson</td><td></td><td>&nbsp; Lâminas de barbear clássicas de aço inoxidável de dupla borda</td></tr><tr><td>Placas de cultura de células, 35 mm</td><td>qualquer comercial; por exemplo, Falcão</td><td>351008</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio confocal</td><td>Zeiss</td><td>LSM710NLO AxioObserver Z1</td><td>Microscópio invertido, objetiva usada é LCI Plan-Neofluar 25x/0.8 NA&nbsp;</td></tr><tr><td>Resfriador</td><td>qualquer comercial</td><td></td><td>Qualquer caixa isolada de poliestireno pode funcionar, para manter a amostra em cerca de 37 & C</td></tr><tr><td>Milho stach</td><td>por exemplo, Maizena</td><td></td><td>Do supermercado</td></tr><tr><td>Lamínulas #1.5</td><td>qualquer comercial</td><td></td><td>Retangular</td></tr><tr><td>Cola de cianoacrilato</td><td>por exemplo, Loctite</td><td></td><td>Para colar o cérebro na fita adesiva</td></tr><tr><td>Pinça fina</td><td>Ferramentas de ciências finas</td><td>11412-11</td><td>Para manipular seções de tecido manuseando as meninges</td></tr><tr><td>Tesoura fina</td><td>Ferramentas de ciências finas</td><td>14370-22</td><td>Para cortar a pele&nbsp;</td></tr><tr><td>Tesoura fina ponta curva</td><td>Ferramentas de ciências finas</td><td>14061-09</td><td>Para cortar ao longo da linha média</td></tr><tr><td>Formaldeído 37%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>252549</td><td>Para diluir 1:10 em PBS</td></tr><tr><td>Friedman Rongeur</td><td>Ferramentas de ciências finas</td><td>16000-14</td><td>Para cortar o osso</td></tr><tr><td>Pacotes de gel</td><td>qualquer comercial</td><td></td><td>Pré-aquecido a 37 &graus; C, para ajudar a manter a temperatura dentro do refrigerador</td></tr><tr><td>Pipeta de vidro Pasteur, modificada</td><td>qualquer comercial</td><td></td><td>Para transferir a seção de tecido</td></tr><tr><td>Hanks&prime; Solução salina balanceada (HBSS)</td><td>Gibco</td><td>14025-076</td><td>Pode ser preparado a partir de pós</td></tr><tr><td>Hemostáticos de Kelly</td><td>Ferramentas de ciências finas</td><td>13018-14</td><td>Para separar o osso&nbsp;</td></tr><tr><td>Fita adesiva</td><td>qualquer comercial</td><td></td><td>Para proteger a superfície da placa de amostra</td></tr><tr><td>Módulo NDD, tipo C</td><td>Zeiss</td><td>000000-1410-101</td><td>Para detectar o sinal, reduzindo a perda de luz. Abrigando o conjunto de filtros 000000-1935-163 com o SP485</td></tr><tr><td>Tesouras de osso offset</td><td>Ferramentas de ciências finas</td><td>16101-10</td><td>Para cortar o osso</td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato (PBS)</td><td>Gibco</td><td>10010-031</td><td>Pode ser preparado a partir de pós ou abas</td></tr><tr><td>Laser pulsado</td><td>Coerente</td><td>Visão Camaleão II</td><td>680&ndash; Laser sintonizável de 1080 nm</td></tr><tr><td>Bisturi</td><td>qualquer comercial</td><td></td><td>Lâmina reta com ponta afiada</td></tr><tr><td>Pinça padrão padrão</td><td>Ferramentas de ciências finas</td><td>11000-18</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura de mola Vannas</td><td>Ferramentas de ciências finas</td><td>15018-10</td><td>Para cortar meninges que permanecem unidas tanto à fatia obtida do corte por vibratomo quanto à seção colada à placa da amostra.</td></tr><tr><td>Vibratomo</td><td>qualquer comercial; por exemplo, Leica</td><td>VT1200</td><td></td></tr></tbody></table>

Óptica não linear livre de rótulos para o estudo de defeitos dependentes de tubulina na mielina central

Label-Free Non-Linear Optics for the Study of Tubulin-Dependent Defects in Central Myelin

A visualização satisfatória dos componentes citoesqueléticos no cérebro é um desafio. A distribuição ubíqua das redes de microtúbulos, microfilamentos e filamentos intermediários em todos os tecidos neurais, juntamente com a variabilidade nos resultados das estratégias de fusão de proteínas fluorescentes e sua aplicabilidade limitada a estudos dinâmicos de anticorpos e drogas como veículos cromóforos, tornam as abordagens ópticas clássicas não tão eficazes quanto para outras proteínas. Quando a tubulina precisa ser estudada, a geração livre de rótulo de segundos harmônicos é uma opção muito adequada devido à organização não centrossimétrica da molécula. Esta técnica, quando conjugada à microscopia, pode descrever qualitativamente a distribuição volumétrica de feixes paralelos de microtúbulos em amostras biológicas, com a vantagem adicional de trabalhar com tecidos frescos não fixos e não permeabilizados. Este trabalho descreve como obter imagens de tubulina com uma configuração comercial de microscopia de segunda geração harmônica para destacar microtúbulos nas estruturas enriquecidas com tubulina dos oligodendrócitos, como na hipomielinização com atrofia dos gânglios da base e tubulinopatia do cerebelo (H-ABC), um distúrbio de mielina recentemente descrito.

As imagens obtidas com esta metodologia têm um baixo nível de fundo intrínseco devido ao número muito limitado de harmonóforos presentes nos tecidos biológicos, o que é uma das vantagens significativas do método.
Quando as fibras do corpo caloso são visualizadas, estruturas curtas semelhantes a fibras e elementos arredondados podem ser consistentemente encontrados no cérebro taiep (Figura 3B), enquanto o corpo caloso do cérebro controle mostra um sinal muito mais heterogêneo e isotróp...

Neste artigo, apresentamos um protocolo para detectar oligodendrócitos carregados de microtúbulos em um modelo de tubulinopatia através de uma abordagem microscópica simples e inovadora de segunda geração harmônica.

The satisfactory visualization of cytoskeletal components in the brain is challenging. The ubiquitous distribution of the networks of microtubules, ...

A imagem de segunda geração harmônica de amostras biológicas é uma técnica óptica que permite a visualização de moléculas não centrossimétricas e suas montagens sem a necessidade de uma etiqueta ou um corante. As imagens geradas com este método têm baixo fundo, uma vez que muito poucas moléculas biológicas poderiam atuar como uma força harmonal. Este protocolo descreve a aplicação da técnica de diagnóstico por imagem da tubulina beta-4A no modelo animal taiep.As tubulinopatias são doenças recentemente descritas. Por esta razão, uma quantidade limitada de informações está disponível sobre os mecanismos básicos subjacentes à fisiopatologia a nível celular. Para começar, ligue o laser de pulso para garantir que ele estará pronto para lascar em um nível de potência ideal e estável.Para estudar os microtúbulos tissulares, utiliza-se 10 a 20% da potência laser disponível, que no sistema descrito corresponde a 13 a 26 miliwatts medidos no plano focal posterior da objetiva. Antes da imagem, gire o laser para 810 nanômetros. Em seguida, certifique-se de que o microscópio esteja alinhado com Koehler com o objetivo usado para a Segunda Geração Harmônica, ou imagem SHG.Remova os filtros indesejados do caminho de detecção óptica e certifique-se de que o diafragma do condensador esteja totalmente aberto e que nenhuma luz seja parada desnecessariamente. Prepare uma objetiva de imersão em óleo de abertura numérica de 25x por 0,8 com uma pequena gota de óleo de imersão na lente. Seguindo os passos indicados na tabela aqui, com excepção da potência do laser que é inferior a 5% para o amido de milho.Imagem amido de milho seco ensanduichado entre lâminas de vidro. com parâmetros SHG para gerar imagens SHG, eles revelam a direção de polarização do laser. Capture uma imagem de grãos esparsos de amido de milho e marque a orientação dos lóbulos SHG no plano XY correspondente à orientação de polarização do laser.Para controle, pegue outra imagem da mesma amostra inserindo uma placa de meia onda no caminho óptico para alterar a direção de oscilação do laser. A imagem resultante exibe lóbulos de sinal SHG rotacionados. Se estiver usando um filtro passa-banda diferente para o SHG, certifique-se de que ele tenha propriedades de transmissão ideais comparando as imagens e as intensidades de sinal pixel a pixel ao longo da linha de varredura.Prepare uma bandeja tampão vibratome cheia com uma solução de sal balanceada de Hanks ou HBSS quente. Fixe o cérebro à placa da amostra usando cola de cianoacrilato através de um pedaço de fita adesiva. A porção mais caudal entra em contato com a cola para que as seções coronais utilizáveis da porção rostral oposta possam ser cortadas.Transfira a placa da amostra para o seu suporte magnético dentro da bandeja tampão. Comece a cortar seções de 300 a 500 mícrons até que as fatias abranjam toda a superfície do cérebro. Em seguida, reduza a espessura da seção para 160 mícrons.Uma vez que uma seção de 160 mícrons é cortada no nível do corpo caloso, recupere-a com uma pipeta Pasteur de vidro modificada com um grande orifício flangeado. Transfira a seção para uma placa de Petri limpa com novo HBSS quente ou diretamente para a folha de cobertura ou prato de fundo de vidro para microscopia. Coloque a amostra sob o microscópio e posicione-a adequadamente sob a objetiva por observação direta através dos óculos com luz transmitida.Remova o excesso de HBSS para que uma película líquida fina cubra toda a amostra. Verifique visualmente o filme líquido a cada poucos minutos para evitar a evaporação excessiva e a secagem da amostra. Prepare o estágio do microscópio para imagens não desenterradas, o que inclui fechar todas as portas da câmara de incubação escura ou cobrir a câmara de incubação com um tecido revestido de poliuretano de nylon preto.Selecione o modo de imagem não desmarcado ao longo do caminho de transmissão. Desta forma, a captura do sinal SH fraco da tubulina será otimizada. Em seguida, selecione o objetivo.Em seguida, defina uma potência do laser com um tempo de permanência de pixels de 12,6 microssegundos. Tire imagens não maiores que 512 por 512 pixels com velocidade cinco e média de dois para um tempo médio de aquisição de 15 segundos. Capture imagens primeiro usando um filtro passa-curta de 485 nanômetros e, em uma segunda etapa, adicione um filtro passa-banda nítido de 405 nanômetros.Corte o cerebelo com um bisturi em dois hemisférios e fixe-os ao suporte do vibratome pela porção média. Seção e imagem do cerebelo usando as mesmas configurações de vibratome, lâmina e microscópio descritas para o cérebro. Quando as fibras do corpo caloso são fotografadas, estruturas curtas semelhantes a fibras e elementos arredondados são observados no cérebro taiep.Em contraste, o corpo caloso do cérebro de controle mostra um sinal muito mais heterogêneo e isotrópico em toda a região do cérebro. A origem do sinal diferencial reside especificamente no fenômeno da Segunda Geração Harmônica, uma vez que a adição do filtro passa-banda estreito apenas diminui a intensidade do sinal não específico das imagens de controle, enquanto remove seletivamente esse sinal difuso baixo de todo o soma-like e as estruturas alongadas curtas nas imagens taiep que sempre geram luz intensa SH. No tecido controle da substância branca cerebelar, observou-se ausência completa de sinal de HAS.As células de Purkinje são pouco visíveis quando se usa o filtro passa-curto, e as estruturas alongadas e arredondadas persistem na imagem SH do tecido taiep. Um passo crítico para obter a melhor imagem é cortar as seções de tecido o mais finas possível. Além disso, trabalhar com cortes de tecido agudo requer protocolos rápidos para evitar a deterioração do tecido.Portanto, é crucial configurar e verificar o sistema óptico de antemão. O segundo sinal harmônico dos microtúbulos é mais fraco do que o segundo sinal harmônico do amido. Portanto, mais potência do laser deve ser usada para obter microtúbulos de imagem.A potência do laser deve ser aumentada com cuidado porque, como uma objetiva de alta abertura numérica é usada para imagens, a intensidade na amostra aumentaria rapidamente Com a imagem de Segunda Geração Harmônica, as alterações patológicas na mielinimática central do modelo tubulinopático são rápida e facilmente identificadas. Potenciais aplicações desta técnica incluem o seu uso para o estudo dos mecanismos básicos da tubulinopatia H-ABC e para a avaliação de terapias farmacológicas para tratar pacientes. A longo prazo, a técnica tem o potencial de se tornar uma ferramenta diagnóstica complementar a ser usada por via intracraniana ou em biópsias recentes.

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Neste vídeo, descrevemos a técnica de microscopia de reflexão de interferência (IRM) para visualizar microtúbulos crescendo em uma superfície de lamínula na presença de um tampão adequado. Após a iluminação com luz incidente, a interface capulínula-buffer e a interface tampão-microtúbulo refletem a luz, que se combina para criar um padrão de interferência, permitindo a visualização de microtúbulos como imagens de alto contraste contra um fundo brilhante.

Microscopia de reflexão de interferência para visualização sem rótulos da dinâmica dos microtúbulos

Fonte: Piazza, V., et al., Óptica não linear sem rótulo para o estudo de defeitos dependentes de tubulina na mielina central. J. Vis. Exp. (2023)Este vídeo demonstra o procedimento para obter imagens de anormalidades de microtúbulos em uma fatia de tecido cerebral de rato usando um microscópio de excitação de dois fótons. Ele emprega sinais de geração de segundo harmônico (SHG) para detectar defeitos de tubulina e reduzir a produção de mielina.

Imagem de segunda geração harmônica em um modelo de rato para estudar defeitos de tubulina

Apresentamos um protocolo utilizando microscopia de lapso de tempo de excitação de dois fótons para visualizar simultaneamente a dinâmica das lesões de axônio e mielina em tempo real. Este protocolo proposto permite estudos de fatores intrínsecos e extrínsecos que podem influenciar o destino do axônio mielinizado central após a lesão e contribuir para a incapacidade clínica permanente.

Um Ex Vivo Induzida por laser Lesão Medular modelo para avaliar mecanismos de axonal Degeneration em tempo real

Immunolabeling métodos para analisar populações distintas de microtúbulos no cérebro em desenvolvimento zebrafish são descritos aqui, que são amplamente aplicáveis a outros tecidos. O primeiro protocolo descreve um método otimizado para immunolabeling estável e dinâmica de microtúbulos. O segundo protocolo fornece um método para a imagem e quantificar microtúbulos nascentes especificamente.

Uso de Immunolabeling para analisar os microtúbulos estáveis, dinâmicos e emergentes no embrião Zebrafish

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In vivo Avaliação da Dinâmica e Orientação em Caenorhabditis elegans Neurônios

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