Uma abordagem in vitro para estudar disfunção mitocondrial: um modelo cibrid
9 de março de 2022
Cibridos transmissocondriais são células híbridas obtidas pela fusão de DNA mitocondrial (mtDNA) células esgotadas (células rho0 ) com citoplastas (células enucleadas) derivadas de pacientes afetados por distúrbios mitocondriais. Permitem a determinação da origem nuclear ou mitocondrial da doença, avaliação da atividade bioquímica e confirmação do papel patogênico das variantes relacionadas ao MTDNA.
A geração cibernética ainda é o protocolo de última geração para entender o papel patogênico de qualquer nova mutação de DNA mitocondrial e correlacionar a porcentagem de atriplasmia com a gravidade da doença. Esta técnica permite a realização de investigação bioquímica em um sistema nuclear homogêneo, no qual a contribuição do fundo nuclear do paciente está ausente. Esta técnica permite validar a patogenicidade de uma mutação do DNA mitocondrial.
e torna possível estudar seu impacto a nível bioquímico Lavar os pratos de 35 milímetros contendo os fibroblastos duas vezes usando dois mililitros de 1X PBS sem cálcio e magnésio. Limpe a superfície externa dos pratos com 70% de etanol, e espere até que o álcool evapore. Retire as tampas dos pratos e as tampas dos parafusos das garrafas.
Coloque cada prato sem a tampa de cabeça para baixo na parte inferior de cada garrafa centrífuga de 250 mililitros. Adicione lentamente 32 mililitros de um meio de nucleação a cada garrafa permitindo que o meio entre no prato e entre em contato com as células. Remova todas as bolhas dos pratos usando uma pipeta de pastagem de vidro longa, curvando a ponta em uma chama bunsen.
Feche cada garrafa com a tampa do parafuso e transfira-as para a centrífuga. Centrifugar por 20 minutos a 37 graus Celsius e 8.000 x G.Aspire o meio das garrafas e descarte-o. Retire os pratos invertendo as garrafas em uma gaze estéril previamente pulverizada com 70% de etanol.
Limpe a superfície externa dos pratos e suas tampas com 70% de etanol, e feche os pratos depois que o etanol evaporar. Antes de prosseguir, verifique se há formação de citoplastia usando um microscópio invertido para células vivas. Procure por fibroblastos extremamente alongados devido à extrusão de seus núcleos induzidos por citochalasina.
A cada prato de 35 milímetros adicione 1.000, 143 células de linha zero. Re suspendido em dois mililitros de cultura médio suplementado com 5%FBS. Deixe os pratos por três horas em uma incubadora de dióxido de carbono umidificado para resolver as 143 células da linha zero nos fantasmas.
Após três horas de incubação, aspire e descarte o meio. Lave as células de adesão duas vezes com dois mililitros de DMEM de alto meio de glicose sem soro ou MEM, depois aspire e descarte o meio. Adicione 500 microliters de solução de polietileno glicol às células e incubar por exatamente um minuto.
Aspire e descarte a solução de polietileno glicol. Lave as células três vezes com dois mililitros de DMEM de alta glicose sem soro ou com MEM. Adicione dois mililitros de meio de fusão, e incubar durante a noite na incubadora a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono.
Trypsinize as células nos pratos de cultura restantes Conte-as e semee-as em uma ou mais placas de Petri Adicione 50 a 100 células por prato na cultura suplementada até que os clones apareçam. Então deixe-os crescer por vários dias. Usando um microscópio estéreo, pegue os clones da placa de Petri com cilindros de clonagem ou uma ponta de pipeta.
Tente evitar a junção de diferentes clones e transfira-os para uma placa de 96 poços, cada um contendo 200 microliters de meio de cultura suplementar. Cibrids foram gerados a partir de fibroblastos derivados de um paciente portador do M2343A2G heteroplasmático Uma das mutações de DNA mitocondrial mais comuns associadas à miopatia mitocondrial, acidose lacótica encefalopatia e episódios semelhantes a derrame. A análise de um número variável de repetições tandem mostrou que o DNA cibernético é idêntico às células da linha zero confirmando a substituição do DNA cibernético do paciente pelo genoma de 143 B.
O polimorfismo de comprimento do fragmento de restrição, ou análises de sequenciamento, pode ser usado para avaliar a presença da mutação do DNA mitocondrial e a porcentagem de heteroplasma. Ao tentar este protocolo é importante verificar o ativo genético correto do DNA nucleon e mitocondrial, bem como a quantidade de DNA mitocondrial nos cibridos repovoados.
Veja a transcrição completa e aceda a milhares de vídeos científicos
Visão Geral
Os citoplasmas transmitocondriais são células híbridas criadas pela fusão de células com mtDNA esgotado com citoplasmas de pacientes com distúrbios mitocondriais. Esta abordagem ajuda a determinar a origem das doenças e a avaliar as atividades bioquímicas.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biologia Celular
- Genética Mitocondrial
Antecedentes
- Os citríbidos transmitocondriais são essenciais para o estudo de distúrbios mitocondriais.
- Eles permitem a análise das contribuições nuclear e mitocondrial para a doença.
- Essa técnica é fundamental para validar a patogenicidade de mutações no DNA mitocondrial.
- Compreender o impacto bioquímico das mutações é vital para o manejo da doença.
Objetivo do Estudo
- Investigar o papel patogênico de novas mutações no DNA mitocondrial.
- Correlacionar a porcentagem de heteroplasmia com a gravidade da doença.
- Realizar investigações bioquímicas em um ambiente nuclear controlado.
Métodos Utilizados
- Fusão de células rho 0 com citoplasmas enucleados.
- Ensaios bioquímicos para avaliar a função mitocondrial.
- Validação de mutações no DNAmt por meio de análise de citoplasmatos.
- Uso de PBS e etanol para preparação das células.
Resultados Principais
- Criação bem-sucedida de citríbidos transmitocondriais.
- Identificação de atividades bioquímicas associadas a mutações no DNA mitocondrial.
- Correlação estabelecida entre níveis de heteroplasmia e desfechos da doença.
- Confirmação do papel patogênico de variantes específicas do DNA mitocondrial.
Conclusões
- Os citoblastos transmitocondriais são eficazes para o estudo de doenças mitocondriais.
- Este método aprimora a compreensão das mutações no DNA mitocondrial e seus efeitos.
- Pesquisas futuras podem se basear nestes achados para desenvolver terapias direcionadas.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Os modelos citoplasmáticos transmitocondriais permitem a dissecção precisa das contribuições genéticas mitocondriais versus nucleares para a disfunção do OXPHOS, um ponto crítico na pesquisa de doenças mitocondriais. Essa abordagem fornece desvio de risco mecanicista e validação de alvos para mutações no DNA mitocondrial, apoiando a confiança preditiva em descobertas iniciais e pesquisas translacionais. A capacidade do sistema citoplasmático de isolar e caracterizar a patogenicidade sustenta decisões de portfólio ajustadas ao risco para programas de distúrbios mitocondriais.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Permite a investigação direta da patogenicidade de mutações no DNA mitocondrial em um contexto nuclear controlado.
- Apóia a validação funcional de alvos ao distinguir defeitos no OXPHOS induzidos por DNAmt de defeitos induzidos por DNAn.
- Facilita a desvinculação mecanicista de novas variantes mitocondriais antes de investimentos posteriores.
- Oferece uma plataforma para correlacionar níveis de heteroplasmia com fenótipos relevantes para doenças.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Estabelece linhagens citoplasmáticas validadas para ensaios bioquímicos e genéticos reprodutíveis.
- Permite a medição quantitativa da atividade OXPHOS e do impacto de mutações.
- Apoia a padronização de ensaios e a reprodutibilidade entre laboratórios na pesquisa mitocondrial.
- Prepara sistemas celulares robustos para triagem de compostos direcionados à disfunção mitocondrial.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Alinha modelos citoplasmáticos relevantes para doenças com o desenvolvimento translacional de biomarcadores.
- Proporciona continuidade do descobrimento genético à validação pré-clínica de alvos mitocondriais.
- Permite o avanço ajustado ao risco de intervenções candidatas com base em evidências mecanicistas.
- Apoia a redução preditiva de riscos para portfólios de doenças mitocondriais.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O modelo citoplasmático integra-se à continuidade entre descoberta e pré-clínico ao permitir testes de hipóteses, validação de alvos e esclarecimento mecanicista de distúrbios mitocondriais.
- Biologia da Descoberta: Apoia o teste de hipóteses nulas para a patogenicidade de mutações no DNA mitocondrial e esclarece os fatores genéticos responsáveis pela disfunção da OXPHOS.
- Triagem: Fornece linhagens de cibridas padronizadas e reprodutíveis para ensaios bioquímicos quantitativos.
- Análises: Fornece resultados quantitativos de heteroplasmia e atividade da OXPHOS para análise comparativa.
- Pesquisa Translacional: Conecta descobertas genéticas à validação em modelos pré-clínicos e alinhamento de biomarcadores.
- Reutilização Empresarial: Oferece uma plataforma reutilizável para a descoberta contínua de alvos mitocondriais e biomarcadores.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva e reduz a ambiguidade mecanicista na pesquisa de doenças mitocondriais.
- Valor Operacional: Padroniza a geração e caracterização de citríbridos para garantir reprodutibilidade e escalabilidade.
- Valor Estratégico: Permite decisões informadas de prosseguir/não prosseguir e uma gestão eficiente do portfólio em termos de capital.
- Impacto no Portfólio: Apoia a priorização ajustada ao risco e o avanço de programas para distúrbios mitocondriais.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em fusão celular, genética mitocondrial e desenvolvimento de ensaios bioquímicos.
- Exige acesso a infraestrutura especializada de cultura celular, centrifugação e análise molecular.
- Necessita padronização rigorosa entre equipes dos protocolos de geração e validação de citoplasmotíbridos.
- Pode exigir adaptação para diferentes tipos celulares ou fundos genéticos relevantes para doenças.
- A verificação dos componentes genéticos nucleares e mitocondriais é essencial para a fidelidade do modelo.
