Fatiando o tronco auditivo de frango embrionário para avaliar gradientes tonotópicos e microcircuitos
12 de julho de 2022
Aqui apresentamos um protocolo para a obtenção de fatias de tronco cerebral auditiva não coronal do embrião de frango para a investigação de propriedades tonotópicas e trajetórias de desenvolvimento dentro de uma fatia de tronco cerebral. Essas fatias incluem seções sagita, horizontal e horizontal/transversal que abrangem regiões tonotópicas maiores dentro de um plano de fatia individual que as seções coronais tradicionais.
Este método adquire fatias vivas do tronco auditivo do frango que engloba um gradiente maior da região de frequência na mesma fatia. Estas fatias são adequadas para experimentos eletrofisiológicos e anatômicos com um eixo tonotópico maior. Essa metodologia ajudará a entender o desenvolvimento de microcircuitos no tronco cerebral auditivo.
Enquanto a anatomia é específica para o frango, outras espécies aviárias como codornas e pássaros têm anatomia semelhante. Para começar, esterilize os ovos com 70% de etanol e incuba-os a 38 graus Celsius e 50% de umidade. Em seguida, defina a taxa de borbulha para o ACSF de tal forma que o pH seja de 7,2 a 7,4 com uma osmolalidade entre 300 e 310 miliósmolares por litro.
Em seguida, misture cinco gramas de agarose em 100 mililitros de dACSF. Dissolva a ágarose completamente usando um banho de água ou micro-ondas até que a agarose comece a borbulhar. Despeje a agarose derretida em uma placa de Petri até uma espessura de cinco milímetros e mantenha em temperatura ambiente para definir.
Após a configuração, sele a placa de Petri e armazene a quatro graus Celsius. Corte a agarose em blocos cúbicos para uso no momento da dissecação. Primeiro, limpe a área de dissecção usando 70% de etanol.
Cole o suporte ou o bloco de agarose em ângulo na bandeja vibratome. Coloque o ovo sob uma luz brilhante e localize o espaço cheio de ar no lado maior ou redondo do ovo, em seguida, quebre a casca sobre o espaço cheio de ar e exponha o saco de membrana. Faça uma incisão suave no saco para expor o bico.
Com um bisturi, puxe suavemente o pescoço e a cabeça para fora do ovo. Após a decapitação, limpe a cabeça com dACSF refrigerado. Mantenha a cabeça firme em dACSF refrigerado e faça uma incisão rostrocaudal.
Inicie a incisão atrás e entre os olhos e siga o comprimento do pescoço colhido. Separe a pele para expor o crânio. Corte o crânio atrás do olho na linha média para a direção lateral.
Repita para ambos os hemisférios. Corte a parte rostral do crânio colocando a lâmina atrás dos olhos e fazendo um corte rápido. Em seguida, mergulhe a cabeça em um prato de dACSF refrigerado.
Usando um par de tesouras pequenas, faça linha média para incisões laterais na região caudal do crânio para separar o cérebro sem causar danos teciduais. Exponha suavemente o tronco cerebral e o cerebelo. Retraia a área dorsal de todo o crânio.
Remova o tronco cerebral e exponha-o por uma escovação leve usando uma escova de tinta fina. Use fórceps curvos para limpar o tronco cerebral da conexão de tecidos e vasos sanguíneos. Separe o tronco cerebral do cerebelo cortando os peduncles e removendo os vasos sanguíneos cuidadosamente.
Corte o tronco cerebral de vasos sanguíneos adicionais. Primeiro, coloque a lâmina vibratome ao longo do eixo horizontal. Para fatias coronais, cole o tronco cerebral em uma bandeja de corte pelo lado rostral, mantendo o eixo rostrocaudal vertical.
Para fatias sagiais, mantenha o eixo medial lateral vertical. Para fatias horizontais, cole o lado ventral mantendo o eixo ventral dorsal vertical. Para alcançar o plano horizontal sagital angular agudo, cole o lado ventral do tronco cerebral de tal forma que o eixo dorsal ventral seja vertical no bloco de agarose da superfície hipotenusa.
Cole a superfície oposta do bloco de agarose de frente para a bandeja de corte e mantenha o eixo rostrocaudal paralelo à borda da lâmina. Como alternativa ao corte de vibratome, mergulhe o tronco cerebral isolado em 4% de baixo ponto de fusão agarose a 40 graus Celsius em uma placa de Petri de 35 por 10 milímetros. Depois que a agarose solidificar, corte o bloco de agarose do cubículo usando uma lâmina afiada.
Cole o bloco de agarose em seu lado rostral mantendo o eixo rostrocaudal do tronco cerebral vertical. Tome fatias coronais até que a região NM seja vista. Remova o bloco de agarose da cola com uma lâmina afiada.
Com uma agulha fina, coloque suavemente 0,5 microliters de corante azul toluidina no NM para detectar os núcleos. Remonte este bloco na bandeja de corte para fatias sagitas ou horizontais. Identifique os núcleos em relação à região manchada e se sectionia o tronco cerebral.
Após a secção, coloque as fatias de 200 a 300 mícrons coletadas sequencialmente em uma câmara fatiada contendo ACSF para equilibrar por uma hora à temperatura ambiente. Seções coronais de tecido cerebral de um embrião de frango E19 a 21 representam as regiões relativas de isofrequência dos núcleos de tronco cerebral auditivos da região auditiva mais baixa à mais alta característica. As diferentes fibras nervosas auditivas e a bifurcação dos axônios NM eram visíveis.
Também foi observado o núcleo angularis. Nas seções rostrais, o núcleo olivary superior está localizado ao longo da região lateral ventral da fatia coronal. Nas seções sagitais, foram identificados NM e núcleo laminaris ou NL onde as fibras nervosas auditivas entraram no aglomerado de neurônios.
O núcleo olivary superior foi identificado na região rostrolateral. Foram vistas regiões auditivas de baixa e alta frequência características de NM e NL ao longo do eixo rostrocaudal. A fatia mais medial mostrou os tufos axonal ipsilaterais e contralaterais e o ponto final da região auditiva.
Nas fatias horizontais, NM e NL foram identificados em direção à linha média, e os neurônios foram espalhados ao longo do eixo medial lateral. Fatias do tecido do tronco cerebral em um ângulo agudo de um plano horizontal mostraram os núcleos auditivos do tronco cerebral através de uma grande propagação diagonal. Imagens ampliadas mostraram o eixo tonotópico dos núcleos auditivos ao longo do rostromedial ao eixo caudolateral.
Certifique-se de que todo o processo seja realizado em dACSF refrigerado ao gelo continuamente borbulhado com oxigênio carb. Este protocolo é usado para pesquisadores que investigam a propriedade anatômica e biofísica do desenvolvimento de microcircuitos do tronco cerebral, especificamente a relação entre os principais núcleos auditivos.
Visão Geral
Este estudo apresenta um protocolo para obtenção de fatias do tronco encefálico auditivo não coronais de embriões de galinha, destinado a investigar propriedades tonotópicas e trajetórias de desenvolvimento. A abordagem permite a análise de regiões tonotópicas maiores dentro de uma única fatia do tronco encefálico em comparação com métodos tradicionais.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biologia do Desenvolvimento
- Elefisiologia
Contexto
- O desenvolvimento do tronco encefálico auditivo é essencial para o processamento de frequências sonoras.
- Os embriões de galinha constituem um modelo adequado devido às suas características anatômicas semelhantes às de outras espécies avianas.
- Os métodos tradicionais de cortes coronais limitam a análise dos padrões tonotópicos.
- Este protocolo tem como objetivo superar essas limitações e aprimorar a compreensão dos microcircuitos.
Objetivo do Estudo
- Fornecer um método confiável para obter fatias que mantenham as características in vivo do tronco encefálico auditivo.
- Facilitar o estudo das trajetórias de desenvolvimento das regiões de processamento auditivo.
- Aprimorar a compreensão das propriedades anatômicas e biofísicas dos circuitos do tronco encefálico auditivo.
Métodos Utilizados
- Aquisição de fatias vivas do tronco encefálico utilizando técnicas de corte com vibrátomo.
- Utilização de embriões de galinha como modelo biológico.
- Algumas etapas incluem esterilização, inclusão em agarose e dissecção cuidadosa dos tecidos do tronco encefálico.
- As fatias de tecido do tronco encefálico são equilibradas em ACSF antes do experimento.
- Foco em núcleos auditivos específicos e sua organização tonotópica em fatias temáticas.
Resultados Principais
- Demonstrou a capacidade de produzir cortes que abrangem múltiplas regiões tonotópicas em um único plano.
- Permitiu a observação de núcleos auditivos críticos, como o núcleo angular e o núcleo olivar superior.
- Destacando a organização das fibras nervosas auditivas e seus papéis na tonotopia.
Conclusões
- Este protocolo permite estudos anatômicos e funcionais detalhados do tronco encefálico auditivo.
- Facilita a compreensão das relações entre diferentes núcleos auditivos e seus processos de desenvolvimento.
- Implicações para pesquisas futuras sobre mecanismos de neurodesenvolvimento em espécies avianas.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A preservação dos gradientes tonotópicos em fatias embrionárias do tronco encefálico auditivo de galinha permite uma avaliação mais abrangente do desenvolvimento de microcircuitos e da organização neuronal específica por frequência. Esta abordagem aumenta a confiança preditiva na validação precoce de alvos neurodesenvolvimentais e apoia a continuidade translacional na pesquisa do sistema auditivo. A capacidade do método de manter gradientes de frequência maiores dentro de um único corte posiciona-o como uma ferramenta valiosa para a redução de riscos mecanicistas em portfólios de P&D com foco em neurobiologia.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Permite a investigação da organização tonotópica e do desenvolvimento de microcircuitos em regiões de frequência mais amplas.
- Apóia a validação funcional de alvos ao preservar a diversidade anatômica e biofísica dentro de cortes individuais.
- Facilita a redução de riscos mecanicistas ao permitir a análise simultânea de múltiplos núcleos auditivos.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Fornece sistemas de tecido validados para ensaios eletrofisiológicos e anatômicos direcionados às vias auditivas.
- Melhora a reprodutibilidade dos ensaios ao padronizar a orientação dos cortes e a cobertura tonotópica.
- Permite a comparação quantitativa de propriedades neuronais ao longo do eixo tonotópico.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Alinha-se com modelos relevantes para a doença no desenvolvimento e funcionamento do sistema auditivo.
- Permite a continuidade desde a descoberta até a validação pré-clínica, mantendo gradientes semelhantes aos in vivo.
- Reduz o risco de translação ao permitir uma análise de microcircuitos mais fisiologicamente relevante.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este protocolo de corte integra-se ao continuum de descoberta a pré-clínico ao permitir estudos mecanicistas precoces, desenvolvimento de ensaios e pesquisas translacionais sobre circuitos do tronco encefálico auditivo.
- Biologia da Descoberta: Apoia testes de hipóteses sobre a organização tonotópica e a maturação de microcircuitos.
- Triagem: Fornece fatias reprodutíveis e que preservam gradientes para ensaios eletrofisiológicos e anatômicos subsequentes.
- Análise: Fornece resultados quantitativos para comparar propriedades neuronais entre regiões de frequência.
- Pesquisa Translacional: Mantém fidelidade ao desenvolvimento e à anatomia para alinhamento com modelos pré-clínicos.
- Reutilização Empresarial: Oferece um protocolo padronizado e adaptável para diversas necessidades de pesquisa neurodesenvolvimental.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva e reduz a ambiguidade na validação de alvos do sistema auditivo.
- Valor Operacional: Aprimora a reprodutibilidade e a padronização do preparo de fatias do tronco encefálico.
- Valor Estratégico: Melhora a qualidade das decisões de prosseguir ou não ao permitir estudos mecanicistas robustos.
- Impacto no Portfólio: Apoia a priorização ajustada ao risco de alvos e modelos neurodesenvolvimentais.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em dissecação embrionária e técnicas de corte com vibrátomo.
- Exige acesso a instrumentação especializada para preparo e análise de tecidos vivos.
- Necessita padronização entre equipes na orientação dos cortes e na identificação do eixo tonotópico.
- Adaptável a outras espécies aviárias com anatomia semelhante no tronco encefálico auditivo.
- Depende da manutenção de condições fisiológicas durante todo o manuseio e corte do tecido.
