Name: Em Ovo Injeção intravascular em embriões de frango (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min
Description: Aprenda a técnica de injeção intravascular in ovo em embriões de galinha para biologia do desenvolvimento. Este método permite a introdução de plasmídeos e células germinativas primordiais, facilitando estudos de transfecção gênica e criação de organismos transgênicos.

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Este trabalho foi apoiado pela Fundação Nacional de Ciência Natural da China (31972547). Agradecemos a cópia de Jing Wang e a narração de Malik Donlic na Universidade estadual de Washington, EUA.

Todos os procedimentos envolvendo o cuidado e o uso de animais conformes às diretrizes do Instituto Nacional de Saúde dos EUA (NIH Pub. nº 85-23, revisado em 1996) e os protocolos de embrião de frango foram aprovados pelo Comitê de Manejo Animal laboratorial e experimental animal da Universidade de Yangzhou, China (No.201803124).
1. Coleta e preparação de óvulos fertilizados
NOTA: Ao contrário dos mamíferos, a galinha tem milhões de folículos em um único ovário, mas apenas alguns desses folículos são maduros o suficiente para ovular. Cada folículo contém um oócito ou célula germinadícula. Assim que o folículo amadurece e libera sua gema, ele é incorporado ao funil do tubo falópio. À medida que o folículo entra no abdômen jugular do oviduto, o sêmen se liga ao ovo no corpo da galinha, e o cálcio no corpo da galinha forma uma concha que envolve o óvulo fertilizado, formando um ovo de casca macia no corpo. A casca de cálcio engrossa gradualmente até que o ovo seja produzido.
<ol><li>Coletar ovos fertilizados de um fornecedor local ou instituição, que pode ser armazenado a 16°C por 1 semana. NOTA: A alta temperatura de armazenamento ajudará o embrião a se desenvolver, enquanto a baixa temperatura diminuirá a viabilidade do embrião. Os embriões não se desenvolverão se o tempo de armazenamento for muito longo.</li>
	<li>Esfregue a casca de ovo suavemente e lentamente com 75% de etanol antes de transferir os ovos para a incubadora.</li>
	<li>Coloque os ovos de lado, bem em um rack em uma incubadora a 37,8 °C e 60% de umidade. Após 60 h de incubação (estágio 17 de HH), os embriões desenvolverão vasos sanguíneos visíveis e o coração começa a bater15. NOTA: Após 2 dias de incubação, pequenos pontos primordiais, o estágio inicial do coração, aparecem. Esse processo é chamado de cereja. Em ~2,5 dias, o coração e outros segmentos corporais são formados com vasos visíveis.</li>
</ol>2. Preparação antes da injeção
<ol><li>Prepare capilares de vidro que serão usados como agulhas. Antes da injeção, puxe capilares de vidro de 90 mm com diâmetro externo de 1 mm e diâmetro interno de 0,6 mm utilizando o puxador. Quebrar pontas usando fórceps (o ângulo do capilar de vidro geralmente é 45°) e esterilizar os capilares sob luz UV por 2 h.</li>
	<li>Prepare materiais exógenos, como plasmídeos, lentivírus embalados e PGCs.<ol>
<li>Misture suavemente o pEGFP-N1 plasmídeo (um plácido aprimorado expressando plasmídeo, 1μg/μL) com lipossomo a uma proporção de 1:3 (m/v). Adicione água para obter uma concentração final de DNA de 10 ng/μL. Deixe a mistura de DNA ficar a 37 °C por 20 minutos antes da injeção.</li>
		<li>Descongelar vírus no gelo antes da injeção. O título de lentivírus usado para injeção deve ser superior a 5 x 106 Tu/mL.</li>
		<li>Diluir os PGCs de gôndada parental ou modificados (E4.5, HH estágio 24) para 2.000-5.000 células/μL. NOTA: Aqui mostramos o procedimento de injeção usando azul trypan.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Janelas
<ol><li>Antes de expor os embriões, esterilize-os limpando suavemente e suavemente a superfície das cascas de ovos com 75% de álcool usando uma bola de algodão, garantindo esterilizar completamente a borda cega dos ovos.</li>
	<li>Após a esterilização, bata suavemente a extremidade sem cortes com fórceps para criar uma pequena janela (0,5 cm x 0,5 cm) na superfície da casca de ovo para expor o embrião. Remova a membrana do embrião e coloque o ovo no suporte sob o microscópio de dissecção.</li>
</ol>4. Injeção
<ol><li>Procure vasos sanguíneos sob o microscópio e ajuste o foco do microscópio de dissecção para localizar o embrião, e então encontre o vaso sanguíneo pronto para injeção.</li>
	<li>Encha a agulha de vidro com a solução exógena (plasmídeo, lentivírus ou PGCs) usando uma pipeta lentamente, evitando bolhas de ar na agulha.</li>
	<li>Mire a agulha com solução exógena no vaso sanguíneo, com a agulha paralela ao vaso sanguíneo sendo injetada.</li>
	<li>Insira suavemente a agulha preenchida no vaso e ligue a bomba para ejetar a solução (geralmente o volume injetado é ~1-5 μL) sob o microscópio. A pressão da bomba de ar deve ser baixa o suficiente para evitar a destruição dos vasos, pois a pressão excessivamente alta do ar danificaria os vasos sanguíneos que levam ao fluxo de alta velocidade.<ol>
<li>Uma vez que a solução exógena seja injetada no vaso, certifique-se de que a cor do vaso se transforme na cor da solução e se recupere para vermelho em 2-5 s, indicando que a solução exógena é entregue com sucesso à embarcação. Neste ponto a solução entra na artéria, e com a batida do coração é circulado de volta para o embrião através da artéria, e depois para a veia. NOTA: Existem dois locais de injeção para injeção vascular (Figura 1B): um é a cabeça, onde a solução exógena é injetada da veia na cabeça do embrião e no coração através do fluxo sanguíneo, em seguida, circula para todo o embrião com o batimento cardíaco (Figura 1B, Seta 1). Outra é através da aorta dorsal do sangue de embrião; a solução exógena é injetada e se espalha para todo o embrião (Figura 1B). Seta 2) com a batida do coração embrionário.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Após a injeção, remova o ovo do microscópio estéreo e solte 200 μL de solução de penicilina dentro da casca de ovo. Corte um pedaço de fita médica de 3 cm de comprimento e sele a janela. Raspe suavemente a fita com uma tesoura para espremer quaisquer bolhas de ar e, em seguida, corte outra peça para selar a abertura.</li>
	<li>Rotule e coloque o ovo injetado de volta na incubadora e incubar até o estágio de desenvolvimento ou eclosão necessário.</li>
</ol>

<ol><li>Bednarczyk, M., Dunislawska, A., Stadnicka, K., Grochowska, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chicken+embryo+as+a+model+in+epigenetic+research%5BTitle%5D)+AND+%22Poultry+Science%22%5BJournal%5D)">Chicken embryo as a model in epigenetic research.</a> Poultry Science. 100 (7), 101164(2021).</li>
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<li>Shi, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HMGCS1+promotes+male+differentiation+of+chicken+embryos+by+regulating+the+generate+of+cholesterol%5BTitle%5D)+AND+%22All+Life%22%5BJournal%5D)">HMGCS1 promotes male differentiation of chicken embryos by regulating the generate of cholesterol.</a> All Life. 14 (1), 577-587 (2021).</li>
<li>Jiang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spin1z+induces+the+male+pathway+in+the+chicken+by+down-regulating+Tcf4%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Spin1z induces the male pathway in the chicken by down-regulating Tcf4.</a> Gene. 780, 145521(2021).</li>
<li>Zhao, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+viable+chicken+by+allogeneic+transplantation+of+primordial+germ+cells+induced+from+somatic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Production of viable chicken by allogeneic transplantation of primordial germ cells induced from somatic cells.</a> Nature Communications. 12 (1), 2989(2021).</li>
</ol>

Nenhum conflito de interesses foi declarado.

O método de injeção intravascular de embriões de frango é otimizado para que materiais exógenos (vetor, viral ou PGCs) sejam transferidos para o embrião. Com base neste método, construímos modelos de embrião de frango com superexpressão ou interferência genética estável (SpinZ, JUN, UBE2I, etc.) 17,18,19. Esses modelos bem estabelecidos comprovam a viabilidade dessa abordagem. Além disso, não apenas transferimos PGCs i...

Os embriões de frango têm sido amplamente utilizados por séculos em aplicações biológicas, de desenvolvimento, imunológicos, patológicos e outrasaplicações biológicas 1,2,3. Eles têm muitas vantagens inerentes a outros modelos animais no estudo da toxicologia e biologia celular4. Os embriões de frango são facilmente acessíveis e podem ser manipulados in vitro e diretamente observados em qualquer estágio de desenvolvimento, o que fornece um sistema de modelo de pesquisa de embriões útil.
Em geral, os métodos atuais de entrega de embriões de frango, como eletrotransfesão e injeção subgerminal-cavidade, têm limitações como a exigência de equipamentos especializados e um programa projetado, e ineficiência devido à presença de gema e albumina 5,6,7. Aqui mostramos um método de manuseio simples e eficiente para entregar materiais exógenos em embriões de frango. Esta pode ser uma ferramenta poderosa usada no estudo da biologia do desenvolvimento. Os materiais injetados se espalharam para todo o embrião através da circulação sanguínea. Durante o desenvolvimento precoce de embriões de frango, os PGCs poderiam migrar através do sangue, colonizar a crista genital e, em seguida, desenvolver-se em gametas, que fornecem um caminho valioso possível para entregar materiais exógenos8. Agora, este método tem sido amplamente utilizado no estudo da função genética, embrião e biologia do desenvolvimento, e a produção quimrica e transgênica de frango 9,10,11.
Em ovo a injeção intravascular em embriões de frango é um método bem estabelecido e comumente utilizado 12,13,14. Neste artigo, mostramos uma descrição abrangente deste protocolo, incluindo materiais de injeção, locais, dosagem e resultados representativos.

<table><tbody><tr><td>Macro-microscópio de fluorescência</td><td>OLYMPUS</td><td>MVX10</td><td></td></tr><tr><td>Glass Capillaries</td><td>Narishige</td><td>G1</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Invitrogen</td><td>12566014</td><td>liposome</td></tr><tr><td>pEGFP-N1 vector</td><td>Clontech</td><td>#6085-1</td><td></td></tr><tr><td>PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>PKH26GL</td><td></td></tr><tr><td>vetor de lentivírus pLVX-EGFP</td><td>Addgene</td><td>128652</td><td></td></tr><tr><td>Microinjetor Pneumático</td><td>Narishige</td><td>IM-11-2</td><td></td></tr><tr><td>Extrator</td><td>Narishige</td><td>PC-100</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Azul</td><td>Mancha</td><td>Gibco 15250061</td><td></td></tr></tbody></table>

em ovo injeção intravascular em embriões de frango

In Ovo Intravascular Injection in Chicken Embryos

Como um sistema modelo clássico de biologia de embriões, o embrião de frango tem sido usado para investigar o desenvolvimento e diferenciação embrionária. A entrega de materiais exógenos em embriões de frango tem uma grande vantagem para estudar a função genética, a reprodução transgênica e a preparação da quimera durante o desenvolvimento embrionário. Aqui mostramos o método de injeção intravascular ovo em que materiais exógenos, como vetores plasmídeos ou células germinativas primordiais modificadas (PGCs) podem ser transferidos para embriões de frango doadores em estágios iniciais de desenvolvimento. Os resultados mostram que a injeção intravascular através da aorta dorsal e da cabeça permite que materiais injetados se difundam em todo o embrião através do sistema circulatório sanguíneo. No protocolo apresentado, a eficácia da introdução do vetor plasmídeo exógeno e lentiviral, e a colonização de PGCs exógenos injetados na gônada receptora, foram determinadas pela observação da fluorescência nos embriões. Este artigo descreve procedimentos detalhados deste método, fornecendo assim uma excelente abordagem para estudar a função genética, embrião e biologia do desenvolvimento, e a produção de frango gônd-quimérico. Em conclusão, este artigo permitirá que os pesquisadores realizem na injeção intravascular de ovo de materiais exógenos em embriões de frango com grande sucesso e reprodutibilidade.

Mostramos aqui a injeção intravascular in ovo de embriões de frango. Um processo esquemático da injeção intravascular é mostrado na Figura 1; em nosso estudo, usamos várias soluções exógenas para testar e verificar a injeção.
Para melhor visualizar os materiais injetados, o Trypan Blue (0,4%) foi injetado como um rastreador no embrião. O rastreador (azul) foi observado para difundir todo o embrião através da circulação sanguínea por aorta dorsal ...

O objetivo geral deste artigo é descrever como se apresentar na injeção intracelular ovo de materiais exógenos em embriões de frango. Essa abordagem é muito útil para estudar a biologia do desenvolvimento de embriões de frango.

Em Ovo Injeção intravascular em embriões de frango

As a classical model system of embryo biology, the chicken embryo has been used to investigate embryonic development and differentiation. Delivering ...

Olá, sou Kai Jin, da Universidade de Yangzhou. Em nome do nosso grupo de pesquisa, apresentarei uma poderosa ferramenta do embrião de frango em pesquisa de desenvolvimento. O embrião de frango é um modelo clássico de desenvolvimento que tem sido usado para investigar o desenvolvimento e a diferenciação, na verdade, as medidas ímãs do laboratório em embriões de frango é uma ferramenta valiosa para a biologia do desenvolvimento, como transfecção genética, reprodução transgênica e a preparação transmural gonadal.Em nosso laboratório, estabelecemos os métodos de injeção tipo mu, mas para muitos pesquisadores, o detalhe da injeção não é claro e difícil de alinhar. Então, neste vídeo, vamos mostrar os detalhes da injeção vascular durante o estágio inicial do desenvolvimento do embrião de frango no ovo. Sinta-se livre para entrar em contato conosco se você estiver interessado nele.Aqui, mostramos os detalhes do protocolo. Coleta e preparação de óvulos fertilizados. Primeiro, ao contrário dos mamíferos, a galinha tem milhões de folículos em um único ovário, mas apenas alguns desses folículos são maduros o suficiente para ovular.Cada folículo contém um oócito ou célula germinadícula. Assim que o folículo amadurece e libera sua gema, ele é incorporado ao funil do tubo falópio. À medida que o folículo entra no abdômen jugular do oviduto, o sêmen se liga ao ovo no corpo da galinha e o cálcio no corpo da galinha forma uma concha que envolve o óvulo fertilizado formando um ovo de casca macia no corpo.As cascas de cálcio gradualmente engrossam até que o ovo seja produzido. Colete o óvulo fertilizado, academicamente chamado ovos de embrião e coloque-os perfeitamente em um rack em uma incubadora a 37,8 graus Celsius e 60% de umidade. Os embriões são incubados em condições adequadas.Depois de dois dias incubações pequenos pontos vermelhos pulsantes chamados corações primordiais aparecem. Esse processo é chamado de espancamento de cereja. Em torno de 2,5 dias, os vasos sanguíneos são visíveis e os segmentos do coração e do corpo se formaram.Agulha e preparação plasmida. Usamos capilares de vidro como agulhas. Antes da injeção prepare os capilares de vidro com o diâmetro externo de um milímetro e o diâmetro interno de 0,6 milímetros.Os materiais exógenos geralmente são plasmídeos, lentivírus embalados e células germinativas primordiais, ou PGCs. Neste vídeo, usamos o azul trypan para mostrar o traço de materiais injetados. Janelas. Antes de expor os embriões, precisamos esterilizar os embriões para evitar a contaminação dos germes.Isso é feito limpando suavemente a superfície dos embriões com uma bola de algodão 75% álcool no local da abertura do ovo. Após a desinfecção, bata suavemente a extremidade cega da casca de ovo com fórceps e corte cuidadosamente um buraco de 0,5 centímetro por 0,5 centímetro na superfície da casca de ovo com as fórceps para expor o embrião. Injeção intravascular in-ovo.Olhe para a vista sob o microscópio, ajuste o foco do microscópio para primeiro localizar o embrião e, em seguida, encontrar os vasos sanguíneos do embrião de frango pronto para injeção. Aponte a agulha com a substância exógena no vaso sanguíneo, observando que a agulha é paralela ao vaso sanguíneo que está sendo injetado. Insira a agulha suavemente no vaso sanguíneo e, em seguida, ligue a bomba de ar.Neste ponto, a substância estranha entra na artéria e com a batida do coração, circula de volta para o embrião através da artéria, e depois para a veia. Existem dois tipos de injeções vasculares. A é uma injeção de cabeça onde a substância estranha é injetada de uma veia na cabeça do embrião e flui de volta para o coração.A outra é uma injeção aórtica dorsal onde a substância estranha circula para o embrião com a batida do coração. Com a batida do coração embrionário e a circulação de sangue podemos ver claramente que o material estranho é recebido pelos capilares no final da artéria, na veia e, em seguida, retornar ao embrião da veia, indicando que o material estranho injetado é efetivamente entregue a cada parte do embrião. Após a injeção, remova o ovo do estereoscópio, corte um pedaço de fita médica de três centímetros de comprimento com uma tesoura pequena e conecte a fita à abertura.Raspe suavemente a fita com a tesoura para espremer quaisquer bolhas de ar, e depois corte outro pedaço de fita para selar a abertura em uma cruz. Após a vedação da abertura, os embriões injetados são cuidadosamente colocados de volta na incubadora. Aqui mostramos as imagens representativas dos embriões de frango após a injeção.A primeira imagem mostra o resultado da injeção plasmida de lentivírus. A fluorescência verde sob um microscópio de fluorescência estereoscópica indica a expressão bem sucedida de plasmídeo injetado em embriões. Isso sugere a viabilidade da injeção intravascular de plasmídeos em embriões de frango.A segunda imagem mostra os resultados da injeção de PGC. Os PGCs foram rotulados com RFP. Nesta foto pudemos ver os PGCs injetados que são os pontos vermelhos aqui, localizados na gônada dos destinatários.Isso indica que os PGCs doadores foram capazes de entrar e colonizar na gônada dos receptores efetivamente. Em conclusão, este protocolo apresenta o processo de injeção intravascular in-ovo de materiais exógenos, plasmídeos ou PGCs em embriões de frango. O método mostrado aqui é fácil de acompanhar e aprender e vale a aplicação em muitos campos.Isso é tudo que eu gostaria de compartilhar com você. Espero que essa abordagem facilite seu trabalho como uma poderosa ferramenta de pesquisa na definição de embriões de frango e na biologia do desenvolvimento. Obrigado por assistir este vídeo e boa sorte com sua pesquisa.

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

Pinto no ovo eletroporação é uma técnica que permite a manipulação genética do embrião aviária. Aplicações mais comuns desta técnica incluem a análise funcional de genes e elementos enhancer putativa. Este vídeo demonstra eletroporação do tubo neural em HH 10 embriões de galinha. Técnica de injeção e manuseio adequado de ovo são discutidos.

Em Electroporations Ovo de Estágio HH 10 embriões de galinha

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Xenotransplante de células-tronco humanas no embrião de galinha

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Em Eletroporação Ovo na retina de pinto embrionário

Este vídeo demonstra o procedimento de injeção intravenosa de células cancerígenas na vasculatura da membrana corioalantóide de galinha para gerar um modelo de metástase de câncer CAM. As células injetadas eventualmente formam colônias dispersas de células cancerígenas, permitindo o estudo da invasão e metástase do câncer.

Injeção intravenosa de células cancerígenas na vasculatura da membrana corioalantóide de galinha: um procedimento para estabelecer o modelo de câncer de membrana corioalantóide para estudar a invasão e metástase do câncer

A expressão ectópica é uma técnica para elucidar o papel microRNAs no desenvolvimento do cérebro. No entanto, em áreas específicas usando a eletroporação in ovo é um desafio. Aqui, vamos mostrar uma maneira eficiente para regiões do mesencéfalo ventral e dorsal seletiva electroporate.

Em Expression in ovo de microRNA em Ventral Pintinho Midbrain

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Em Ovo Electroporation no Brainstem Auditivo da Galinha

Neste método, tecidos embrionários cardíacos são cirurgicamente microdissected, dissociado, fluorescente etiquetado e implantou em tecidos embrionários de anfitrião. Isto fornece uma plataforma para estudar a organização do desenvolvimento nível individual ou tecido sob condições hemodinâmicas gravidez ectópica, e/ou alterados parácrina/justácrina ambientes.

Sistema baseado em microinjeção para na implantação de Vivo do Cardiomyocytes embrionárias no embrião aviária

Este protocolo descreve três métodos sobre como obter e usar embriões de frango de 5 a 8 dias de idade e sua membrana corioalantóica (CAM) como um modelo in vivo para estudar imagens de ultrassom com contraste e entrega de drogas mediadas por microbolhas.

A preparação de embriões de frango ex ovo e vasos de membrana corioalantóica como modelo in vivo para imagens de ultrassom com contraste e estudos de liberação de drogas mediados por microbolhas

Embriões de frango, como modelo de desenvolvimento clássico, são usados em nosso laboratório para avaliar cardiotoxicções de desenvolvimento após a exposição a vários contaminantes ambientais. Métodos de exposição e métodos de avaliação morfológica/funcional estabelecidos estão descritos neste manuscrito.

Usando embrião de frango como ferramenta poderosa na avaliação de cardiotoxi cidades do desenvolvimento

Aprenda a técnica de injeção intravascular in ovo em embriões de galinha para biologia do desenvolvimento. Este método permite a introdução de plasmídeos e células germinativas primordiais, facilitando estudos de transfecção gênica e criação de organismos transgênicos.

Em Ovo Injeção intravascular em embriões de frango

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