Name: Analisando a Interação de Proteínas Fluorescentes com Microvesculas Fosfolipísicas Artificiais usando Citometria de Fluxo Quantitativo (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-06T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 26 s
Description: Aprenda a usar citometria de fluxo quantitativo para estudar interações proteína-lipídeo em microvesículas fosfolipídicas artificiais. Este método simples permite calcular constantes cinéticas e estimar sítios de ligação.

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Os autores foram apoiados por uma bolsa da Fundação Russa de Ciência 20-74-00133.

1. Rotulagem de proteínas fluorescentes
<ol><li>Preparação do material<ol>
<li>Prepare 1 M tampão de bicarbonato de sódio, pH 9.0, armazene-o a 4 °C e use-o dentro de uma semana.</li>
		<li>Prepare 1,5 M de tampão de cloridrato de hidroxilamina, pH 8,5, imediatamente antes de usar.</li>
		<li>Prepare uma solução de 10 mg/mL de corante fluorescente (ver a Tabela de Materiais) em dimetilsulfoxida. NOTA: Esta solução pode ser armazenada por um mês a -20 °C no escuro.</li>
		<li>Prepare soluções de anticorpos purificados ou outras proteínas a 1-10 mg/mL. NOTA: Evite tampões contendo íons de amônio ou aminas primárias. Substitua os tampões que contêm Tris ou glicerol por soro fisiológico tamponado por diálise. Nem o azida de sódio (≤3 mM) nem o thimerosal (≤1 mM) afetarão significativamente a reação de conjugação.</li>
		<li>Incubar o meio de filtragem de gel (ver a Tabela de Materiais) para purificação de proteínas em PBS durante a noite a temperatura ambiente ou por 2 h a 60 °C. Aplique o meio de filtragem de gel em colunas de giro com membranas de 0,2 μm.</li>
	</ol></li>
	<li>Calcule a quantidade de corante reativo a ser utilizado para cada reação de acordo com a concentração de proteína a ser rotulada usando Eq (1). <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63459/63459eq1v4.jpg"> Ondeo corante V é o volume da solução de estoque de corante; Cpr, Vpr e MWpr é a concentração, volume e peso molar da proteína; Mwcorante é o peso molar de corante; 100 é um fator de conversão unitária; Mr é a razão molar de corante para proteína na mistura de reação. NOTA: Recomenda-se o seguinte MRs para reações de rotulagem de IgG: MR = 40 se o anticorpo estiver em 1-3 mg/mL ou MR = 30 se o anticorpo estiver em 4-10 mg/mL. Para fatores de coagulação, mr = 5 é geralmente usado.</li>
	<li>Reação de conjugação<ol>
<li>Em um tubo de reação, misture a solução proteica com um volume 10x menor de 1 M de solução de bicarbonato.</li>
		<li>Adicione a quantidade necessária de corante fluorescente (ver passo 1.2) com agitação contínua.</li>
		<li>Incubar a mistura de reação à temperatura ambiente por aproximadamente 1h, protegido da luz e com agitação contínua.</li>
		<li>Para cada 200 μL de solução proteica, adicione 5 μL de 1,5 M de cloridrato de hidroxilamina.</li>
		<li>Incubar a mistura de reação à temperatura ambiente por aproximadamente 30 minutos, protegido da luz e com agitação contínua.</li>
	</ol></li>
	<li>Prepare a coluna de giro.<ol>
<li>Adicione 500 μL de meio de filtragem de gel para purificação de proteínas a uma coluna. Centrifugar a coluna por 3 min a 1.000 × g.</li>
		<li>Descarte o tampão do tubo de coleta. Se a coluna não estiver cheia, adicione mais meio de filtragem de gel e centrifugar a coluna por 3 minutos a 1.000 × g. Repita esta etapa até que a coluna esteja cheia.</li>
	</ol></li>
	<li>Purificação<ol>
<li>Centrifugar a mistura de reação (a partir do passo 1.3.5) por 5 min a 17.000 × g e remover o precipitado.</li>
		<li>Transfira o supernatante para a coluna de giro com meio de filtragem de gel. Deixe a solução absorver na cama de gel.</li>
		<li>Use um tubo de coleta vazio para a coluna de giro e centrífuga por 5 min a 1.000 × g. Após a centrifugação, colete a proteína rotulada do tubo de coleta.</li>
	</ol></li>
	<li>Determinação do grau de rotulagem<ol>
<li>Corrija para a contribuição do corante para a absorvância em A280 medindo a absorvência de corante livre a 280 nm (A280) e o λmax para o corante (Amax) (ver Eq (2)). <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/63459/63459eq02.jpg">(2)</li>
		<li>Meça a absorvância do conjugado de proteína-corante a 280 nm (A280) e o λmax para o corante (Amax) e calcule a concetração proteica usando Eq (3). <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/63459/63459eq3v2.jpg">(3) Onde εM é o coeficiente de extinção molar da proteína a 280 nm; d é o comprimento do caminho óptico durante a medição da absorvância; CF é a contribuição do corante para a absorvância em A280 (etapa 1.6.1).</li>
		<li>Calcule o grau de rotulagem (DOL) utilizando Eq (4). <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/63459/63459eq4v2.jpg">(4) Onde ε corante M é o coeficiente de extinção molar do corante a λmax nm; d é o comprimento do caminho óptico durante a medição da absorvância; Aproteína C é a concentração da proteína (passo 1.6.2).</li>
	</ol></li>
</ol>2. Preparação de vesículas fosfolipísides
<ol><li>Preparação e armazenamento da mistura lipídica<ol>
<li>Combine os lipídios na razão apropriada (fosfaticdylserine/fosphatidylcholina a uma proporção de 20 mol% a 80 mol%).</li>
		<li>Seque a mistura lipídica após a liofilização ou evaporação e armazene-a sob uma atmosfera inerte em ampolas de vidro.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Produção de filmes lipídes<ol>
<li>Abra a ampola e resuspenque a mistura lipídica em uma pequena quantidade (~100 μL) de clorofórmio. NOTA: Não use muito clorofórmio, pois não evapora completamente.</li>
		<li>Adicionar DiIC16(3) no etanol em 0,2 mol%. Transfira a mistura lipídica para um frasco fundo redondo. Espalhe a mistura finamente sobre os lados do frasco girando-a. Seque a mistura lipídica por 30 minutos sob um córrego de argônio.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Hidratação da mistura lipídica<ol>
<li>Adicione um tampão aquoso adequadamente quente (~55 °C) (HEPES 20 mM, NaCl 140 mM, pH 7.4) em um volume correspondente à concentração lipídica esperada ao frasco com o filme lipídeca. Incubar a mistura com vórtice a 55 °С por 30 min para hidratação completa.</li>
		<li>Colocar o tubo de amostra em um congelador ou termostato quente para fazer com que a suspensão lipídica passe por ciclos de congelamento de 3-5.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Formação de vesículas lipídicas por extrusão<ol>
<li>Prepare a extrusora de acordo com as instruções do fabricante. Aqueça todos os componentes extrusoras à temperatura de transição de fase da mistura lipídica.</li>
		<li>Encha uma das seringas extrusoras com a mistura lipídica hidratada. Aguarde de 5 a 10 minutos para que a temperatura da suspensão lipídica se equilibre com a temperatura da extrusora.</li>
		<li>Extrude a mistura lipídica através da membrana pelo menos 10 vezes. Para a extrusão final, coloque a suspensão lipídica na seringa alternativa e procure uma mudança na aparência de uma solução ligeiramente nebulosa para uma solução clara.</li>
		<li>Armazene a mistura resultante de vesículas lipídicas a 4 °C, de preferência em uma atmosfera inerte de argônio ou nitrogênio, por 3-4 dias. Não congele.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Isolamento de plaquetas de sangue inteiro
<ol><li>Coletar sangue inteiro de doadores saudáveis em tubos contendo 3,2% de citrato de sódio.</li>
	<li>Adicione prostaglandina E1 (PGE1) (1 μM) e apirágua (0,1 U/mL) ao sangue, seguida de centrifugação à temperatura ambiente a 100 × g por 8 min.</li>
	<li>Após a centrifugação, pegue o plasma rico em plaquetas e adicione a solução de citrato de sódio (106 mM, pH 5.5) a uma razão plasma/citrato de 3:1. Centrifugar o plasma à temperatura ambiente a 400 × g por 5 min.</li>
	<li>Remova o supernasciente e resuspenque a pelota em 300 μL do buffer de Tyrode sem BSA (HEPES de 20 mM, 150 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 1 mM MgCl2, 0,4 mM NaH2PO4, 2,5 mM CaCl2, 5 mM de glicose, pH 7.4). Purifique as plaquetas de proteínas plasmáticas por cromatografia de gel no meio de filtragem de gel para purificação de plaquetas (ver a Tabela de Materiais).</li>
</ol>4. Detecção de proteína - interação lipídica por citometria de fluxo
<ol><li>Experimentos de ligação cinética<ol>
<li>Vesículas fosfolipítidas diluídas (a partir do passo 2.4.4) no buffer de Tyrode (20 mM HEPES, 150 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 1 mM MgCl2, 0,4 mM NaH2PO4, 2,5 mM CaCl2, 5 mM de glicose, 0,5% BSA, pH 7,4) a uma concentração de 1 μM e volume total de 250 μL.</li>
		<li>Misture o fator de coagulação com rótulo fluorescente X (fX-fd) do passo 1 a uma concentração de 500 nM com as vesículas fosfolipídidas da etapa 4.1.1 em uma razão de 1:1 (concentração vesícula final 0,5 μM, a concentração fX-fd é de 250 nM de fX) para um volume total de 500 ΜL.</li>
		<li>Injete imediatamente os 500 μL da suspensão mista (~20 min para análise com baixa vazão) no citômetro de fluxo. Use uma baixa taxa de fluxo e certifique-se de que o limite para o canal FL2 (exсitation 488 nm, filtro de emissão 585/42 nm) é o valor 200. Meça a fluorescência média no canal FL4 (exсitação 633 nm, filtro de emissão 660/20) para o corante de fluorescência da Tabela de Materiais. NOTA: Escolha um cítômetro sem um autosampler. Isso acelerará o processo de injeção da amostra na célula de medição.</li>
		<li>Quando a saturação da ligação for alcançada (nenhum aumento significativo da fluorescência dentro de 5 min), dilui rapidamente a amostra 20 vezes com o tampão de Tyrode, e monitora a dissociação até que a fluorescência da linha de base seja atingida (dissociação completa) ou até que um platô seja atingido (nenhuma diminuição significativa da fluorescência dentro de 5 min). NOTA: Como controle, adicione 10 μM EDTA e monitore a dissociação completa por 5 minutos.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Experimentos de vinculação de equilíbrio NOTA: Utilize a curva cinética de ligação para determinar o tempo para alcançar a saturação; o tempo para saturação para fX-fd e vesículas artificiais é de 20 min.<ol>
<li>Incubar vesículas fosfolipícidas artificiais (5 μM) para o ensaio de ligação com diferentes concentrações de fX-fd (de 0 a 1.000 nM) no buffer de Tyrode por 20 minutos.</li>
		<li>Diluir cada amostra da etapa 4.2.1 por 20x para um volume final de 200 μL com o buffer de Tyrode. Analise imediatamente a amostra diluída por citometria de fluxo dentro dos 30 s. Use as configurações do passo 4.1.3. NOTA: Como controle para ligação inespecífica, use amostras semelhantes com EDTA (10 μM) e incuba-as por 5 minutos.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Análise dos dados de citometria de fluxo
<ol><li>Experimentos de exportação em formato FSC do software de aquisição de dados de citometria ao software de citógrafo para análise de dados (ver a Tabela de Materiais). Escolha | de arquivos | de exportação Arquivos FCS. Abra arquivos FSC em software de citômetro para análise de dados selecionando os arquivos no computador e arrastando-os para o espaço de trabalho do programa.</li>
	<li>Para a gating dos microvesículos, identifique a região dos microvesículos pela fluorescência do corante lipofílico DiIC16(3). Use comandos de menu ou botão plot na planilha para criar ssc de gráfico de ponto a partir de FL2 (corante DilC16(3)) nas coordenadas de log. Escolha o botão Portão Retangular para desenhar uma região de gating para que eventos de uma amostra sem vesículas não sejam incluídos nesta região (Figura 1B,C).</li>
	<li>Analise os experimentos cinéticos.<ol>
<li>Crie um gráfico de pontos usando as coordenadas da fluorescência (FL4) ao longo do tempo para a região das vesículas (clique duas vezes na região de vesículas na etapa 5.2)</li>
		<li>Exporte os dados sobre a alteração da fluorescência ao longo do tempo no formato csv. Escolha | de amostra | com o botão direito do clique | de exportação Escolha FL4 e Time in Parameters | Selecione diretório para salvar | Selecione | de formato CSV Exportar.</li>
		<li>Abra o arquivo CSV em qualquer software estatístico (consulte a Tabela de Materiais). Calcule uma simples média móvel de fluorescência e tempo para cada 1.000 eventos.</li>
		<li>Aproxime-se de um gráfico da dependência da fluorescência média móvel simples no tempo sob a suposição de dependência exponencial (Análise &gt; Montagem &gt;Nonlinear Curve Fit) e use-o para calcular a constante associação cinética usando Eq (5). <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/63459/63459eq05v2.jpg">(5) Onde [XB] é a concentração do fator vinculado em cada momento (unidades definidas pelo usuário) de acordo com a média móvel simples da etapa 5.3.3; [X] é a concentração de fator adicionado; [X]max é a concentração máxima do fator vinculado; k é a constante de associação; T é a hora.</li>
		<li>Repita o mesmo conjunto de ações (5.3.1-5.3.4) para calcular a constante de dissociação cinética usando Eq (6). <img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/63459/63459eq06v2.jpg">(6) Onde [XB] é a concentração do fator vinculado em cada momento do tempo; [X]0 é a concentração do fator vinculado no momento inicial do tempo; k é a constante de dissociação; T é a hora.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ensaio de ligação de equilíbrio<ol>
<li>Determine a fluorescência média de fX-fd na região das vesículas para cada concentração selecionada de fX-fd.</li>
		<li>Aproximar a dependência da fluorescência fator limite da concentração do fator adicionado na suposição de simples vinculação de um único local. Calcule os parâmetros de ligação média usando Eq (7) a partir de três repetições independentes no mínimo. <img alt="Equation 7" src="/files/ftp_upload/63459/63459eq07v2.jpg">(7) Onde [XB] é a concentração do fator vinculado; [X] é a concentração de fator adicionado; nx é o número aparente de sites de vinculação por vesícula; Kd é a aparente constante de dissociação.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. Conversão da intensidade da fluorescência para o número médio de locais de ligação
<ol><li>Prepare contas calibradas.<ol>
<li>Incubar plaquetas filtradas em gel (ver passo 3.3) com A23187 (10 μM) na presença de CaCl2 (2,5 mM) por 10 minutos à temperatura ambiente.</li>
		<li>Adicione às plaquetas ativadas as várias concentrações de fX-fd (0 a 1.000 nM). Adicione 2% v/v de formaldeído e incubar por 1h. Pare a reação incubando as plaquetas com 3 M de glicecina e 5% de BSA por 30 min a temperatura ambiente.</li>
		<li>Purificar a mistura do corante não redigido. Centrifugar as plaquetas por 5 min a 400 × g, remover o supernascimento e resuspensar a pelota no tampão de Tyrode (contendo 0,5% de BSA). NOTA: Repita o passo 6.1.3 três vezes.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Meça o nível de fluorescência das contas de calibração em cada amostra primeiro usando um espectrômetro (para corante fluorescente da Tabela de Materiais, excitação 633 nm, emissão de 670 nm) e, em seguida, usando o citómetro de fluxo (no canal FL4: excitação 633 nm, filtro de emissão 660/20). Usando um contador de células, determine o número de contas em cada amostra.</li>
	<li>Converta a intensidade de fluorescência de cada amostra de contas respectiva para a concentração de corante fluorescente solúvel usando um espectrofluorômetro. Recalcular a concentração de corante fluorescente para o número de moléculas de fluorforeiro usando Eq (8). <img alt="Equation 8" src="/files/ftp_upload/63459/63459eq08.jpg">(8) Onde Nx é o número de moléculas de fluoróforo; C é a concentração de corante fluorescente; NA é a constante de Avogadro; NA = 6,02214076×1023 mol -1.</li>
	<li>Crie um gráfico de dependência da fluorescência média das contas em um citômetro de fluxo (passo 6.2) sobre o número de moléculas fluorforas (ver passo 6.3) para cada amostra usando qualquer software estatístico (ver a Tabela de Materiais). Aproxima essa dependência por proporcionalidade de linha (Análise | Montagem | Ajuste linear). A partir da aproximação em Eq (9), calcule o fator de conversão da fluorescência média para locais de vinculação. <img alt="Equation 9" src="/files/ftp_upload/63459/63459eq09.jpg">(9) Onde MF é a fluorescência média das contas por citometria de fluxo; Nx é o número de moléculas de fluoróforo por conta; A CF representa o fator de conversão da fluorescência média para locais de vinculação. CF e b são obtidos a partir dos resultados da montagem do gráfico por proporcionalidade linear.</li>
	<li>Calcule o número aparente de sites vinculantes por vesícula de interesse usando Eq (10). <img alt="Equation 10" src="/files/ftp_upload/63459/63459eq10.jpg">(10) Onde nx é o número aparente de sites vinculativos por vesícula de interesse; MF é a fluorescência média das vesículas de interesse por citometria de fluxo; CF e b são fatores de conversão do Eq (8).</li>
</ol>

<ol><li>Hoffman, M., Monroe, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cell-based+model+of+hemostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Thrombosis+and+haemostasis%22%5BJournal%5D)">A cell-based model of hemostasis.</a> Thrombosis and haemostasis. 85 (6), 958-965 (2001).</li>
<li>Roberts, H. R., Hoffman, M., Monroe, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cell-based+model+of+thrombin+generation%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Thrombosis+and+Hemostasis%22%5BJournal%5D)">A cell-based model of thrombin generation.</a> Seminars in Thrombosis and Hemostasis. 32, Suppl 1 32-38 (2006).</li>
<li>Panteleev, M. A., Dashkevich, N. M., Ataullakhanov, F. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemostasis+and+thrombosis+beyond+biochemistry%3A+roles+of+geometry%2C+flow+and+diffusion%5BTitle%5D)+AND+%22Thrombosis+Research%22%5BJournal%5D)">Hemostasis and thrombosis beyond biochemistry: roles of geometry, flow and diffusion.</a> Thrombosis Research. 136 (4), 699-711 (2015).</li>
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</ol>

Os autores não têm conflitos de interesse para divulgar.

O método proposto pode ser adaptado para uma caracterização áspera da interação de proteínas com membranas fosfolipítidas de várias fontes e composições. A citometria quantitativa de fluxo descrita aqui concede ressonância plasmon superficial (SPR) em vários parâmetros. Em particular, tem menor sensibilidade e resolução de tempo e requer rotulagem fluorescente de proteínas. A rotulagem fluorescente pode levar a uma mudança na conformação e perda de atividade para muitas proteínas e, portanto, requer um controle cuidadoso...

Os biomembranos separam o conteúdo interno das células animais e do espaço extracelular. Note que as membranas também circundam microvesículos formados durante o ciclo de vida da célula e organelas. A membrana celular é predominantemente composta de lipídios e proteínas. As proteínas da membrana realizam funções de sinalização, estrutural, transporte e adesivo. No entanto, o bicamador lipída também é essencial para a inter-relação da célula animal com o espaço extracelular. Este artigo propõe um método para estudar a interação periférica de proteínas externas com a membrana lipídica.
O exemplo mais marcante de reações ocorrendo na camada de membrana externa de uma célula animal é a reação de coagulação sanguínea. Uma característica importante da coagulação sanguínea é que todas as principais reações procedem nas membranas fosfolipítidas das células e microvesculas decorrentes dessas células e não no plasma 1,2,3. Reações dependentes de membrana incluem o processo de inicialidade da coagulação (nas membranas celulares do subendotélio, endotélio inflamado ou células imunes ativadas, com a participação de um fator tecidual), todas as reações da principal cascata-ativação dos fatores IX, X, protrombina; ativação do fator XI por trombina (nas membranas de plaquetas ativadas, eritrócitos, lipoproteínas e microvesculas); reações da via da proteína C; inativação de enzimas de coagulação (nas membranas das células endoteliais com a participação de cofatores trombomodulinas, receptor de proteína endotelial C, sulfato heparano); e reações de via de contato (em membranas de plaquetas e algumas microvesculas com a participação de cofatores desconhecidos). Assim, é impossível investigar a coagulação sanguínea sem estudar a interação de várias proteínas plasmáticas com a membrana das células sanguíneas.
Este artigo descreve um método baseado em fluxo-citometria para caracterizar a interação de proteínas com membranas lipídicas de células ou microvesculas. Esta abordagem foi inicialmente proposta para estudar a interação do plasma de sangue com plaquetas e vesículas fosfolipítias artificiais. Além disso, a maioria das proteínas estudadas interagem diretamente com fosfolipídios de membrana carregados negativamente, particularmente com fosfatidylserina 4,5. Além disso, existem proteínas cuja interação com a membrana é mediada por receptores especiais6.
Uma importante habilidade de citometria de fluxo é discriminar entre ligantes livres e vinculados sem separação adicional. Esta característica da citometria permite o estudo da ligação de ligantes no ponto final e ajuda a realizar medições cinéticas contínuas. A técnica não é sofisticada e não requer preparação complexa da amostra. A citometria de fluxo é usada ativamente para estudar quantitativamente a dinâmica de interação entre peptídeos fluorescentes, receptores e proteínas G em neutrófilos intactos e permeáveisdetergentes 7. Essa abordagem também é aplicável para explorar interações proteína-DNA e a cinética da atividade endonuclease em tempo real8. Com o tempo, este método foi utilizado para estudar quantitativamente interações proteína-proteína de alta afinidade com vesículas lipídicaspurificadas 9, ou, mais geralmente, com proteínas de membrana expressas em um sistema de expressão celular Sf9 altamente eficiente10. Métodos quantitativos também foram descritos para caracterizar interações proteína-lipossomo utilizando citometria de fluxo para proteínas transmembranas11.
Esta técnica usa contas de calibração auto-feitas para evitar o uso de contas disponíveis comercialmente7. As contas de calibração utilizadas anteriormente7 destinavam-se a trabalhar com fluoresceína, o que restringiu substantivamente a variedade de ligantes fluorescentes acessíveis nas proteínas. Além disso, este artigo oferece uma nova maneira de adquirir e analisar dados cinéticos para resolução de tempo razoável. Embora este método seja descrito para vesículas fosfolipídicas artificiais, não há limitações óbvias para sua adaptabilidade às células, vesículas naturais ou vesículas fosfolipídicas artificiais com uma composição lipídica diferente. O método aqui descrito permite a estimativa dos parâmetros de interação (kon, koff) e equilíbrio (Kd) e facilita a caracterização quantitativa do número de sítios de ligação proteica na membrana. Observe que esta técnica fornece uma estimativa aproximada do número de locais de ligação. As vantagens do método são sua relativa simplicidade, acessibilidade e adaptabilidade às células nativas e microvesculas naturais e artificiais.

<table><tbody><tr><td>A23187</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C7522-10MG</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 NHS Éster (Éster Succinimidílico)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A37573</td><td>corante fluorescente</td></tr><tr><td>Apirase de batatas</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A2230</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSCantoII</td><td>BD Bioscience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>albumina de soro bovino</td><td>VWR Life Science AMRESCO</td><td>Am-O332-0.1</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de cálcio, anidro, pó, &ge; 97%</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>C4901-100G</td><td></td></tr><tr><td>Cary Eclipse Espectrômetro de Fluorescência</td><td>Agilent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>D- (+) -Glicose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G7528-1KG</td><td></td></tr><tr><td>DiIC16 (3) (1,1'-Dihexadecil-3,3,3',3',3'-Perclorato de Tetrametilindocarbocianina)</td> <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D384</td><td></td></tr><tr><td></td><td>DMSO Sigma Aldrich</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>Sal dissódico EDTA</td><td>VWR Ciências da Vida AMRESCO</td><td>Am-O105B-0.1</td><td></td></tr><tr><td>FACSDiva</td> BD Software <td>de aquisição de dados de citometria</td>BD <td>Bioscience</td><td></td></tr><tr><td>Software de citómetro FlowJo</td><td></td><td>Tree Star</td><td></td> para análise de dados</tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H4034-500G</td><td></td></tr><tr><td>Human Factor X</td><td>Enzyme research</td><td>HFX 1010</td><td></td></tr><tr><td>Cloridrato de hidroxilamina</td><td>Panreac</td><td>141914.1209</td><td></td></tr><tr><td>L-&alfa;-fosfatidilcolina (Cérebro, Suíno)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>840053P</td><td></td></tr><tr><td>L-&alfa;-fosfatidilserina (Cérebro, Suíno) (sal de sódio)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>840032P</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de magnésio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M8266-100G</td><td></td></tr><tr><td>Mini-Extrusora</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>610020-1EA</td><td></td></tr><tr><td>OriginPro 8 SR4 v8.0951</td><td>OriginLab Corporation</td><td></td><td>Software estatístico</td></tr><tr><td>Comprimidos de solução salina tamponada com fosfato (PBS), grau de biotecnologia</td><td>VWR Life Science AMRESCO</td><td>97062-732</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de potássio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9541-500G</td><td></td></tr><tr><td>Prostaglandina E1</td><td>Cayman Chemical</td><td>13010</td><td></td></tr><tr><td>Sephadex G25</td><td>GE Healthcare</td><td>GE17-0033-01</td><td>meio de filtração em gel para purificação de proteínas</td></tr><tr><td>Sepharose CL-2B</td><td>Sigma Aldrich</td><td>CL2B300-500ML</td><td>meio de filtração em gel para purificação de plaquetas</td></tr><tr><td>Bicarbonato de sódio</td><td>Corning</td><td>61-065-RO</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de sódio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S3014-500G</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de sódio monobásico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S3139-250G</td><td></td></tr><tr><td>Colunas de rotação com membrana 0.2 &micro; m</td><td>Sartorius</td><td>VS0171</td><td></td></tr><tr><td>Citrato trissódico di-hidratado</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S1804-1KG</td><td></td></tr></tbody></table>

analisando a interação de proteínas fluorescentes com microvesculas fosfolipísicas artificiais usando citometria de fluxo quantitativo

Analyzing the Interaction of Fluorescent-Labeled Proteins with Artificial Phospholipid Microvesicles using Quantitative Flow Cytometry

No corpo humano, a maioria das principais reações fisiológicas envolvidas na resposta imune e coagulação sanguínea prosseguem nas membranas das células. Um primeiro passo importante em qualquer reação dependente da membrana é a ligação de proteína na membrana fosfolipítida. Uma abordagem para estudar a interação proteica com membranas lipídicas foi desenvolvida usando proteínas fluorescentes rotuladas e citometria de fluxo. Este método permite o estudo de interações proteína-membrana utilizando células vivas e vesículas fosfolipítias naturais ou artificiais. A vantagem deste método é a simplicidade e disponibilidade de reagentes e equipamentos. Neste método, as proteínas são rotuladas usando corantes fluorescentes. No entanto, tanto proteínas auto-fabricadas quanto comercialmente disponíveis, podem ser usadas proteínas fluorescentes. Após a conjugação com um corante fluorescente, as proteínas são incubadas com uma fonte da membrana fosfolipítida (microvesculas ou células), e as amostras são analisadas por citometria de fluxo. Os dados obtidos podem ser usados para calcular as constantes cinéticas e o equilíbrio Kd. Além disso, é possível estimar o número aproximado de locais de ligação de proteínas na membrana fosfolipídida usando contas especiais de calibração.

O método de citometria de fluxo descrito aqui é usado para caracterizar a ligação de proteínas de coagulação plasmática a plaquetas ativadas. Além disso, as vesículas fosfolipídidas PS:PC 20:80 foram aplicadas como um sistema de modelo. Este artigo se concentra principalmente em vesículas fosfolipísides artificiais como exemplo. Os parâmetros do citómetro, em particular, a tensão do tubo fotomultiplier (PMT) e a compensação devem ser selecionados para cada dispositivo específico, o objeto de estudo (células, microvescula...

Aqui, descrevemos um conjunto de métodos para caracterizar a interação de proteínas com membranas de células ou microvesculas.

Analisando a Interação de Proteínas Fluorescentes com Microvesculas Fosfolipísicas Artificiais usando Citometria de Fluxo Quantitativo

In the human body, most of the major physiologic reactions involved in the immune response and blood coagulation proceed on the membranes of cells. An ...

Usando esse método de citometria de fluxo de quantidade, os pesquisadores podem calcular os costumes cinéticos e de equilíbrio da interação com a membrana e estimar o número de proteínas trazidas por locais na membrana PPH. As vantagens deste método são a simplicidade e disponibilidade de reagentes e equipamentos. Este método é exclusivamente para pesquisas básicas.O protocolo foi desenvolvido para estudar interações lipídicas proteicas no cálculo sanguíneo, podendo ser utilizado em outras áreas para caracterizar a interação de proteínas com várias membranas lipídicas. O método pode ser usado para a avaliação da quantidade de dinâmicas de ligação de ligantes nos vários tipos de células e ligantes. Inicie os experimentos de ligação cinética diluindo vesículas fosfolipídicas no buffer de Tyrode para uma concentração de um micromolar e um volume total de 250 microlitres.Em seguida, misture o fator de coagulação fluorescente X ou FX FD e uma concentração de 500 nanomolar com as vesículas fosfolipídidas em uma razão de um para um para obter um volume total de 500 microlitres. Injete imediatamente 500 microliters da suspensão mista no citômetro de fluxo. A uma taxa de fluxo com um comprimento de onda de excitação de 488 nanômetros e um filtro de emissão de 585 nanômetros; com uma largura de 42 para o canal FL dois.Em seguida, meça a fluorescência média no canal FL quatro com excitação a 633 nanômetros e filtro de emissão a 660 nanômetros com uma largura de 20. Quando a saturação da ligação é alcançada rapidamente dilui a amostra 20 vezes com o tampão de Tyrode, e monitora a dissociação até que uma fluorescência de linha de base, ou um platô, seja atingida. Para experimentos de ligação de equilíbrio incubam cinco vesículas fosfolipícidas artificiais micromolar com concentrações variadas de FX FD de zero a 1000 nanomolar no buffer de Tyrode por 20 minutos.Após a incubação diluir cada amostra em 20 vezes para um volume final de 200 microliters com tampão de Tyrode, então analise a amostra diluída por citometria de fluxo dentro de 30 segundos. Para analisar os dados, exporte os experimentos em formato FSC do software de aquisição de dados de citometria para software de citógrafo para análise de dados. Escolhendo o arquivo e, em seguida, clicando nas guias de arquivos de exportação e FSC.uma vez feito abrir os arquivos FCS em software de citrômetro selecionando os arquivos no computador e arrastando os arquivos para o espaço de trabalho do programa. Para gating dos microvesículos, identifique a região dos microvesículos por fluorescência do corante lipofílico, DIC 16 três. Em seguida, use o botão plot na planilha para criar um SSC de gráfico de pontos a partir de FL dois D I C 16 em coordenadas de log.Em seguida, escolha o botão de portão retangular para desenhar uma região de gating. Para analisar os experimentos cinéticos, crie um gráfico de pontos usando as coordenadas da fluorescência ao longo do tempo para a região das vesículas. Em seguida, exporte os dados sobre a alteração da fluorescência ao longo do tempo no formato CSV;escolhendo a amostra e clicando com o botão direito do mouse na guia de exportação, seguido de escolher FL quatro vezes em parâmetros, selecionar diretório para salvar antes de clicar no formato CSV selecionado e acertar a guia de exportação.Após a transferência, abra o arquivo CSV em software estatístico para calcular a simples fluorescência e tempo da média móvel para cada 1000 eventos aproximam um gráfico da dependência da fluorescência média móvel única no tempo sob a suposição de dependência exponencial e usar o valor para calcular a associação cinética constante usando uma equação. Em seguida, calcule a constante de dissociação cinética usando a equação como descrito anteriormente. Para analisar a data do ensaio de vinculação de equilíbrio, determine a fluorescência média do FX FD na região das vesículas para cada concentração selecionada de FX FD e, em seguida, aproxime-se da dependência da fluorescência fator vinculado da concentração do fator adicionado na suposição de vinculação de local único.Calcule os parâmetros de ligação médio usando uma equação de três repetições independentes no mínimo. Prossiga para preparar contas calibradas incubando plaquetas filtradas em gel com cálcio IANA 4A vinte e três, cento e oitenta e sete na presença de 2,5 milimilas de cloreto de cálcio por 10 minutos à temperatura ambiente. As plaquetas ativadas adicionam as várias concentrações de FX FD e incubam as plaquetas com dois por cento de formaldeído.Após uma hora, pare a reação incubando as plaquetas com três glicina molar e 5%BSA por 30 minutos em temperatura ambiente. Em seguida, purifique a mistura do corante não redigido com centrifugação a 400 vezes G por cinco minutos. Remova o supernato antes de reutilizar a pelota no buffer de Tyrode contendo 0,5% BSA.Em seguida, meça o nível de fluorescência das contas de calibração em cada amostra usando um espectrômetro e, em seguida, usando o citômetro de fluxo. Determine o número de contas em cada amostra com a ajuda de um contador celular. Converta a intensidade da fluorescência de cada amostra de contas respectiva para a concentração de corante fluorescente solúvel usando um espectrômetro e recalcula a concentração de corante fluorescente para o número de moléculas de espectrofluorômetro.Crie um gráfico de dependência da fluorescência média das contas em um címetro de fluxo sobre o número de moléculas fluróforas para cada amostra. Em seguida, aproxime-se da dependência por proporcionalidade de linha usando o encaixe da análise e ajuste as guias lineares em ordem. A partir da aproximação na equação, calcule o fator de conversão da fluorescência média para locais de vinculação.Mais tarde, calcule o número aparente dos sites vinculantes por vesícula de interesse. A análise representativa mostra o brilho das vesículas lipídicas de fósforo artificial que têm um micrômetro de tamanho com o corante fluorescente lipofílico incorporado, corante I C 16, o portão foi definido com base em uma amostra contendo vesículas lipídicas artificiais do mesmo tamanho sem o corante fluorescente. A cinética da proteína que liga as vesículas foi analisada no primeiro estágio coletando a amostra continuamente.Os dados obtidos foram analisados por meio de citometria de fluxo. As medidas citométricas de fluxo devem começar o mais rápido possível após a mistura das soluções e diluição com o buffer de Tyrode. O método proposto poderia ser complementado com ressonância plasmática superficial para estudos trazidos em interações de membrana que é altamente sensível com boa resolução temporária e não requer entrega A principal vantagem deste método é sua acessibilidade e simplicidade.

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Biochemistry

Bioquímica

Este vídeo discute o ensaio de vazamento de fluorescência para estudar as interações de peptídeos que penetram nas células com as membranas celulares usando imitadores de membrana celular - grandes vesículas unilamelares, ou LUVs, encapsuladas com um corante fluorescente e um atenuador.

Ensaio de vazamento de fluorescência para estudar a interação do peptídeo que penetra nas células com a membrana

Neste vídeo, demonstramos a interação entre proteínas e vesículas fosfolipídicas artificiais usando citometria de fluxo quantitativa. A ligação de proteínas marcadas com fluorescência a vesículas fosfolipídicas marcadas com fluorescência aumenta a intensidade média de fluorescência, e esse aumento é detectado por um citômetro de fluxo.

Citometria de fluxo quantitativa para estudar interações proteína-fosfolipídio veicular marcadas

Neste vídeo, demonstramos as interações proteína-fosfoinositídeo em um padrão microfluídico usando o ensaio de modulação de pH, usando corante fluorescente sensível ao pH marcado com lipídio fosfatidiletanolamina de uma bicamada lipídica suportada, chamada de plataforma microfluídica. As modulações no pH após a ligação da proteína ao fosfolipídio causam extinção de fluorescência.

Ensaio de modulação de pH em bicamadas lipídicas suportadas para detectar interações proteína-fosfoinositídeo

Citometria de fluxo e de Complementação de fluorescência Bimolecular fornece um método quantitativo de alto rendimento para estudar a interação proteína-proteína. Esta metodologia pode ser aplicada ao mapeamento de locais de ligação de proteína e para o rastreio de factores que regulam a interacção proteína-proteína.

Citometria de fluxo e de Complementação de fluorescência Bimolecular: A alta taxa de transferência método quantitativo para estudo de interação proteína-proteína

O protocolo apresentado descreve a análise do transporte mediado por proteínas de membrana no nível do transportador único usando bicamadas lipídicas livres de solvente que abrangem os poros. Isso é alcançado pela criação de chips de matriz de nanoporos produzidos em massa, combinados com aquisição e análise de dados altamente paralelas, permitindo o estabelecimento futuro de telas efetoras de proteínas de membrana.

Membrane Transport processos analisados ​​por um Sistema Nanopore Chip altamente paralelos na resolução Protein Individual

Aqui, apresentamos um protocolo para detectar eventos individuais, mediada por SNARE fusão entre lipossomas e bicamadas suportados em canais microfluídicos usando TIRFM polarizada, com sensibilidade única molécula e ~ 15 resolução de tempo ms. Lipídico e liberação de cargas solúveis podem ser detectados simultaneamente. o tamanho do lipossoma, de difusividade lípido, e propriedades de fusão dos poros são medidos.

Fusão SNARE mediada por uma única proteolipossomos com Bicamadas suportados Tethered em uma célula Microfluidic fluxo monitorado por polarizada TIRF microscopia

arritmias cardíacas hereditárias são geralmente causadas por mutações que alteram a entrega de superfície de um ou mais canais de íons. Aqui, nós adaptar ensaios de citometria de fluxo para proporcionar uma quantificação da expressão de proteína total e a superfície celular relativa dos canais de iões recombinantes expressas em células TSA-201.

Determinação da superfície celular Relativa e Expressão total de canais recombinante de iões utilizando Citometria de Fluxo

Rotular o domínio extracelular de uma proteína de membrana com um fluoróforo sensível ao pH, superecliptic pHluorin (SEP), permite a localização subcelular, expressão, e o tráfico de ser determinado. proteínas imagiologia SEP-rotulado com microscopia de fluorescência de reflexão total interna (TIRFM) permite a quantificação dos níveis da proteína na membrana do RE e periférico plasma.

Utilizando Receptores pHluorin-tag para monitorar subcelular Localização e Tráfico

O protocolo descreve um método reprodutível, projetado para uso com sobrenadantes de cultura celular para detectar epítopos superficiais em pequenas vesículas extracelulares (EV). Ele utiliza a imunoprecipitação de EV específica usando grânulos juntamente com anticorpos que reconhecem o antígeno de superfície CD9, CD63 e CD81. O método é otimizado para análise de citometria de fluxo a jusante.

Fluxo Cytometric análise das vesículas extracelulares de célula-condicionado Media

Este protocolo descreve a fabricação de lipossomas e como estes podem ser imobilizados em uma superfície e imagemindividualmente de uma forma paralela maciça usando microscopia de fluorescência. Isso permite a quantificação do tamanho e inhomogeneidade composicional entre os lipossomos únicos da população.

Um ensaio de liposcopia única baseado em microscopia quantitativa para detectar a inhomogeneidade composicional entre lipossomos individuais

Aqui, descrevemos protocolos usando sensores lipídicos fluorescentes e lipossomos para determinar se uma proteína extrai e transporta fosfatidylserina ou fosfattidylinositol 4-fosfato in vitro.

Medidas baseadas em fluorescência de fosfatidaserina/fosfattidylinositol 4-fosfato troca entre membranas

Aprenda a usar citometria de fluxo quantitativo para estudar interações proteína-lipídeo em microvesículas fosfolipídicas artificiais. Este método simples permite calcular constantes cinéticas e estimar sítios de ligação.

Analisando a Interação de Proteínas Fluorescentes com Microvesculas Fosfolipísicas Artificiais usando Citometria de Fluxo Quantitativo (Vídeo) | JoVE Journal

Analisando a Interação de Proteínas Fluorescentes com Microvesculas Fosfolipísicas Artificiais usando Citometria de Fluxo Quantitativo

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