Name: Ensaio mecânico de prevenção de conflitos para medir o comportamento da dor em camundongos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-18T14:15:00.000+00:00
Duration: 6 min 57 s
Description: Aprenda o ensaio mecânico de prevenção de conflitos para medir sensibilidade à dor em camundongos. Este método rápido avalia respostas motivacionais afetivas, melhorando a tradução da pesquisa pré-clínica em neurociência.

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A GM é apoiada por uma Bolsa de Pós-Graduação NDSEG. O VLT é apoiado pela concessão do NIH NIGMS #GM137906 e pela Fundação Rita Allen. A AJS é apoiada pelo Departamento de Defesa concede W81XWH-20-1-0277, W81XWH-21-1-0197 e a Fundação Rita Allen. Somos gratos ao Dr. Alexxai Kravitz da Faculdade de Medicina da Universidade de Washington por projetar e disponibilizar gratuitamente os arquivos de impressora 3D para a placa de piso e sonda da câmara 2.

Todos os experimentos envolvendo o uso de camundongos e os procedimentos nele realizados foram aprovados pelos Comitês Institucionais de Cuidado e Uso de Animais do MD Anderson Cancer Center e da Universidade de Stanford, em estrita conformidade com o Guia dos Institutos Nacionais de Saúde para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório.
1. Construção mca
<ol><li>Construa a câmara 1 com as seguintes dimensões: 125 mm x 125 mm x 125 mm (largura x profundidade x altura) a partir de acrílico branco opaco de 3 mm de espessura usado para as paredes laterais, piso, teto. Use um acrílico de 3 mm de espessura para a parede frontal. Cole todos os lados com bastante antecedência usando adesivo acrílico dedicado. ATENÇÃO: O adesivo acrílico é considerado material perigoso (inflamável, vapor prejudicial, pode ser prejudicial se engolido, pode irritar a pele ou os olhos). Esses adesivos só devem ser utilizados de acordo com as instruções do fabricante (ou seja, com EPI apropriado em uma área bem ventilada).</li>
	<li>Conecte a tampa da câmara 1 com uma dobradiça, para que os ratos possam ser facilmente colocados e recuperados da câmara. Conecte fita de diodo emissor de luz autoadesiva (LED) à superfície interna da tampa para fornecer iluminação de ~4800 lux.</li>
	<li>Feche a câmara 1 do resto da MCA deslizando uma folha de acrílico opaca para dentro e fora de posição.</li>
	<li>Construa a câmara de teste MCA, câmara 2, como uma câmara não iluminada de 270 mm de comprimento fabricada a partir de acrílico vermelho escuro translúcido (3 mm de espessura) em todos os lados, com uma tampa articulada em cima. Coloque uma grade de 13 x 31 de furos de 2 mm no chão da câmara 2 através da qual uma matriz de sondas sem cortes com pontas de 0,5 mm de diâmetro (por exemplo, pinos de mapa sem cortes) pode se projetar. NOTA: Pinos sem corte com um bloco de lixa de 120 grãos ou similares. Limpe-os em água morna com detergente antes de ser desinfetado com desinfetante esporicidal.</li>
	<li>Ajuste a altura das sondas colocando folhas de acrílico adicionais abaixo da placa base da sonda (Figura 1). Usando esta abordagem, configure o dispositivo com três configurações: 0 mm, 2 mm e 5 mm de altura da sonda.</li>
	<li>Como alternativa aos pinos de mapa sem cortes ou materiais similares, use os arquivos da impressora 3D para imprimir o piso da câmara 2 e a placa da sonda (ver Arquivo Suplementar 1: SpikeBed-MCA.stl que se refere às sondas mecânicas, e Arquivo Suplementar 2: MCA_baseplate.stl que forma o piso da câmara 2). NOTA: Se a impressão 3D não estiver disponível, cole os pinos do mapa em uma folha de acrílico usando o mesmo adesivo acrílico usado para construir as paredes do dispositivo.</li>
	<li>Imprima com um material lavável e biocompatível, como o plástico nylon 12 ou similar (recomendado).</li>
	<li>Construa a câmara 3 com as seguintes dimensões: 125 mm x 125 mm x 125 mm como uma caixa de acrílico vermelho translúcido não iluminada (em todos os lados), colocada na extremidade oposta à câmara 1. Coloque uma tampa dobradiça na câmara, semelhante às câmaras 1 e 2. Esta câmara serve como uma área de fuga escurecida das sondas mecânicas na câmara 2.</li>
</ol>2. Habituação e teste do Mouse MCA
<ol><li>Como acontece com todos os experimentos envolvendo desfechos comportamentais em animais, observe a randomização adequada e a cegueira para minimizar o viés potencial. NOTA: Os resultados representativos foram gerados utilizando camundongos C57BL/6J masculino e feminino de 8 a 12 semanas (número de cepas da Jackson Laboratories 000664). Os camundongos foram socialmente alojados, até 5 por gaiola, com acesso a alimentos e água ad libitum e um ciclo de luz das 07:00 h às 19:00 h. O MCA ocorreu no período de luz, entre 09:00 h e 12:00 h.</li>
	<li>Um dia antes do teste da linha de base ser agendado, aclimatar ratos à unidade MCA por 5 min (mínimo) a 15 min (máximo) com seus companheiros de gaiola para facilitar a exploração social de todo o dispositivo.</li>
	<li>Durante todo o processo, certifique-se de que os LEDs na câmara 1 sejam desligados, a barreira entre as câmaras 1 e 2 seja deixada aberta, e as sondas sejam definidas a uma altura de zero (ou seja, não se projetando pelo chão da câmara 2).</li>
	<li>Realize um teste de linha de base de camundongos (opcional) se o estudo incorporar animais de controle negativos (ou seja, cirurgia falsa ou controles de injeção de veículo). Se desejar, use um teste de linha de base para excluir quaisquer outliers não feridos que nunca cruzem para a câmara 2, embora isso não tenha se mostrado necessário. Se utilizado, informe todos os critérios de exclusão e o número de camundongos excluídos.<ol>
<li>Antes de começar a testar, configure uma câmera de vídeo capaz de gravar imagens de 1080p em um tripé com uma visão lateral de todo o dispositivo MCA. Ajuste o campo de visão de modo que o MCA preencha a imagem gravada.</li>
		<li>Uma vez que a gravação começa, segure uma placa de apagamento a seco portátil no campo de visão da câmera para rotular o início do vídeo com informações de identificação sobre a execução de testes do animal (por exemplo, ID do mouse, altura da sonda, data, ponto de hora, etc.).</li>
		<li>Para a primeira corrida, ajuste a altura da sonda como zero. Transfira o mouse para ser testado de sua gaiola para a câmara 1 com a porta da barreira no lugar. Inicie um temporizador visível nas imagens gravadas. NOTA: O temporizador garante que os intervalos entre as diferentes partes do teste sejam consistentes entre as corridas.</li>
		<li>Depois dos 10, ligue os LEDs da câmara 1. Depois que o rato estiver na câmara iluminada por 20 s, retire a barreira entre as câmaras 1 e 2.</li>
		<li>Observe o animal por 2 minutos. Meça latências e/ou tempos de moradia com um cronômetro enquanto o teste estiver em andamento. Alternativamente, as imagens de vídeo podem ser analisadas assim que os testes estiverm concluídos. NOTA: Por razões de rendimento e evitar exposição prolongada a estímulos aversivos, o corte foi fixado em 2 min.</li>
		<li>Meça um ou mais dos vários desfechos úteis que foram identificados (veja abaixo; Figura 1). Recomendado para analisar todas as 5 medidas de desfecho ao iniciar os testes, a fim de verificar quais aspectos de comportamento diferem em uma determinada configuração experimental.<ol>
<li>Opção I: Regissu o registro da latência para a primeira entrada na câmara 2. Opção II: Regissu o registro da latência para atravessar mais de metade da câmara 2. Opção III: Regisso tempo total de moradia na câmara 2. Opção IV: Registo da latência para chegar à câmara 3 (fuga). Opção V: Semelhante à opção II, registo o tempo total de moradia em cada câmara dentro de 2 minutos e converta-os em proporções. NOTA: Como cada experimento é único e pode ser influenciado por fatores biológicos e mudanças comportamentais exclusivas do modelo da doença, os pesquisadores podem experimentar essas e outras medidas em suas próprias mãos.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Uma vez que o teste esteja completo, devolva o mouse para sua gaiola doméstica, limpe as câmaras mca com 70% de etanol e deixe-o secar completamente. NOTA: O boli fecal geralmente pode ser limpo da câmara relativamente facilmente com toalhas de papel antes do etanol/desinfetante. Se for necessária uma limpeza mais completa, as câmaras 2 e 3 podem ser desmontadas e imersas em água morna e com sabão.</li>
		<li>Depois de executar todos os ratos em uma coorte com a altura da sonda definida a zero, insira uma folha de 3 mm de acrílico sob a placa de base da sonda mecânica e repita as etapas 2.4.2 a 2.4.7 com uma altura de sonda de 2 mm.</li>
		<li>Depois de rodar todos os ratos com a altura da sonda definida para 2 mm, insira uma segunda folha de 3 mm de acrílico sob a placa base da sonda e repita as etapas 2.4.2 a 2.4.7 com uma altura de sonda de 5 mm. NOTA: Um grupo de 8 camundongos pode ser testado em aproximadamente 2 h usando esta abordagem. Use tamanhos de grupo menores se for necessário um tempo pós-droga mais preciso (por exemplo, para um experimento de curso de tempo de drogas).</li>
		<li>Faça uma limpeza final com um desinfetante no final de uma sessão de teste.</li>
	</ol></li>
	<li>Repita os testes após induzir a hipersensibilidade da dor e/ou com tratamento medicamentoso.</li>
	<li>Compare o desempenho de cada rato na linha de base com seu desempenho após a dor ser induzida. Avaliar o impacto de uma intervenção farmacológica comparando animais tratados com animais tratados com drogas ao mesmo tempo.</li>
	<li>Realize análise estatística não paramétrica (por exemplo, o Teste U Mann Whitney) se os animais atingirem o corte de 2 min sem satisfazer a medida de desfecho desejada, resultando em dados não contínuos.</li>
</ol>

<ol><li>Hargreaves, K., Dubner, R., Brown, F., Flores, C., Joris, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+and+sensitive+method+for+measuring+thermal+nociception+in+cutaneous+hyperalgesia%5BTitle%5D)+AND+%22Pain%22%5BJournal%5D)">A new and sensitive method for measuring thermal nociception in cutaneous hyperalgesia.</a> Pain. 32 (1), 77-88 (1988).</li>
<li>Chaplan, S. R., Bach, F. W., Pogrel, J. W., Chung, J. M., Yaksh, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+assessment+of+tactile+allodynia+in+the+rat+paw%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Quantitative assessment of tactile allodynia in the rat paw.</a> Journal of Neuroscience Methods. 53 (1), 55-63 (1994).</li>
<li>Sheahan, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammation+and+nerve+injury+minimally+affect+mouse+voluntary+behaviors+proposed+as+indicators+of+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Pain%22%5BJournal%5D)">Inflammation and nerve injury minimally affect mouse voluntary behaviors proposed as indicators of pain.</a> Neurobiology of Pain. 2, 1-12 (2017).</li>
<li>Wodarski, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-centre+replication+of+suppressed+burrowing+behaviour+as+an+ethologically+relevant+pain+outcome+measure+in+the+rat%3A+a+prospective+multicentre+study%5BTitle%5D)+AND+%22Pain%22%5BJournal%5D)">Cross-centre replication of suppressed burrowing behaviour as an ethologically relevant pain outcome measure in the rat: a prospective multicentre study.</a> Pain. 157 (10), 2350-2365 (2016).</li>
<li>King, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unmasking+the+tonic-aversive+state+in+neuropathic+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Unmasking the tonic-aversive state in neuropathic pain.</a> Nature Neuroscience. 12 (11), 1364-1366 (2009).</li>
<li>Harte, S. E., Meyers, J. B., Donahue, R. R., Taylor, B. K., Morrow, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+Conflict+System%3A+A+Novel+Operant+Method+for+the+Assessment+of+Nociceptive+Behavior%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Mechanical Conflict System: A Novel Operant Method for the Assessment of Nociceptive Behavior.</a> PLoS One. 11 (2), 0150164(2016).</li>
<li>Pahng, A. R., Edwards, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+Pain+Avoidance-Like+Behavior+in+Drug-Dependent+Rats%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Measuring Pain Avoidance-Like Behavior in Drug-Dependent Rats.</a> Current Protocols in Neuroscience. 85 (1), 53(2018).</li>
<li>Odem, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sham+surgeries+for+central+and+peripheral+neural+injuries+persistently+enhance+pain-avoidance+behavior+as+revealed+by+an+operant+conflict+test%5BTitle%5D)+AND+%22Pain%22%5BJournal%5D)">Sham surgeries for central and peripheral neural injuries persistently enhance pain-avoidance behavior as revealed by an operant conflict test.</a> Pain. 160 (11), 2440-2455 (2019).</li>
<li>LaBuda, C. J., Fuchs, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+behavioral+test+paradigm+to+measure+the+aversive+quality+of+inflammatory+and+neuropathic+pain+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Neurology%22%5BJournal%5D)">A behavioral test paradigm to measure the aversive quality of inflammatory and neuropathic pain in rats.</a> Experimental Neurology. 163 (2), 490-494 (2000).</li>
<li>LaBuda, C. J., Fuchs, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphine+and+gabapentin+decrease+mechanical+hyperalgesia+and+escape%2Favoidance+behavior+in+a+rat+model+of+neuropathic+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Letters%22%5BJournal%5D)">Morphine and gabapentin decrease mechanical hyperalgesia and escape/avoidance behavior in a rat model of neuropathic pain.</a> Neuroscience Letters. 290 (2), 137-140 (2000).</li>
<li>Vichaya, E. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motivational+changes+that+develop+in+a+mouse+model+of+inflammation-induced+depression+are+independent+of+indoleamine+2%2C3+dioxygenase%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropsychopharmacology%22%5BJournal%5D)">Motivational changes that develop in a mouse model of inflammation-induced depression are independent of indoleamine 2,3 dioxygenase.</a> Neuropsychopharmacology. 44 (2), 364-371 (2019).</li>
<li>Hascoët, M., Bourin, M., Nic Dhonnchadha, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mouse+light-dark+paradigm%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Neuropsychopharmacology+%26+Biological+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">The mouse light-dark paradigm: a review.</a> Progress in Neuropsychopharmacology & Biological Psychiatry. 25 (1), 141-166 (2001).</li>
<li>Shepherd, A. J., Mohapatra, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacological+validation+of+voluntary+gait+and+mechanical+sensitivity+assays+associated+with+inflammatory+and+neuropathic+pain+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">Pharmacological validation of voluntary gait and mechanical sensitivity assays associated with inflammatory and neuropathic pain in mice.</a> Neuropharmacology. 130, 18-29 (2018).</li>
<li>Huck, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+Contribution+of+Myeloid-Lineage+TLR4+to+the+Transition+to+Chronic+Pain%3A+A+Focus+on+Sex+Differences%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Temporal Contribution of Myeloid-Lineage TLR4 to the Transition to Chronic Pain: A Focus on Sex Differences.</a> Journal of Neuroscience. 41 (19), 4349-4365 (2021).</li>
<li>Pitzer, C., La Porta, C., Treede, R. D., Tappe-Theodor, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammatory+and+neuropathic+pain+conditions+do+not+primarily+evoke+anxiety-like+behaviours+in+C57BL%2F6+mice%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Pain%22%5BJournal%5D)">Inflammatory and neuropathic pain conditions do not primarily evoke anxiety-like behaviours in C57BL/6 mice.</a> European Journal of Pain. 23 (2), 285-306 (2019).</li>
<li>Sieberg, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuropathic+pain+drives+anxiety+behavior+in+mice%2C+results+consistent+with+anxiety+levels+in+diabetic+neuropathy+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Pain+Reports%22%5BJournal%5D)">Neuropathic pain drives anxiety behavior in mice, results consistent with anxiety levels in diabetic neuropathy patients.</a> Pain Reports. 3 (3), 651(2018).</li>
<li>Meuwissen, K. P. V., van Beek, M., Joosten, E. A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Burst+and+Tonic+Spinal+Cord+Stimulation+in+the+Mechanical+Conflict-Avoidance+System%3A+Cognitive-Motivational+Aspects%5BTitle%5D)+AND+%22Neuromodulation%22%5BJournal%5D)">Burst and Tonic Spinal Cord Stimulation in the Mechanical Conflict-Avoidance System: Cognitive-Motivational Aspects.</a> Neuromodulation. 23 (5), 605-612 (2020).</li>
</ol>

Os autores não têm conflitos de interesse relevantes para divulgar.

Como em todos os testes comportamentais, o manuseio adequado, a randomização e a cegueira ao tratamento dos animais são essenciais em todos os momentos. Dadas as insumos multifatoriais em comportamentos complexos e tomada de decisões, é imperativo que os animais sejam manuseados, habituados e testados da forma mais consistente possível, minimizando a angústia. Deve-se também ter cuidado para reproduzir o tempo de colocação do mouse na câmara 1, ligar as luzes LED e remover a barreira, uma vez que as diferenças aqui podem...

A dor é uma experiência complexa com componentes sensoriais e afetivos. Uma redução no limiar da percepção da dor e da hipersensibilidade aos estímulos térmicos e/ou mecânicos são características fundamentais dessa experiência, que os testes de comportamento de dor evocados por estímulos podem capturar (como o teste de hargreaves de sensibilidade térmica e o teste von Frey de sensibilidade mecânica)1,2. Embora tais testes dêem resultados robustos e reprodutíveis, eles são limitados por sua dependência da retirada reflexiva de um estímulo nocivo percebido. Isso pôs em causa uma dependência contínua da pesquisa de dor apenas nestes testes. Para isso, os pesquisadores da dor vêm explorando há vários anos testes comportamentais alternativos/complementares para uso em modelos de dor de roedores, em um esforço para capturar mais dos componentes afetivos e/ou motivacionais da dor. Essas medidas não evocadas, voluntárias ou não reflexivas (por exemplo, corrida de rodas, atividade de escavação, preferência de localcondicionada 3,4,5) estão sendo implementadas na tentativa de melhorar a tradução da pesquisa de dor pré-clínica.
O ensaio de prevenção de conflitos mecânicos (MCA) foi originalmente descrito por Harte et al. em2016 6, é usado predominantemente em ratos 7,8, e representa uma modificação de uma abordagem anterior - o paradigma de fuga do local. Nesta abordagem, um estímulo nocivo da pata traseira é realizado em uma câmara de outra forma desejável (escura) para conduzir o comportamento proposital do animal para escapar/evitar tal estimulação 9,10. Em vez de depender de uma estimulação nociva manual da pata traseira por um observador, o ensaio da MCA força os ratos a negociar um estímulo potencialmente nocivo para escapar de um ambiente aversivo e alcançar a câmara escura. O conflito/evasão que dá nome ao ensaio surge dessas duas motivações concorrentes: escapar de áreas iluminadas e evitar estímulos nocivos das patas. O ensaio mca também compartilha características com testes de preferência de local condicionado, onde o emparelhamento do alívio da dor com pistas ambientais impulsiona mudanças de comportamento que refletem uma preferência pelo contexto de alívio/recompensa da dor11.
Fundamentalmente falando, todos esses ensaios compartilham uma abordagem semelhante: usando uma mudança na preferência de um animal por um ambiente aversivo sobre outro como um indicador de seu estado afetivo/motivacional. O ensaio mca é um paradigma de 3 câmaras que consiste em uma câmara iluminada brilhantemente seguido por uma câmara média escura com sondas de altura ajustáveis e uma terceira câmara escura sem qualquer estímulo aversivo. Um rato ileso é tipicamente motivado a escapar para uma câmara escura, dada a aversão inata de roedores à luz brilhante12. Neste exemplo, a motivação natural para escapar de um ambiente iluminado supera a desinclinação ao encontrar estimulação da pata traseira (as sondas de altura ajustáveis), que ocorre exclusivamente no ambiente escurecido. Em contraste, um rato que experimenta dor (devido à inflamação ou neuropatia, por exemplo) pode optar por passar mais tempo no ambiente iluminado, já que há motivação para evitar a desagradável experiência tátil das sondas mecânicas no cenário de hipersensibilidade tátil contínua.
Este artigo descreve uma versão modificada do ensaio mca. Adaptamos o método original (que foi realizado em ratos6) para uso em camundongos. Também reduzimos o número de alturas da sonda testadas de seis para três (0, 2 e 5 mm acima da altura do piso) para agilizar a aquisição de dados. Essa abordagem foi testada em vários modelos de dor e validada com analgésicos conhecidos, indicando que a hipersensibilidade da dor e/ou as alterações afetivas e motivacionais associadas estão conduzindo essas mudanças de comportamento. Essa abordagem é relativamente rápida de conduzir e adaptável quando comparada a outras medidas não reflexivas, que podem levar muitos dias de habituação e treinamento 1,2. Em conjunto com outras medidas de dor, a MCA pode gerar insights valiosos sobre os aspectos afetivos e motivacionais da dor.

<table><tbody><tr><td>Luzes de tira LED brancas sintonizáveis de 32,8 pés 3000K-6000K, luzes de fita LED super brilhantes reguláveis com 600 LEDs SMD 2835</td><td>Lepro</td><td>SKU: 410087-DWW-US</td><td>Para câmara de iluminação 1. https://www.lepro.com/32ft-dimmable-tunable-white-led-strip-lights.html</td></tr><tr><td>'cama de espigões' e 'câmara 2 andares' impressas em 3D</td> <td>Shapeways</td><td>N/A</td><td>Opcional, para sondas mecânicas como alternativa aos pinos de mapa embotados.</td></tr><tr><td>70% de etanol</td><td>Vários</td><td>N/A</td><td>Para limpar o MCA entre camundongos.</td></tr><tr><td>Acryl-Hinge 2</td><td>TAP Plastics</td><td>N/A</td><td>para fixar as tampas da câmara nas paredes traseiras. https://www.tapplastics.com/product/plastics/handles_hinges_latches/acryl_hinge_2/122</td></tr><tr><td>Folha de acrílico fundido Chemcast, Clear</td><td>TAP Plastics</td><td>N/A</td><td>com 3 mm de espessura. Para a parede frontal da câmara 1. https://www.tapplastics.com/product/plastics/cut_to_size_plastic/acrylic_sheets_cast_clear/510</td></tr><tr><td>Chemcast Acrílico Colorido Transparente, Vermelho Escuro Transparente - 50%</td><td>TAP Plásticos</td><td>N/A</td><td>3mm de espessura. 50% de transmissão de luz. Para paredes e tampas das câmaras 2 e 3. https://www.tapplastics.com/product/plastics/cut_to_size_plastic/acrylic_sheets_transparent_colors/519</td></tr><tr><td>Chemcast Translúcido & Acrílico Colorido Opaco, Branco Opaco - 0.1%</td><td>TAP Plásticos</td><td>N/A</td><td>3mm de espessura. Para paredes laterais e tampa da câmara 1. https://www.tapplastics.com/product/plastics/cut_to_size_plastic/acrylic_sheets_color/341</td></tr><tr><td>Desinfetante (por exemplo, Quatricida)</td><td>Pharmacal Research Laboratories, Inc.</td><td>65020F</td><td>Para desinfetar MCA no final de uma sessão de teste.</td></tr><tr><td>Marcadores e quadro de apagamento a seco</td><td>Vários</td><td>N/A</td><td>Para adicionar informações experimentais ao início das imagens de vídeo.</td></tr><tr><td>Vários</td><td></td><td>N/A</td><td>opcionais, para sondas mecânicas. Use uma lixa para embotar as pontas afiadas antes de usar. Pode ser usado no lugar de peças impressas em 3D.</td></tr><tr><td>Toalhas de papel</td><td>Vários</td><td>N/A</td><td>Para limpar/desinfetar MCA.</td></tr><tr><td>SCIGRIP Weld-On #3 Cimento Acrílico</td><td>TAP Plastics</td><td>N/A</td><td>Para montar chapas de acrílico em câmaras e fixar dobradiças. https://www.tapplastics.com/product/repair_products/plastic_adhesives/weld_on_3_cement/131</td></tr><tr><td>Cronômetro</td><td>Vários</td><td>N/A</td><td>Para registrar latências/tempos de permanência em tempo real ou a partir de vídeo gravado.</td></tr><tr><td>Temporizador</td><td>Vários</td><td>N/A</td><td>Para garantir que o LED acenda, a remoção da barreira e a conclusão do teste sejam cronometradas de forma consistente.</td></tr><tr><td>Câmara de vídeo</td><td>Várias</td><td>HDRCX405 Câmara de vídeo Handycam</td><td>Para gravar o comportamento do rato no dispositivo MCA. Pode ser substituído por qualquer câmera de vídeo de nível de consumidor com resolução de 1080p.</td></tr><tr><td></td><td>Tripé Famall</td><td>N/A</td><td>Qualquer tripé que possa segurar a câmera na altura da bancada para gravar imagens MCA é aceitável.</td></tr></tbody></table>

ensaio mecânico de prevenção de conflitos para medir o comportamento da dor em camundongos

Mechanical Conflict-Avoidance Assay to Measure Pain Behavior in Mice

A dor compreende tanto as dimensões sensorial (nociceptiva) quanto afetivas (desagradáveis). Em modelos pré-clínicos, a dor tem sido tradicionalmente avaliada por meio de testes reflexivos que permitem inferências em relação ao componente nociceptivo da dor, mas fornecem poucas informações sobre o componente afetivo ou motivacional da dor. Desenvolver testes que capturem esses componentes da dor são, portanto, traduções importantes. Assim, os pesquisadores precisam usar ensaios comportamentais não reflexivos para estudar a percepção da dor nesse nível. A prevenção de conflitos mecânicos (MCA) é um ensaio de comportamento voluntário não reflexivo estabelecido, por estudar respostas motivacionais a um estímulo mecânico nocivo em um paradigma de 3 câmaras. Uma mudança na preferência de localização de um rato, quando confrontada com estímulos nocivos concorrentes, é usada para inferir o descontentamento percebido da luz brilhante versus estimulação tátil das patas. Este protocolo descreve uma versão modificada do ensaio mca que os pesquisadores da dor podem usar para entender respostas afetivas-motivacionais em uma variedade de modelos de dor de rato. Embora não seja especificamente descrito aqui, nossos dados mca exemplo usar o intraplantar complete Freund's adjuvante (CFA), poupado lesão nervosa (SNI) e um modelo de fratura/fundição como modelos de dor para ilustrar o procedimento mca.

O ensaio MCA tem sido usado com sucesso com vários modelos de dor de rato mecanisticamente distintos. A Figura 2 mostra dados onde a medida de escolha foi o cruzamento do ponto médio da câmara 2 (Figura 2A). Os dados obtidos usando o meio-termo versus fuga na câmara 3 são muito semelhantes, ~40 s para a metade versus ~45 s para a fuga da câmara 3 no modelo de lesão nervosa poupada (SNI) de dor neuropática com altura da sonda de 5 mm13.</p...

O ensaio mecânico de prevenção de conflitos é usado como uma leitura não reflexiva da sensibilidade à dor em camundongos que podem ser usados para entender melhor as respostas afetivas-motivacionais em uma variedade de modelos de dor de rato.

Ensaio mecânico de prevenção de conflitos para medir o comportamento da dor em camundongos

Pain comprises of both sensory (nociceptive) and affective (unpleasant) dimensions. In preclinical models, pain has traditionally been assessed using ...

Este método pode ajudar a responder perguntas sobre o estado efetivo ou motivacional dos animais em diferentes condições de dor. É um passo importante para melhorar a tradução da pesquisa pré-clínica. A principal vantagem dessa técnica é que ela é relativamente rápida e fácil de executar, mas ainda avalia motivações complexas que influenciam o comportamento relacionado à dor.Comece construindo as paredes laterais, piso e teto da câmara um usando um acrílico branco opaco de três milímetros de espessura. Para a parede frontal, use um acrílico de três milímetros de espessura. Conecte a tampa da câmara um com uma dobradiça para que os ratos possam ser facilmente colocados e recuperados da câmara.Em seguida, conecte a luz autoadesiva emitindo fita diodo na superfície interna da tampa para fornecer iluminação de cerca de 4.800 lux. Deslize uma folha de acrílico opaca para dentro e fora de posição para fechar a câmara um do resto do dispositivo MCA. Em seguida, construa uma câmara sem luz de 270 milímetros de comprimento, a câmara de teste MCA, usando acrílico vermelho escuro translúcido em todos os lados com uma tampa articulada em cima.Em seguida, coloque uma grade 13 x 31 com dois milímetros de orifícios no chão da câmara através do qual uma matriz de sondas sem cortes com pontas de diâmetro de 0,5 milímetros pode se projetar. Ajuste a altura das sondas colocando folhas de acrílico adicionais sob a placa base da sonda. Usando esta abordagem, configure o dispositivo com alturas de zero, dois e cinco milímetros de sonda.Como alternativa a pinos de mapa sem cortes ou materiais similares, use os arquivos da impressora 3D para imprimir o piso da câmara dois e a placa da sonda com um material lavável e biocompatível, como o plástico nylon 12. Finalmente, construa uma câmara escura três usando acrílico vermelho escuro translúcido em todos os lados com uma tampa articulada semelhante às câmaras um e dois. Coloque-o na extremidade oposta da câmara um para servir como uma área de fuga escurecida das sondas mecânicas na segunda câmara.Um dia antes de agendar o teste da linha de base, aclimatar os ratos à unidade mca por 5 a 15 minutos com seus companheiros de gaiola para facilitar a exploração social de todo o dispositivo. Certifique-se de que os LEDs na câmara um estão desligados, a barreira entre as câmaras um e dois é mantida aberta e as sondas não estão salientes através do chão da câmara dois. Em seguida, configure uma câmera de vídeo capaz de gravar imagens de 1080 pixels em um tripé com uma visão lateral de todo o dispositivo MCA.Ajuste o campo de visão de modo que o MCA preencha a imagem gravada. Uma vez que a gravação começa, segure uma placa de apagamento seco portátil na visão de campo da câmera para rotular o início do vídeo com informações de identificação sobre a execução de testes do animal. Para a primeira corrida, ajuste a altura da sonda como zero e transfira o mouse para ser testado de sua gaiola doméstica para a câmara um com a porta da barreira no lugar.Inicie um temporizador visível nas imagens gravadas. Depois de 10 segundos, ligue os LEDs da câmara um. Depois que o rato estiver na câmara iluminada por 20 segundos, retire a barreira entre as câmaras um e dois.Observe o animal por dois minutos e meça latências ou tempos de moradia com um cronômetro enquanto o teste estiver em andamento. Regissuça a latência da primeira entrada na câmara dois, latência para atravessar mais da metade da câmara dois, o tempo total de moradia na câmara dois, a latência para chegar à câmara três, e o tempo total de moradia em cada câmara dentro de dois minutos e convertê-los em proporções. Uma vez que o teste esteja completo, devolva o mouse para sua gaiola doméstica.Limpe as câmaras mca com 70% de etanol e deixe secar completamente. Depois de executar todos os ratos na coorte com a altura da sonda definida como zero, insira uma folha de três milímetros de acrílico sob a placa base da sonda mecânica e repita a corrida com uma altura da sonda de dois milímetros. Depois de rodar todos os ratos com a altura da sonda definida para dois milímetros, insira outra folha de três milímetros de acrílico sob a placa base da sonda e repita a corrida com uma altura da sonda de cinco milímetros.Realize uma limpeza final com um desinfetante no final da sessão de testes. No modelo completo de dor inflamatória induzida por adjuvante de Freund, uma injeção salina não muda a latência de fuga em comparação com a linha de base. Camundongos injetados com o adjuvante mostraram um aumento significativo na latência de fuga quatro dias após a injeção, mas apenas quando a altura da sonda foi elevada para cinco milímetros.Esse aumento da latência não foi visto em camundongos que receberam carprofeno 90 minutos antes do início dos testes. O modelo de lesão nervosa poupada de dor neuropática aumentou significativamente a latência para escapar versus linha de base quando a altura da sonda foi definida para cinco milímetros. Esse aumento foi evitado pela administração da buprenorfina analgésico opioide 90 minutos antes do teste.O aumento da latência de fuga também foi observado em camundongos que não foram submetidos a uma rodada de base de testes de MCA antes da lesão nervosa. A latência de fuga aumentada em camundongos com lesões nervosas poupadas a cinco milímetros foi evitada por gabapentina administrada 90 minutos antes do teste. No modelo de fratura ou fundição, a latência para escapar da câmara um aumentou proporcionalmente à altura da sonda antes da lesão.Após a lesão, a latência permaneceu inalterada em zero milímetros, mas aumentou significativamente na altura da sonda de dois milímetros e cinco milímetros para os machos e a altura da sonda de cinco milímetros para as fêmeas quando comparada à linha de base. A coisa mais importante a ser lembrada ao tentar este procedimento é garantir que todos os ratos estejam habituados ao dispositivo MCA, e manter a randomização e a cegueira adequadas durante todo o estudo. Este método pode ser usado juntamente com outras medidas de sensibilidade à dor, incluindo von Frey ou preferência de lugar condicional.

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

As medições eletrônicas de von Frey são uma alternativa eficaz e aprimorada aos filamentos de von Frey clássicos, pois permitem a medição rápida e precisa das mudanças nos limiares de retirada mecânica de roedores para estímulos de pressão aplicados continuamente antes e depois de um evento inflamatório.

Medindo Mudanças na Tátil sensibilidade na pata traseira de ratos utilizando um aparelho eletrônico von Frey

Nós descrevemos um protocolo para examinar o desenvolvimento da hiperalgesia e tolerância em ratos induzida por opióides. Com base na medição das respostas nociceptivas térmicas e mecânicas de animais naive e tratados com morfina, que permite quantificar o aumento da sensibilidade à dor (hiperalgesia) e diminuir na analgesia (tolerância) associada à administração de opiáceos crónica.

Avaliação da hiperalgesia induzida por morfina e analgésicos Tolerância em ratos usando térmicas e mecânicas nociceptivos Modalidades

A osteoartrite (OA), ou doença degenerativa das articulações, é uma condição debilitante associada a dor que permanece apenas parcialmente controlada por analgésicos disponíveis. Os modelos animais estão sendo desenvolvidos para melhorar a nossa compreensão dos mecanismos da dor relacionada com a OA. Aqui nós descrevemos a metodologia para o modelo monoiodoacetate de dor OA no mouse.

O Modelo Monoiodoacetate da osteoartrite Dor no mouse

Neste artigo nós fornecemos detalhes para os métodos de produção e controle de qualidade de uma proteína de fusão recombinante IL4-10. Também mostramos como testar a eficácia desta proteína para resolver a dor em um modelo do rato da dor inflamatória.

Desenvolvimento de proteínas recombinantes para tratar a dor crônica

Normalmente, o modelo de injeção de pescoço do mouse é usado para avaliar comportamentos de risco induzida por pruritogen. No entanto, o modelo fornece informações apenas sobre coceira, não dor. Aqui, um modelo de injeção de bochecha é introduzido em camundongos que podem ser usados para medir simultaneamente a dor e comportamentos relacionados a coceira.

Modelo de injeção de bochecha para medição simultânea de dor e comportamentos relacionados a coceira

Desenvolvemos uma medida evocada da dor da artrite e, juntamente com um método padronizado para medir a dor espontânea em diferentes modelos de murino de artrite induzida quimicamente. Estas medidas são sensíveis e reprodutíveis para diferentes tipos de dor nas articulações.

Espontâneas e evocadas medidas de dor em modelos murino de dor no joelho monoarticulares

Para desenvolver novas intervenções terapêuticas para a prevenção e manejo da dor nas costas, modelos animais são necessários para examinar os mecanismos e a eficácia dessas terapias a partir de uma perspectiva translacional. O presente protocolo descreve o teste BMS, um método padronizado para avaliar a sensibilidade mecânica de retorno no rato.

Avaliação da Sensibilidade Mecânica das Costas no Rato para Investigação Mecanicista da Dor Lombar Crônica

Métodos para indução simples e rápida de um modelo de dor nas costas em camundongos são fornecidos aqui usando uma injeção intraligamentar de ativador de plasminogênio urinário.

Modelo de dor nas costas de camundongo induzido pelo ativador do plasminogênio do tipo uroquinase

Este protocolo descreve a avaliação da hipersensibilidade mecânica em um modelo de rato de dor orofacial neuropática usando um dispositivo de avaliação da dor orofacial baseado em operação.

Avaliação da hipersensibilidade mecânica induzida por lesão nervosa em ratos usando um ensaio de dor operante orofacial

Aqui, apresentamos um modelo de dor inflamatória modificado com a injeção de carragenina de ambas as patas traseiras para avaliar o efeito analgésico.

Um modelo de dor inflamatória modificado para estudar o efeito analgésico em camundongos

O protocolo descreve como medir a hiperalgesia do joelho em camundongos. Mostramos exemplos em modelos de camundongos de dor aguda no joelho, bem como em modelos de osteoartrite (OA).

Avaliação da hiperalgesia do joelho em camundongos usando medição de aplicação de pressão

Aprenda o ensaio mecânico de prevenção de conflitos para medir sensibilidade à dor em camundongos. Este método rápido avalia respostas motivacionais afetivas, melhorando a tradução da pesquisa pré-clínica em neurociência.

Ensaio mecânico de prevenção de conflitos para medir o comportamento da dor em camundongos

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