Name: Transformação Natural, Expressão proteica e Crioconservação da Cicocrias Cianobacterium Phormidium lacuna (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-01T14:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 47 s
Description: Aprenda transformação natural e análise de motilidade na cianobactéria Phormidium lacuna. Este método permite manipulações genéticas em membros da ordem Oscillatoriales para estudos de biotecnologia.

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O trabalho contou com o apoio do Instituto de Tecnologia Karlsruher.

<ol><li>Brasil, B., de Siqueira, F. G., Salum, T. F. C., Zanette, C. M., Spier, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microalgae+and+cyanobacteria+as+enzyme+biofactories%5BTitle%5D)+AND+%22Algal+Research-Biomass+Biofuels+and+Bioproducts%22%5BJournal%5D)">Microalgae and cyanobacteria as enzyme biofactories.</a> Algal Research-Biomass Biofuels and Bioproducts. 25, 76-89 (2017).</li>
<li>Gundolf, R., Oberleitner, S., Richter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+New+Genetic+Toolkits+and+Their+Role+for+Ethanol+Production+in+Cyanobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Energies%22%5BJournal%5D)">Evaluation of New Genetic Toolkits and Their Role for Ethanol Production in Cyanobacteria.</a> Energies. 12 (18), 3515(2019).</li>
<li>Wendt, K. E., Pakrasi, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomics+approaches+to+deciphering+natural+transformation+in+cyanobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Genomics approaches to deciphering natural transformation in cyanobacteria.</a> Frontiers in Microbiology. 10, 1259(2019).</li>
<li>Tandeau de Marsac, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+approach+for+molecular+cloning+in+cyanobacteria%3A+cloning+of+an+Anacystis+nidulans+met+gene+using+a+Tn901-induced+mutant%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">A new approach for molecular cloning in cyanobacteria: cloning of an Anacystis nidulans met gene using a Tn901-induced mutant.</a> Gene. 20 (1), 111-119 (1982).</li>
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<li>Joset, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+in+Synechocystis+PCC+6714+and+6803%3A+preparation+of+chromosomal+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Transformation in Synechocystis PCC 6714 and 6803: preparation of chromosomal DNA.</a> Methods in Enzymology. 167, 712-714 (1988).</li>
<li>Tsinoremas, N. F., Kutach, A. K., Strayer, C. A., Golden, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+gene+transfer+in+Synechococcus+sp+strains+PCC-7942+and+PCC-6301+by+interspecies+conjugation+and+chromosomal+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Efficient gene transfer in Synechococcus sp strains PCC-7942 and PCC-6301 by interspecies conjugation and chromosomal recombination.</a> Journal of Bacteriology. 176 (21), 6764-6768 (1994).</li>
<li>Matsunaga, T., Takeyama, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+engineering+in+marine+cyanobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Phycology%22%5BJournal%5D)">Genetic engineering in marine cyanobacteria.</a> Journal of Applied Phycology. 7 (1), 77-84 (1995).</li>
<li>Frigaard, N. U., Sakuragi, Y., Bryant, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+inactivation+in+the+cyanobacterium+Synechococcus+sp.+PCC+7002+and+the+green+sulfur+bacterium+Chlorobium+tepidum+using+in+vitro-made+DNA+constructs+and+natural+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Gene inactivation in the cyanobacterium Synechococcus sp. PCC 7002 and the green sulfur bacterium Chlorobium tepidum using in vitro-made DNA constructs and natural transformation.</a> Methods in Molecular Biology. 274, 325-340 (2004).</li>
<li>Iwai, M., Katoh, H., Katayama, M., Ikeuchi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+genetic+transformation+of+the+thermophilic+cyanobacterium%2C+Thermosynechococcus+elongatus+BP-1%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+and+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Improved genetic transformation of the thermophilic cyanobacterium, Thermosynechococcus elongatus BP-1.</a> Plant and Cell Physiology. 45 (2), 171-175 (2004).</li>
<li>Vioque, A. Transformation of cyanobacteria. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aVioque%2C+A+%22Transgenic+Microalgae+as+Green+Cell%22">Transgenic Microalgae as Green Cell</a>. Leon, R., Galvan, A., Fernandez, E. , Springer. 12-22 (2007).</li>
<li>Nies, F., Mielke, M., Pochert, J., Lamparter, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+transformation+of+the+filamentous+cyanobacterium+Phormidium+lacuna%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">Natural transformation of the filamentous cyanobacterium Phormidium lacuna.</a> Plos One. 15 (6), 0234440(2020).</li>
<li>Ravindran, C. R. M., Suguna, S., Shanmugasundaram, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation+as+a+tool+to+transfer+the+plasmid+pRL489+in+Oscillatoria+MKU+277%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microbiological+Methods%22%5BJournal%5D)">Electroporation as a tool to transfer the plasmid pRL489 in Oscillatoria MKU 277.</a> Journal of Microbiological Methods. 66 (1), 174-176 (2006).</li>
<li>El Semary, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+electroporation-induced+transformation+in+Microcystis+aeruginosa+PCC7806%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnologie+Agronomie+Societe+et+Environnement%22%5BJournal%5D)">Optimized electroporation-induced transformation in Microcystis aeruginosa PCC7806.</a> Biotechnologie Agronomie Societe et Environnement. 14 (1), 149-152 (2010).</li>
<li>Nies, F., Mielke, M., Pochert, J., Lamparter, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+transformation+of+the+filamentous+cyanobacterium+Phormidium+lacuna%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Natural transformation of the filamentous cyanobacterium Phormidium lacuna.</a> PLoS One. 15 (6), 0234440(2020).</li>
<li>Sode, K., Tatara, M., Takeyama, H., Burgess, J. G., Matsunaga, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conjugative+gene-transfer+in+marine+cyanobacteria+-+Synechococcus+Sp%2C+Synechocystis+Sp+and+Pseudanabaena+Sp%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Microbiology+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Conjugative gene-transfer in marine cyanobacteria - Synechococcus Sp, Synechocystis Sp and Pseudanabaena Sp.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 37 (3), 369-373 (1992).</li>
<li>Stucken, K., Ilhan, J., Roettger, M., Dagan, T., Martin, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+and+conjugal+transfer+of+foreign+gGenes+into+the+filamentous+multicellular+cyanobacteria+%28Subsection+V%29+Fischerella+and+Chlorogloeopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Transformation and conjugal transfer of foreign gGenes into the filamentous multicellular cyanobacteria (Subsection V) Fischerella and Chlorogloeopsis.</a> Current Microbiology. 65 (5), 552-560 (2012).</li>
<li>Bellali, S., Khalil, J. B., Fontanini, A., Raoult, D., Lagier, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+protectant+medium+preserving+bacterial+viability+after+freeze+drying%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiological+Research%22%5BJournal%5D)">A new protectant medium preserving bacterial viability after freeze drying.</a> Microbiological Research. 236, 126454(2020).</li>
<li>Wallner, T., Pedroza, L., Voigt, K., Kaever, V., Wilde, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cyanobacterial+phytochrome+2+regulates+the+expression+of+motility-related+genes+through+the+second+messenger+cyclic+di-GMP%5BTitle%5D)+AND+%22Photochemical+%26+Photobiological+Sciences%22%5BJournal%5D)">The cyanobacterial phytochrome 2 regulates the expression of motility-related genes through the second messenger cyclic di-GMP.</a> Photochemical & Photobiological Sciences. 19 (5), 631-643 (2020).</li>
<li>Wilde, A., Fiedler, B., Borner, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cyanobacterial+phytochrome+Cph2+inhibits+phototaxis+towards+blue+light%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The cyanobacterial phytochrome Cph2 inhibits phototaxis towards blue light.</a> Molecular Microbiology. 44 (4), 981-988 (2002).</li>
<li>Bhaya, D., Takahashi, A., Grossman, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+regulation+of+type+IV+pilus-dependent+motility+by+chemosensor-like+elements+in+Synechocystis+PCC6803%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Light regulation of type IV pilus-dependent motility by chemosensor-like elements in Synechocystis PCC6803.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (13), 7540-7545 (2001).</li>
<li>Guillard, R. R., Ryther, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+of+marine+planktonic+diatoms.+I.+Cyclotella+nana+Hustedt%2C+and+Detonula+confervacea+%28cleve%29+Gran%5BTitle%5D)+AND+%22Canadian+Journal+of+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Studies of marine planktonic diatoms. I. Cyclotella nana Hustedt, and Detonula confervacea (cleve) Gran.</a> Canadian Journal of Microbiology. 8, 229-239 (1962).</li>
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<li>Schlosser, U. G., Friedl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Additions+to+the+culture+collection+of+algae+at+Gottingen+since+1997%5BTitle%5D)+AND+%22Nova+Hedwigia%22%5BJournal%5D)">Additions to the culture collection of algae at Gottingen since 1997.</a> Nova Hedwigia. 71 (1-2), 243-262 (2000).</li>
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<li>Carrer, H., Hockenberry, T. N., Svab, Z., Maliga, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kanamycin+resistance+as+a+selectable+marker+for+plastid+transformation+in+tobacco%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+General+Genetics%3A+MGG%22%5BJournal%5D)">Kanamycin resistance as a selectable marker for plastid transformation in tobacco.</a> Molecular and General Genetics: MGG. 241 (1-2), 49-56 (1993).</li>
<li>Kaulen, H., Schell, J., Kreuzaler, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-induced+expression+of+the+chimeric+chalcone+synthase-NptII+gene+in+tobacco+cells%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Light-induced expression of the chimeric chalcone synthase-NptII gene in tobacco cells.</a> EMBO Journal. 5 (1), 1-8 (1986).</li>
<li>Cotlet, M., Goodwin, P. M., Waldo, G. S., Werner, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+the+fluorescence+dynamics+of+single+molecules+of+a+green+fluorescent+protein%3A+One-+versus+two-photon+excitation%5BTitle%5D)+AND+%22Chemphyschem%22%5BJournal%5D)">A comparison of the fluorescence dynamics of single molecules of a green fluorescent protein: One- versus two-photon excitation.</a> Chemphyschem. 7 (1), 250-260 (2006).</li>
<li>Taton, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+circadian+clock+and+darkness+control+natural+competence+in+cyanobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">The circadian clock and darkness control natural competence in cyanobacteria.</a> Nature Communications. 11 (1), 1688(2020).</li>
</ol>

Os autores não têm conflitos de interesse para divulgar.

Embora muitas cepas de cianobactérias estejam disponíveis a partir de coleções culturais 32,33,34,35,36, ainda há uma demanda por novas cianobactérias da natureza porque essas espécies são adaptadas a propriedades específicas. P. lacuna foi coletado a partir de piscinas rochosas e é adaptado a variações de concentrações de sal e temperatura<sup class=...

Cianobactérias são organismos procarióticos que utilizam a fotossíntese como fonte de energia 1,2. A pesquisa está cada vez mais focada em espécies cianobacterianas. Várias cianobactérias podem ser transformadas com DNA3. Genes podem ser eliminados ou superexpressos nestas espécies. No entanto, a transformação é restrita a algumas espécies 4,5,6,7,8,9,10,11, e pode ser difícil estabelecer transformação em cepas de coleções culturais ou selvagens 8. Cepas da espécie filamentosa Phormidium lacuna (Figura 1) foram isoladas de piscinas marinhas, nas quais as condições ambientais, como concentrações de sal ou temperatura, flutuam ao longo do tempo. Estas cianobactérias filamentosas podem ser usadas como organismos modelo para a ordem Oscillatoriales12 a que pertencem.
Durante os testes testando a transferência de genes por eletroporação13,14, descobriu-se que a P. lacuna pode ser transformada pela transformação natural15. Nesse processo, o DNA é tomado naturalmente por algumas células. Em comparação com outros métodos de transformação16,17, a transformação natural tem a vantagem de não exigir ferramentas adicionais que possam complicar o procedimento. Por exemplo, a eletroporação requer cuvetas adequadas, fios intactos e seleção da tensão adequada. P. lacuna é atualmente o único membro oscillatoriales suscetível à transformação natural. Como o protocolo original é baseado em protocolos de eletroporação, ele ainda incluía várias etapas de lavagem que podem ser desnecessárias. Diferentes abordagens foram testadas para simplificar o protocolo, levando ao protocolo de transformação aqui apresentado.
A sequência do genoma é essencial para outros estudos moleculares baseados em nocaute genético ou superexpressão. Embora as sequências de genoma possam ser obtidas com máquinas de sequenciamento de última geração em curtos períodos, a extração do DNA pode ser difícil e depende da espécie. Com P. lacuna, vários protocolos foram testados. Um método modificado de cetil trimethyl amônio (CTAB) foi então estabelecido, resultando em pureza aceitável dos rendimentos de DNA e DNA de cada ciclo de purificação para o trabalho contínuo em laboratório. O genoma de cinco cepas pode ser sequenciado com este protocolo. O próximo passo de transformação lógica foi estabelecer expressão proteica em P. lacuna.
O sfGFP usado como proteína marcadora neste protocolo pode ser detectado com qualquer microscópio de fluorescência. Todos os promotores que foram testados poderiam ser usados para a expressão P. lacuna sfGFP. O aumento do número de cepas decorrentes da transformação resultou na necessidade de um método para armazenar as culturas. Tais métodos são estabelecidos para Escherichia coli e muitas outras bactérias18. Nos protocolos padrão, culturas de glicerol são preparadas, transferidas em nitrogênio líquido e armazenadas a -80 °C. Este método requer apenas alguns passos e é altamente confiável para as espécies para as quais é estabelecido. O protocolo padrão não era viável para P. lacuna porque as células vivas não podiam ser recuperadas em todos os casos. No entanto, quando o glicerol foi removido após o descongelamento, células de todos os ensaios sobreviveram. Métodos simples são apresentados para a análise da motilidade de P. lacuna, que pode ser combinada com mutagênese nocaute para investigar pili tipo IV ou o papel dos fotorreceptores. Estes ensaios são diferentes dos de cianobactériasunicelulares 19,20,21 e também podem ser úteis para outras Oscillatoria.

<table><tbody><tr><td>Autoclave 3870 ELV</td><td>Tuttnauer</td><td>3870 ELV</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>OttoNorwald</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>BG-11 Solução de água doce</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C3061</td><td></td></tr><tr><td>BG-11 médio</td><td>Merck</td><td>73816-250ML</td><td></td></tr><tr><td>Ácido bórico</td><td>Merck</td><td>10043-35-3</td><td>H3BO3</td></tr><tr><td>Cloreto de cálcio di-hidratado</td><td>Carl Roth</td><td>10035-04-8</td><td>CaCl2 &middot; 2 H2O</td></tr><tr><td>Frascos de cultura de células Cellstar com tampa de rosca de filtro, estéreis, 250 mL</td><td>Greiner</td><td>658190</td><td></td></tr><tr><td>Frascos de cultura de células Cellstar com tampa de rosca de filtro, estéril, 50 mL</td><td>Centrífuga de 601975</td><td></td><td></td>Greiner</tr><tr><td>LYNX 4000</td><td>Thermo Scientific</td><td>75006580</td><td>e rotor</td></tr><tr><td>Centrífuga microstar 17</td><td>VWR International</td><td>N/A</td><td>para até 13.000 rpm</td></tr><tr><td>Brometo de cetiltrimetilamónio (CTAB)</td><td>PanReac AppliChem</td><td>57-09-0</td><td>C19H42BrN</td></tr><tr><td>Clorofórmio : Álcool isoamílico 24 : 1</td><td>PanReac AppliChem</td><td> A1935</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de cobalto(II) hexahidratado</td><td>Merck</td><td>7791-13-1</td><td>CoCl2 &middot; 6 H2O</td></tr><tr><td>Sulfato de cobre(II) pentahidratado</td><td>Merck</td><td>7758-99-8</td><td>&nbsp; CuSO4 &middot; 5 H2O</td></tr><tr><td>D(+)-Biotina</td><td>Carl Roth</td><td>58-85-5</td><td>&nbsp; C10H16N2O3S</td></tr><tr><td>Escada de DNA 1 kb</td><td>New England Biolabs</td><td>N3232</td><td></td></tr><tr><td>Escada de DNA 100 bp</td><td>New England Biolabs</td><td>N3231</td><td></td></tr><tr><td>Ajuda de pipetagem elétrica accujet-pro S</td><td>Brand GmbH</td><td>26360</td><td>para pipetagem 1-25 mL</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>VWR</td><td>64-17-5</td><td>C2H6O</td></tr><tr><td>Ácido etilenodiamina tetraacético sal dissódico di-hidratado</td><td>Carl Roth</td><td>6381-92-6</td><td>EDTA-Na2 &middot; 2 H2O</td></tr><tr><td>Microscópio de fluorescência ApoTome</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscópio de fluorescência Axio Imager 2</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>French Pressure Cell Press</td><td>American Instrument Company</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de documentação em gel Saffe Image</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gelelctrophoresis system Mupid-One/-exu</td><td>ADVANCED</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glassware, diferente</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Carl Roth</td><td>56-81-5</td><td>C3H8O3</td></tr><tr><td>Cloreto de ferro (III) hexahidratado</td><td>Merck</td><td>10025-77-1</td><td>&nbsp; FeCl3 &middot; 6 H2O</td></tr><tr><td>Kanamicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>25389-94-0</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de canamicina</td><td>Carl Roth</td><td>25389-94-0</td><td>C18H36N4O11 &middot; H2SO4</td></tr><tr><td>Lauroilsarcosina, Sal de Sódio (Sarcosil)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>137-16-6</td><td>C15H28NO3 &middot; Na</td></tr><tr><td>LB Broth (Lennox)</td><td>Carl Roth</td><td>X964.4</td><td></td></tr><tr><td>Fonte de luz, tubo fluorescente L18W/954 luz do dia</td><td>OSRAM</td><td></td><td>cultivo de cianobactérias</td></tr><tr><td>Fonte de luz, painel LED XL 6500K 140 W</td><td>Bloom Star</td><td>N/A</td><td>cultivo de cianobactérias, até 1.000 &micro; mol m-2 s-1</td></tr><tr><td>Cloreto de magnésio hexahidratado</td><td>Carl Roth</td><td>7791-18-6</td><td>MgCl2 &middot; 6 H2O</td></tr><tr><td>Cloreto de manganês(II) tetrahidratado</td><td>Serva</td><td>13446-34-9</td><td>MnCl2 &middot; 4 H2O</td></tr><tr><td>Microscópio DM750</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kit de extração de plasmídeo de preparação Midi NucleoBond Xtra Kit Midi</td><td>Macherey-NAGEL GmbH & Co. KG</td><td>REF740410.50</td><td></td></tr><tr><td>Minicomputador Raspberry Pi 4 +</td><td>Conrad Electronics</td><td>2138863-YD</td><td>para gravação em time-lapse</td></tr><tr><td>Câmera ocular EC3</td><td>Leica</td><td></td><td>para gravação contínua até 30 s</td></tr><tr><td>Câmera ocular MikrOkular Full HD</td><td>Bresser</td><td></td><td>para gravações de lapso de tempo, acoplado ao minicomputador Raspberry Pi</td></tr><tr><td>Placas de Petri poliestirol, 100 mm x 20 mm</td><td>Merck</td><td>P5606-400EA</td><td></td></tr><tr><td>placas de Petri poliestirol, 60 mm x 15 mm</td><td>Merck</td><td>P5481-500EA</td><td></td></tr><tr><td>Fotômetro Nanodrop ND-1000</td><td>Peqlab Biotechnologie</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fotômetro Uvikon XS</td><td>Goebel Instrumentelle Analytik GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipetman 100-1,000 &micro; L</td><td>Gilson</td><td>SKU: FA10006M</td><td></td></tr><tr><td>Pipetman 10-100 &micro; L</td><td>Gilson</td><td>SKU: FA10004M</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas de plástico 10 mL,</td><td>Greiner</td> estéril <td>607107</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de plástico, estéril, 15 mL</td><td>Greiner</td><td>188271</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de plástico, estéril, 50 mL</td><td>Greiner</td><td>227261</td><td></td></tr><tr><td>Brometo de potássio</td><td>Carl Roth</td><td>7758-02-3</td><td>KBr</td></tr><tr><td>Cloreto de potássio</td><td>Carl Roth</td><td>7447-40-7</td><td>KCl</td></tr><tr><td>Fonte de alimentação Statron 3252-1</td><td>Statron Ger&auml; tetechnik GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fonte de alimentação Voltcraft PPS 16005</td><td>Conrad Electronics</td><td></td><td>para LED</td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Promega</td><td>MC500C</td><td>da Maxwell 16 miRNA Tissue Kit AS1470</td></tr><tr><td>Q5 polimerase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0491S</td><td></td></tr><tr><td>Kit de sequenciamento NextSeq 500/550 v2.5</td><td>Illumina</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sistema de sequenciamento NextSeq 550 SY-415-1002</td><td>Illumina</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Shaker Unimax 2010</td><td>Heidolph Instrumentos</td><td></td><td>para cultivo</td></tr><tr><td>Acetato de sódio</td><td>Carl Roth</td><td>127-09-3</td><td>NaCH3COO</td></tr><tr><td>Cloreto de sódio</td><td>Carl Roth</td><td>7647-14-5</td><td>NaCl</td></tr><tr><td>Sódio di-hidrogenofosfato monohidratado</td><td>Carl Roth</td><td>10049-21-5</td><td>NaH2PO4 &middot; H2O</td></tr><tr><td>Fluoreto de sódio</td><td>Carl Roth</td><td>7681-49-4</td><td>NaF</td></tr><tr><td>Hidrogenocarbonato de sódio</td><td>Carl Roth</td><td>144-55-8</td><td>NaHCO3</td></tr><tr><td>Molibdato de sódio di-hidratado</td><td>Serva</td><td>10102-40-6</td><td>Na2MoO4 &middot; 2 H2O</td></tr><tr><td>Nitrato de sódio</td><td>Merck</td><td>7631-99-4</td><td>NaNO3</td></tr><tr><td>Sulfato de sódio</td><td>Carl Roth</td><td>7757-82-6</td><td>Na2SO4</td></tr><tr><td>Cloreto de estrôncio hexa-hidratado</td><td>Carl Roth</td><td>10025-70-4</td><td>SrCl2 &middot; 6 H2O</td></tr><tr><td>Cloridrato de tiamina</td><td>Merck</td><td>67-03-8</td><td>C12H17ClN4OS &middot; HCl</td></tr><tr><td>TRIS</td><td>Carl Roth</td><td>77-86-1</td><td>C4H11NO3</td></tr><tr><td>Dispositivo ultrassônico UP100H com sonotrodo MS3</td><td>Hielscher Ultrasound Technology</td><td>UP100H</td><td></td></tr><tr><td>Ultraturrax Silent Crusher M</td><td>Heidolph Instruments</td><td></td><td>homogeneizador</td></tr><tr><td>Ureia</td><td>Carl Roth</td><td>57-13-6</td><td>CH4N2O</td></tr><tr><td>Vitamina B12</td><td>Sigma</td><td>68-19-9</td><td>C63H88CoN14O14P</td></tr><tr><td>Solução</td><td></td><td></td> de vitamina <td>0,3 &micro; M tiamina-HCl, 2,1 nM de biotina, 0,37 nM de cianocobalamina</td></tr><tr><td>Destiladores de água, tratamento de água</td><td>VEOLIA water technologies</td><td>ELGA_21001</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de zinco heptahidratado</td><td>Sigma</td><td>7446-20-0</td><td>ZnSO4 &middot; 7 H2O</td></tr><tr><td>software, programa URL</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>gatb-minia para montagem</td> <td>de DNAhttps://github.com/GATB/gatb-minia-pipeline</td><td>faz grandes andaimes a partir de leituras curtas de DNA,</td> software ImageJ baseado em <td></td>Linux</tr><tr><td></td><td>para processamento de imagens (intensidades de pixel, diâmetro do círculo)</td><td></td>Servidor de anotação RAST https://rast.nmpdr.org entrada: sequência de DNA do genoma, detecta quadros de leitura abertos, lista sequências de proteínas e suas funções<forte>Meios de cultura</forte <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Água do mar artificial</td><td>0,41 M NaCl , 53 mM MgCl2,28 mM Na2SO4, 10 mM CaCl2 , 9 mM&nbsp; KCl , 2,4 mM NaHCO3 ,0,84 mM KBr, 0,49 mM H3BO3, 90 &micro; M SrCl2, 72 &micro; M NaF</td><td></td><td></td></tr><tr><td>f/2 - meio líquido</td> água <td>do mar artificial, 0,1 % (v/v) solução de oligoelementos, 0,05 % (v/v) solução de vitamina, 0,88 mM NaNO3, 36 &micro; M NaH2PO4&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>f/2+ meio líquido</td><td>f/2-medium, com aumento de 10 vezes NaNO3 e NaH2PO4 (0,88 mM NaNO3, 36 &micro; M NaH2PO4</td><td></td><td></td></tr><tr><td>f/2+-ágar</td><td>3 % (m/v) ágar bacto, água do mar artificial, solução de oligoelementos a 0,1 % (v/v), solução vitamínica a 0,05 % (v/v), 8,8 mM NaNO3, 0,36 mM NaH2PO4</td><td></td><td></td></tr><tr><td>f/2-ágar</td><td>3 % (p/v) de ágar bacto, água do mar artificial, 0,1% (v/v) solução de oligoelementos, 0,05% (v/v) solução de vitamina, 0,88 mM NaNO3, 36 &micro; M NaH2PO4Solução de</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>oligoelementos</td><td>0,36 mM NaH2PO4, 12 &micro; M Na2EDTA, 39 nM CuSO4, 26 nM Na2MoO4 , 77 nM ZnSO4, 42 nM CoCl2, 0,91 &micro; M MnCl2</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Solução vitamínica</td><td>0,3 &micro; M tiamina-HCl, 2,1 nM de biotina, 0,37 nM de cianocobalamina</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

transformação natural, expressão proteica e crioconservação da cicocrias cianobacterium phormidium lacuna

Natural Transformation, Protein Expression, and Cryoconservation of the Filamentous Cyanobacterium Phormidium lacuna

As cianobactérias são o foco de pesquisas básicas e projetos biotecnológicos nos quais a energia solar é utilizada para a produção de biomassa. Phormidium lacuna é um recém-isolado cianobacterium filamentous. Este artigo descreve como novas cianobactérias filamentosas podem ser isoladas das piscinas marinhas. Também descreve como o DNA pode ser extraído de filamentos e como os genomas podem ser sequenciados. Embora a transformação seja estabelecida para muitas espécies unicelulares, é menos frequentemente relatada para cianobactérias filamentosas. Um método simplificado para a transformação natural de P. lacuna é descrito aqui. P. lacuna é o único membro da ordem Oscillatoriales para o qual a transformação natural é estabelecida. Este artigo também mostra como a transformação natural é usada para expressar proteína fluorescente verde superpatos (sfGFP). Um promotor endógeno do CPCB induziu aproximadamente 5 vezes mais expressão do que os promotores do CPC560, A2813 ou psbA2 do Synechocystis sp. PCC6803. Além disso, foi estabelecido um método para a criopreservação de P. lacuna e Synechocystis sp.CPP 6803, e são descritos métodos para avaliação da motilidade em meio líquido e em superfícies de ágar e plástico.

Seguindo os métodos acima mencionados, 5 cepas diferentes de P. lacuna foram isoladas de balanços e sequenciadas (Figura 1 e Tabela 1). Todas as culturas foram estéreis após ~1 ano de subcultura, exceto P. lacuna HE10JO. Esta cepa ainda está contaminada com Marivirga Atlantica, uma bactéria marinha. Durante as excursões subsequentes de Helgoland, outras cianobactérias filamentosas foram isoladas das piscinas rochosas, que são diferentes de P. l...

Phormidium lacuna é um cianobacterium filamentoso que foi isolado de piscinas marinhas. Este artigo descreve o isolamento de filamentos de fontes naturais, extração de DNA, sequenciamento de genomas, transformação natural, expressão de sfGFP, crioconservação e motilidade.

Transformação Natural, Expressão proteica e Crioconservação da Cicocrias Cianobacterium Phormidium lacuna

Cyanobacteria are the focus of basic research and biotechnological projects in which solar energy is utilized for biomass production. Phormidium lacuna is ...

Este protocolo descreve como o cianobacterium filamentoso que pertence aos oscillatoriales pode ser transformado pela transformação natural. Também mostra como diferentes tipos de movimento podem ser estudados. A transformação natural é a técnica de transformação mais simples, se funcionar.Apenas DNA, células e meio de crescimento são necessários. Até agora, nenhum outro membro oscillatorial poderia ser transformado pela transformação natural. Esperamos que nossos estudos estimulem outros grupos a tentar outras oscilações.Para a transformação, faça uma boa e saudável cultura de aparência e uma boa preparação de DNA. Para estudos de movimento, use sempre uma cultura tratada com ultrassom. O tratamento deve ser fresco.Demonstrando o procedimento estará Nora Weber, técnica do meu laboratório. Comece inoculando 50 mililitros líquidos F2 em cada um dos dois frascos de 250 mililitros com um mililitro de filamentos P.lacuna de uma cultura em execução. Cultive com luz branca sob agitação por cerca de cinco dias a 25 graus Celsius.Após cinco dias, homogeneize 100 mililitros de suspensão celular P.lacuna a 10.000 RPM por três minutos e meça a densidade óptica em 750 nanômetros. Em seguida, centrifuse a suspensão celular por 15 minutos a 6.000 vezes G.Remova o supernascer e suspenda a pelota em 800 microliters do líquido restante e adicional F2+médio. Leve oito placas de ágar F2+Bacto contendo 120 microgramas por mililitro kanamycin e pipeta 10 microgramas de DNA no meio de cada placa de ágar.Imediatamente pipeta 100 microliters da suspensão celular em cima do DNA. Mantenha a placa de ágar sem tampa no banco limpo para permitir que o excesso de líquido evapore. Feche a placa e cultive-a em luz branca a 25 graus Celsius por dois dias.Após dois dias, distribua os filamentos de cada placa de ágar em várias placas frescas de ágar F2+Bacto contendo 120 microgramas por kanamicina mililitro com um laço de inoculação. Cultive as placas em luz branca a 25 graus Celsius e verifique as culturas regularmente sob um microscópio. Após 14 a 28 dias, identifique os filamentos acastúsis mortos e procure filamentos transformados sob o microscópio.Os filamentos transformados parecem saudáveis e verdes e são diferentes da maior parte dos filamentos. Transfira cada filamento transformado em frascos de 50 mililitros com 10 mililitros de F2+médio com 250 microgramas por kanamicina mililitro. Cultive em luz branca a 25 graus Celsius em um agitador e observe o crescimento por até quatro semanas.Transfira os filamentos de volta para o meio ágar contendo 250 microgramas por mililitro kanamycin e espere que os filamentos cresçam. Então, aumente a concentração de kanamicina novamente para acelerar a segregação. Para a expressão GFP, observa filamentos únicos com um microscópio de fluorescência a ampliação de 40X ou 63X e captura uma imagem de transmissão de campo brilhante e uma imagem de fluorescência.Cultivar P.lacuna em f2 médio sob agitação horizontal de 50 RPM em luz branca por cerca de cinco dias até que a densidade óptica estimada em 750 nanômetros se torne 0,35. Armazene a amostra a 4 graus Celsius. Homogeneize os filamentos com ultrassom por um minuto na potência máxima e ciclo de um.Meça a densidade óptica em 750 nanômetros e transfira oito mililitros do meio contendo P.lacuna em uma placa de Petri de seis centímetros. Aguarde alguns minutos até que a amostra atinja a temperatura ambiente e cubra a placa de Petri com papel alumínio. Coloque um slide de microscópio na tabela X-Y de um microscópio padrão com uma câmera.Ligue a luz do microscópio e mova um objetivo 4X ou 10X para o caminho da luz. Em seguida, coloque a placa de Petri em cima do slide. Ajuste filamentos individuais ou pacotes de filamentos pelos movimentos X, Y e Z da tabela.Observe os movimentos de filamentos ou feixes únicos e grave os movimentos com uma câmera de microscópio padrão. Certifique-se de que a lente objetiva não toque no líquido. Pipeta 0,5 mililitros de uma solução contendo P.lacuna na superfície do ágar Bacto de uma placa de Petri de seis centímetros.Deixe o líquido entrar na superfície. Após cerca de 20 minutos, feche a placa de Petri e observe o movimento dos filamentos na superfície usando um objetivo 4X ou 10X. Capture as gravações de lapso de tempo usando uma câmera ocular e um sistema de minicomp que o computador.Os filamentos devem primeiro ser focados pelos olhos e depois pela câmera ocular. Certifique-se de que o intervalo de tempo entre as imagens subsequentes é de cinco segundos a um minuto. Programe o script Linux do minicomp que o computador para controlar a gravação do lapso de tempo.Prepare os suportes de LED onde os LEDs de cinco milímetros são montados para irradiar uma área de 20 milímetros quadrados de baixo para cima. Meça e ajuste as intensidades do LED. Certifique-se de que toda a configuração está em uma sala escura ou em um recipiente fechado e escuro.Coloque oito mililitros do meio contendo P.lacuna em uma placa de Petri de seis centímetros, feche a placa de Petri com a tampa e coloque-a em um suporte de LED para que o LED esteja no centro da placa de Petri. Após tipicamente dois dias, capture uma imagem da placa de Petri com uma câmera de smartphone voltada diretamente para a posição do tratamento de luz. Use um suporte e uma folha branca como plano de fundo para garantir a mesma distância e condições de luz para cada imagem.Abra o software ImageJ, clique em Arquivo, Abra e selecione o arquivo. Em seguida, clique em Enter. Selecione o botão reto e pressione o botão esquerdo do mouse para desenhar uma linha de uma extremidade da placa de Petri até a extremidade oposta.Certifique-se de que a linha passe pelo centro do círculo de filamentos. Clique em Analisar e Medir para ver o comprimento da placa de Petri. Em seguida, clique em Analisar e Traçar perfil no menu ImageJ.Estime um valor médio para a intensidade do pixel fora do círculo e outro valor médio para a intensidade do pixel dentro do círculo. Aponte o mouse sobre a posição Y entre esses valores para estimar os valores X de ambos os lados do círculo. Observe ambos os valores e calcule a diferença.Em seguida, selecione o botão reto e desenhe uma linha no valor médio-máximo da intensidade do pixel. Por fim, clique em Analisar e, em seguida, Meça para obter o comprimento do círculo da célula interna. A integração e a segregação da inserção após a transformação de P.lacuna com PAK1 é mostrada aqui.Um teste pcr com primers externos cerca de uma semana após a transformação normalmente tem duas bandas no gel de eletroforese, uma com o tamanho da banda tipo selvagem, e uma banda migratória mais lenta que indica a inserção do de resistência. Aqui, as faixas 1 a 4 representam produtos PCR de filamentos após sete dias, 11 dias, 14 dias e 17 dias de isolamento de um filamento resistente, e a pista 5 representa produto PCR do tipo selvagem. Na amostra de sete dias, a inserção está presente em uma pequena fração dos cromossomos.Esta fração aumenta até 17 dias, onde nenhuma banda do tipo selvagem é visível;ou seja, a segregação está completa. Esta imagem representa o vetor pMH1 para expressão sfGHP sob o controle do promotor beta de ficocyanina endógena. P.lacuna sequência homólogo, espinha dorsal vetorial pUC19 e inserção com resistência sfGFP e kanamycin são mostrados aqui.No pMH1, o gene sfGHP é colocado três primos do gene beta de ficocyanina;portanto, é impulsionado pelo promotor beta do cpc endógeno. Imagens de fluorescência de filamentos do tipo selvagem P.lacuna e após a transformação com PAK1, PAK2, PAK3 e pMH1 são mostradas aqui. A expressão do SFGFP é impulsionada pelo promotor do CPC 560, pelo promotor a2813, pelo promotor do PSBA2S ou pelo promotor beta endógeno do CPC.As imagens mescladas aqui apresentadas mostram a motilidade da lacuna phormidium. O movimento na superfície do ágar é mostrado aqui. O intervalo de tempo foi de um minuto.O movimento no meio líquido é apresentado aqui. O intervalo de tempo foi de 10 segundos. Transformação natural é um método simples.Basta misturar DNA plasmídeo com uma fita de resistência em sequências homólogos com as células e deixar as células crescerem em um meio com antibióticos. Genes podem ser inativados e proteínas podem ser superexpressas. Isso é importante para qualquer pesquisa básica e para estudos biotécnicos.Em cianobactérias unicelulares onde a transformação natural também é estabelecida, foram abordados estudos moleculares sobre fotossíntese ou fotorreceptores, etc.

natural-transformation-protein-expression-cryoconservation

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Fonte: Weber, N. et. al., Transformação Natural, Expressão de Proteínas e Crioconservação da Cianobactéria Filamentosa Phormidium lacuna. J. Vis. Exp. (2022)Este vídeo demonstra um ensaio focado baseado em LED para estudar fototaxia em cianobactérias filamentosas. As bactérias migram em direção à fonte de luz, formando um acúmulo denso no centro iluminado, que é visualizado e quantificado por meio da análise da intensidade de pixels da imagem capturada.

Ensaio de fototaxia de cianobactérias filamentosas usando iluminação de luz focalizada

Fonte: Weber, N., et al., Transformação Natural, Expressão de Proteínas e Crioconservação da Cianobactéria Filamentosa Phormidium lacuna. J. Vis. Exp. (2022)Este vídeo descreve um procedimento para realizar a transformação natural em cianobactérias filamentosas usando DNA de plasmídeo para obter expressão estável de GFP e resistência a antibióticos por meio de recombinação homóloga.

Transformação natural e expressão de GFP na lacuna filamentosa de Cyanobacterium Phormidium

Fonte: Weber, N., et al., Transformação Natural, Expressão de Proteínas e Crioconservação da Cianobactéria Filamentosa Phormidium lacuna. J. Vis. Exp. (2022)Este vídeo demonstra o procedimento para avaliar a motilidade deslizante em Phormidium lacuna , homogeneizando culturas de filamentos para criar uma suspensão uniforme, preparando uma configuração de ensaio de placa de Petri sobre uma lâmina de microscópio e visualizando o movimento do filamento.

Motilidade deslizante em filamentos de Phormidium lacuna

Biologia sintética permite a engenharia de proteínas com propriedades sem precedentes usando a inserção co-translational de aminoácidos não-canônicas. Aqui, apresentamos como uma variante espectralmente avermelhado de um fluoróforo GFP-tipo com propriedades espectroscópicas de fluorescência romance, denominado proteína fluorescente "ouro" (GdFP), é produzida em Escherichia coli através de incorporação de pressão seletiva (SPI).

Engenharia 'Dourada' fluorescência por pressão seletiva de incorporação de aminoácidos não-canônicos e análise de proteínas por espectrometria de massa e fluorescência

Este protocolo descreve como visualizar a transiente compactação do DNA em cianobactérias. Cultivo síncrono, monitoramento por microscopia de fluorescência, congelação rápida e alta tomography do cryo-elétron de tensão são usados. É apresentado um protocolo para essas metodologias e desenvolvimentos e aplicações futuras são discutidos.

Visualização de compactação do DNA em cianobactérias por tomografia computadorizada de alta tensão Cryo-elétron

Este protocolo descreve técnicas utilizadas para determinar as estruturas do canal de íon pela microscopia cryo-elétron, incluindo um sistema de baculovirus usado eficientemente expressar genes em células de mamíferos, com esforço mínimo e toxicidade, extração de proteínas, purificação, e verificação de qualidade, preparação da amostra grade e triagem, bem como coleta de dados e processamento.

Expressão e purificação de TRPC3 os humanos sensíveis lipídico cação canal para determinação estrutural por microscopia de Single-particle Cryo-elétron

Aqui, apresentamos um protocolo descrevendo como i) montar um vetor auto-replicante usando o kit de ferramentas de clonagem modular CyanoGate, ii) introduzir o vetor em um hospedeiro cianobacteriano por conjugação, e iii) caracterizar cepas transgênicas de cianobactérias usando um leitor de placa ou citometria de fluxo.

Modificação genética de cianobactérias por conjugação usando o kit de ferramentas de clonagem modular CyanoGate

A imagem de células bacterianas é uma abordagem de biologia de sistemas emergentes focada na definição de processos estáticos e dinâmicos que ditam a função de grandes máquinas macromoleculares. Aqui, a integração da imagem quantitativa de células vivas e tomografia crio-elétron é usada para estudar a arquitetura e funções do sistema de secreção legionella tipo IV.

Aplicando imagens de células vivas e tomografia crio-elétron para resolver características espaciales do Sistema de Secreção Legionella pneumophila Dot/ICM

Este protocolo descreve o método, materiais, equipamentos e etapas para a preparação de baixo para cima de RNA e proteína susceptíveis de produzir células sintéticas. O compartimento aquoso interno das células sintéticas continha o lisato bacteriano S30 encapsulado dentro de uma bicamada lipídica (ou seja, lipossomos estáveis), utilizando um método de transferência de emulsão de água no óleo.

Preparando proteínas que produzem células sintéticas usando extratos bacterianos livres de células, liposomos e transferência de emulsão

Apresentamos um método simples e acessível para visualização de cianobactérias filamentosas no plano XY. Foi utilizada uma matriz de agarose de baixo ponto de fusão, permitindo a aquisição de imagens das proteínas envolvidas na divisão, na orientação vertical. Portanto, esta metodologia pode ser aplicada a qualquer organismo filamentoso e diferentes tipos de proteínas.

Método de imobilização vertical para análise de microscopia time-lapse em cianobactérias filamentosas

Aprenda transformação natural e análise de motilidade na cianobactéria Phormidium lacuna. Este método permite manipulações genéticas em membros da ordem Oscillatoriales para estudos de biotecnologia.

Transformação Natural, Expressão proteica e Crioconservação da Cicocrias Cianobacterium Phormidium lacuna

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