Entrega intraduto e visualização de raios-X da solução ablativa baseada em etanol para prevenção e tratamento local do câncer de mama em modelos de camundongos

O câncer de mama é o câncer mais prevalente e a segunda principal causa de morte relacionada ao câncer para mulheres nos EUA. As abordagens de prevenção atuais são limitadas e vêm com uma variedade de efeitos colaterais adversos. Novas intervenções para prevenção primária são necessárias. Desenvolvemos um método para a entrega intradutal de uma solução ablativa à base de etanol para a epitélio mamária do camundongo para prevenção do câncer de mama.

A injeção diretamente na abertura do mamilo permite direcionar células epiteliais que revestem a árvore ductal com danos mínimos no tecido colateral. Este método permite imagens simultâneas in vivo usando nanopartículas de óxido de tântalo como um agente de contraste de alta resolução. Este método pode ser adaptado para uso com outros agentes de contraste de raios-X e vários tratamentos preventivos com diferentes soluções químicas ou térmicas ablativas.

O primeiro passo envolvido com este método de prevenção do câncer de mama guiado pela imagem é induzir um tratamento anti-inflamatório prolongado através da dosagem oral de carprofeno utilizando copos de gel de sucralose preparados em laboratório. Preparamos o animal usando creme depilatório para remover a pele da área ao redor dos mamilos a serem injetados. Em seguida, as injeções intradutos são realizadas com a ajuda de um estereoscópio para melhor localizar e visualizar a abertura do mamilo para inserção da agulha.

Após a entrega da solução, os animais são imagens por micro-TC ou fluoroscopia para determinar o sucesso das injeções. Microc tomografias podem ser processadas para criar reconstruções 3D da árvore ductal mamária injetada para análise posterior do enchimento bem-sucedido e outras métricas. Primeiro, prepare o carprofeno na concentração necessária.

Fazemos uma solução de trabalho de dois mg por mL para injetar 0,5 mL e alcançar uma dose final de um mg por xícara. Você pode adicionar corante alimentar estéril à mistura para confirmar melhor a mistura completa da droga na sucralose do copo. Em seguida, coloque os copos em um banho de água a 60 graus Celsius por 15 minutos.

Retire os copos e seque-os para minimizar a possibilidade de contaminação. Use 70% de etanol ou lenços de etanol para limpar a superfície da tampa do copo e deixe secar. Use uma seringa para injetar a quantidade necessária de solução de carprofeno através da tampa.

Neste caso, precisamos injetar 500 microliters para o resultado desejado. Coloque um adesivo sobre o orifício da agulha e agite o copo por 15 segundos antes de vórtice por mais 15 segundos. Verifique se há uma mistura homogênea procurando por aglomerados de azul escuro.

Os copos podem então ser refrigerados por até um mês. A preparação do animal deve ocorrer de dois a três dias antes do procedimento intradutor. Comece anestesiando o animal usando isoflurano.

Transfira o rato anestesiado para um cone de nariz que continua a entregar isoflurane. Aplique lubrificante ocular no mouse enquanto estiver no cone do nariz e, em seguida, posicione o mouse sobre as costas. Use um aplicador de ponta de algodão para aplicar creme depilatório na área das glândulas mamárias que você planeja injetar.

Esfregue o aplicador para cima e para baixo na pele do animal na área desejada para ajudar com o afrouxamento mais rápido da pele. É importante deixar o creme no mouse pelo menor tempo possível para evitar queimar a pele. Após 10 a 30 segundos de aplicação, use água morna na gaze para remover completamente o creme.

Use duas a quatro enxágues para garantir a remoção completa antes de secar a pele com gaze limpa. Verifique as áreas de remoção de peles para confirmar boa visibilidade e acesso aos mamilos. Repita o procedimento depilatório, se necessário.

Coloque o mouse em uma gaiola de recuperação limpa em uma almofada de aquecimento para se recuperar da anestesia. Dê um copo de carprofeno para preparar ratos em sua gaiola após a recuperação. Você começará novamente anestesiando o animal usando anestesia isoflurane e moverá o rato para um cone de nariz uma vez que tenha sido totalmente induzido.

Lubrificante ocular será aplicado antes de colocar o animal em suas costas para injeções. Pode ser útil amarrar as pernas perto das glândulas mamárias que serão injetadas, mas não é necessário. Prepare a seringa com o volume desejado de solução de injeção mais um microliter no caso de alguns derramamentos após a remoção da agulha.

Pode ser útil encher com volume adicional para testar a agulha para o fluxo livre da solução imediatamente antes da injeção. Se injetar mais de uma glândula mamária, pode economizar tempo para pré-encher várias seringas, se disponível. Tome cuidado para não fazer isso muito cedo se a solução estiver propensa a entupir quando deixada para sentar.

Prepare o mamilo removendo qualquer pele morta visível usando fórceps finos, se possível. Não é necessário remover toda a pele morta se não estiver bloqueando a abertura do mamilo e for resistente ao puxão. Isso às vezes pode causar lesões e inchaço no mamilo se a pele morta for afixada para viver a pele muito fortemente.

Com o bisbilhotamento da agulha visível, insira a agulha na abertura do mamilo com orientação ajuda dos fórceps finos. Dependendo do comprimento e firmeza do mamilo, nem sempre pode ser possível segurar o mamilo enquanto guia na agulha. Às vezes é necessário manobrar o mamilo com a agulha para permitir que os fórceps puxem o mamilo para cima da agulha em vez de guiar a agulha para baixo no mamilo.

Uma vez que o chan de agulha esteja totalmente cercado pelo mamilo e no duto principal, comece a injetar lentamente a solução. A taxa desejada é de aproximadamente 40 microliters por minuto. Evite injetar mais rapidamente do que isso para evitar possíveis danos à árvore ductal.

Após a injeção completa, espere 30 segundos antes de remover a agulha do mamilo com a ajuda dos fórceps. Isso minimizará qualquer vazamento do mamilo. Avalie a área para qualquer sinal de uma injeção mal sucedida.

Uma aparência de domed pode indicar uma injeção de almofada de gordura ou trauma na área. Muitas vezes é possível ver que uma injeção na almofada de gordura está ocorrendo se a solução contém corante ou se você está procurando cuidadosamente para doming no local da injeção como pode ser visto aqui. Prossiga para injetar as glândulas mamárias restantes necessárias para o seu experimento de forma semelhante, observando volumes de injeção e quaisquer incidências de vazamento.

Algumas áreas do mouse podem ser mais difíceis de injetar devido a problemas como colocação de mãos desajeitadas ou interferência respiratória. Por exemplo, um injetor destro provavelmente terá mais dificuldade em injetar as glândulas no lado superior direito do mouse visto aqui. Estes se movem mais devido à proximidade com os pulmões e pode ser difícil encontrar uma boa colocação da mão com o corpo do animal no caminho de descansar o pulso na superfície.

Alguns podem achar mais fácil reposicionar o mouse se o cone do nariz permitir. Ao injetar uma solução contendo etanol, deve-se tomar cuidado para evitar a intoxicação sistêmica por álcool. Isso requer saber quanto etanol pode ser injetado em uma sessão e administrar ip de solução contendo sacarose durante o procedimento para neutralizar os efeitos.

Após o procedimento intradutor, os animais podem ser recuperados em uma gaiola limpa em uma almofada de aquecimento ou movidos para o sistema micro-CT para imagem de árvores ductais preenchidas. O mouse também deve ser recuperado após qualquer sessão de imagem. Depois de mover o animal injetado para o sistema micro-CT, continue administrando isoflurano para manter anestesia durante a imagem.

Pode ser útil padronizar a posição de imagem, gravando as pernas perto do local para serem imagens. Por exemplo, gravar as patas traseiras em uma posição estendida pode impedir que o osso das pernas impeça a visão das glândulas injetadas. Gravar as pernas dianteiras em uma posição estendida para cima pode ajudar da mesma forma na visualização das glândulas superiores.

Também descobrimos que a gravação através do abdômen do rato pode ajudar na redução do artefato respiratório para as glândulas inferiores. Existem muitos parâmetros de varredura aceitáveis para visualização da árvore ductal. Deve-se sempre tomar cuidado para garantir que a dose de radiação resultante desses exames não exceda os limites de radiação para uma determinada variedade de camundongos.

A dosagem por radiação pode ser muito reduzida visualizando fluoroscopia e observando o sucesso de entrega em vez de adquirir imagens com tempos de exposição mais longos. Nossos parâmetros de varredura padrão são aceitáveis para a repetição de imagens se apenas adquirir varreduras padrão curtas de dois minutos. Exames mais longos de maior resolução até 14 minutos são aceitáveis como procedimento terminal antes da eutanásia.

Esses exames mais longos não são aceitáveis para estudos longitudinais, pois podem causar doenças por radiação no animal. Este animal foi injetado com uma solução de etanol contendo 100 milimões de óxido de tântalo contraste nas glândulas quatro e nove. A aquisição atual é uma varredura de alta resolução de 14 minutos das glândulas inferiores injetadas.

A fluoroscopia do animal nos permite ver a arquitetura da árvore ductal sendo destacada pelo contraste dentro da solução de injeção. O sistema micro-CT que usamos possui um software embutido que permite a criação de representações rápidas para avaliar o sucesso da injeção sem análise formal. Este recurso tem um controle deslizante de contraste simples que permite uma redução razoável do sinal para o ruído.

A limitação dessas representações é que os mesmos limiares de sinal são aplicados a toda a imagem. Isso permite que sinais brilhantes que claramente não fazem parte da árvore ductal, como o ferro na dieta, permaneçam na rendição. Melhores representações formais podem ser feitas utilizando softwares de análise mais sofisticados que permitem a segmentação da área de interesse.

Para obter a melhor renderização da única árvore ductal, recomendamos segmentar a almofada de gordura mamária para posterior processamento de imagem. Este processo requer a linha traçando os limites da almofada de gordura ao longo da espessura completa do animal. Descobrimos que rastrear cada terceira fatia e propagar o objeto é suficiente para capturar a totalidade do duto.

Este pode ser um processo subjetivo, que requer a adesão aos padrões de laboratório para rastreamento para garantir saída semelhante de todos os indivíduos que analisam as varreduras. A familiaridade com a anatomia pode ajudar com chamadas de julgamento sobre quais áreas incluir. Após a propagação de traços, é então possível limiar a rendição dentro de uma determinada faixa para exibir apenas o contraste contido dentro da glândula mamária.

Esta deve ser a solução dentro da árvore ductal, bem como qualquer vazamento nas proximidades. Uma faixa de 300 a 3.000 HU tende a funcionar bem no caso de soluções que contêm óxido de tântalo. Um exemplo de uma rendição totalmente processada pode ser visto aqui em vários aspectos.

Dependendo de como o animal é orientado na micro-CT, pode ser necessário reorientar arquivos DICOM no software de análise para representar posicionamento anatômico intuitivo com a cabeça do animal na parte superior da imagem. Também pode ser difícil determinar qual glândula está sendo vista se você não tomar cuidado para girar a imagem de forma semelhante cada vez. Outras medidas, como volume ou comprimento, podem ser feitas depois de criar uma reconstrução da árvore ductal.

A validação para entrega bem-sucedida através deste procedimento pode ser demonstrada não apenas por representações de microctura 3D como descrito aqui, mas também através de montagens inteiras de dupla mancha com azul Evans injetado sobrepondo toda a árvore ductal destacada com alum carmine. A microscopia confocal 3D pode destacar a arquitetura da árvore ductal em uma glândula limpa manchada com e-cadherin. A tensão e a variabilidade do rato para o rato e anatomia do mamilo podem tornar mais ou menos difícil injetar glândulas.

Este é um exemplo de um mamilo ideal para injeção com um alto perfil para facilidade de agarrar. Mamilos com perfis mais baixos, como este, podem ser mais difíceis de se cannular com sucesso. Essas diferenças podem tornar mais provável alcançar uma injeção bem sucedida sem trauma ou doming como visto aqui ou mais provável que não seja bem sucedido, como mostrado pela aparência de mmed desta injeção de almofada de gordura.

Quando se trata de prevenção do câncer de mama, existem atualmente duas táticas principais sendo empregadas. A primeira, espera atenta, não envolve nenhuma intervenção verdadeira. Os indivíduos que buscam esse caminho são regularmente monitorados por quaisquer nódulos em seu tecido mamário que indiquem a formação do câncer.

A detecção de doenças, então, solicitaria o tratamento. A mastectomia profilática é um procedimento mais invasivo que remove todas as células epiteliais das quais o câncer de mama pode surgir junto com o estroma circundante. Esta cirurgia pode ter sérios efeitos colaterais adversos e raramente é selecionada como opção profilática para indivíduos com baixo ou moderado risco de doença.

Nossa abordagem envolve ablação epitelial local através da injeção de uma solução ablativa diretamente na árvore ductal mamária. Este método reduz os danos colaterais e provavelmente seria uma opção mais atraente para os indivíduos que não estão em risco grave de doença. A adição de contraste para imagem imediata pós-injeção também torna isso facilmente traduzível para a clínica.