Avaliação da Resposta Auditiva do Brainstem em Filhotes de Frango

Usamos técnicas padrão de resposta ao tronco cerebral (ABR) e aplicamos-as a galinhas filhotes, um modelo aviário precoce para função auditiva. O protocolo descreve detalhadamente as técnicas de preparação animal e aquisição da ABR, com etapas que podem se traduzir em outros modelos aviários ou roedores.

Este protocolo combina uma metodologia clinicamente relevante com um modelo de pesquisa animal bem estabelecido. Ele ajudará a responder perguntas sobre desenvolvimento auditivo e refinamento e mudanças funcionais na audição após manipulação genética. Esta técnica não é invasiva, por isso não requer cirurgia e poderia ser combinada com experimentos adicionais.

Além disso, leva apenas cerca de uma hora para se apresentar. Este método pode ser usado em qualquer espécie de pássaro pequeno. Então fisiologia comparativa é relativamente fácil.

O frango ABR também pode avaliar o efeito na audição funcional após manipulação genética. Comece adquirindo ovos de galinha leghorn brancos fertilizados. Em seguida, incubar o ovo a 38 graus Celsius e umidade de 50% por 21 dias antes da data desejada de teste.

Uma vez que o ovo é eclodido, pese o animal colocando-o suavemente em um grande barco de pesagem. Após a injeção de anestesia, coloque o animal de volta na incubadora. Em seguida, verifique se o pescoço está mole e belisque o dedo do animal usando fórceps.

Como próximo passo, determine o sexo do frango usando suas penas de asa. Posteriormente, aplique creme depilatório com um aplicador de ponta de algodão na região da cabeça e pescoço, especialmente perto da abertura da orelha para o pássaro. Agora use 70% de álcool isopropílico para limpar penas, qualquer creme depilatório restante e a pele na cabeça e pescoço.

Além disso, esterilize os eletrodos subdérmicos e a sonda retal usando um lenço de álcool isopropílico de 70%. Coloque o animal em isolamento sonoro e câmara eletricamente blindada, garantindo que o ambiente tenha ruído elétrico e acústico mínimo para as melhores gravações. Use uma almofada de aquecimento para manter a temperatura do corpo animal.

Agora insira a sonda retal e fixe a cabeça do animal no lugar ou descanse o bico contra um objeto para evitar movimentos indesejados. Em seguida, certifique-se de que a câmara de controle de temperatura mantenha a temperatura do animal entre 37 e 41 graus Celsius. Use três eletrodos de aço inoxidável, a agulha de cloreto de prata como referência, eletrodos ativos e comuns.

Coloque cada eletrodo subdermicamente de dois a três milímetros na cabeça, mas não profundo o suficiente para penetrar o crânio, e então cutuque o eletrodo para fora da pele, expondo a ponta. Para gravação de um único canal, coloque o eletrodo ativo acima do crânio na linha média tão caudal quanto o canal auditivo. Coloque o eletrodo de referência atrás da orelha onde o estímulo será entregue, e coloque o eletrodo moído atrás do ouvido contralateral no pescoço.

Agora verifique a impedância do eletrodo. Certifique-se de que a impedância do eletrodo global não exceda cinco quilos. Além disso, mantenha a impedância interelerode abaixo de três quilos.

Para gravação de ABR, dependendo da aquisição de hardware e software, certifique-se de calibrar os níveis de som corretos em todas as frequências de estímulo utilizadas. Agora mova o aparelho transdutor de som em direção ao ouvido ativo do animal e coloque-o em uma profundidade rasa de dois milímetros no canal auditivo. Por fim, verifique o animal durante o teste.

Se os resultados parecerem anormais ou ausentes, reposicione o transdutor de som no canal auditivo. Primeiro, abra o software para adquirir gravações ABR. Defina a rejeição do artefato limites superiores e inferiores para aproximadamente 25 microvolts, de tal forma que animal, movimento ou ruído durante uma varredura excluirá essa varredura da análise.

Colete pelo menos 1024 varreduras para obter uma grande resposta média que pode ser feita em duas gravações de 512 varreduras cada. Isso garante que a resposta seja evocada e repetível. Nas configurações do amplificador do software, ajuste o ganho para 100.000, o filtro de passagem baixa para 3.000 Hertz, e o filtro de passagem alta para 100 Hertz.

Defina a taxa de apresentação de estímulo entre 10 e 20 estímulos por segundo e a duração do tempo do estímulo ao clique para 100 microssegundos. Em seguida, defina a taxa de amostragem para 40 kilohertz, 25 microssegundos para os melhores dados de resolução e definir a polarização de estímulo para alternar. Se gravar 512 varreduras, combine dois testes separados para criar uma média de varredura de 1.024 e continue registrando em intensidades cada vez menores até que o potencial evocado não possa mais ser identificado.

Reduza a intensidade de estímulo por passos de cinco decibéis de nível de pressão sonora para encontrar a menor intensidade de estímulo que provoca uma resposta evocada. Defina o limiar de ABR como a menor intensidade de estímulo que provoca uma resposta detectável evocada. Depois de eutanizar e decapitar o animal e o experimento limpando a almofada de aquecimento, sonda retal e eletrodos de cloreto de prata com álcool isopropílico de 70%, certifique-se de que todos os traços adquiridos foram salvos.

Este número representa o clique ABR. Onda I pico latência aumentada em aproximadamente 0,3 milissegundos para cada 20 decibéis diminuição na intensidade de estímulo. Onda I também apresentei a maior amplitude de pico e a menor variabilidade de pico de latência de todos os picos de forma de onda.

O gráfico mostra o tom de explosão evocado ABR. A melhor resposta foi vista em 1.000 Hertz. A figura demonstra que se a temperatura corporal não for mantida, as funções de intensidade de latência da ABR são altamente variáveis e muitas vezes imprecisas.

O número mostra que os ABRs registrados a partir de filhotes com menos de três horas de idade, rotulados como P1, têm latências de pico significativamente prolongadas e amplitudes de pico reduzidas em comparação com filhotes mais antigos, rotulados como P2. A figura compara 75 traços de nível de pressão sonora de decibéis no mesmo animal com diferentes colocações de eletrodos de referência. A amplitude de pico da onda II para a colocação do mastoide ocorreu um milissegundo após o pico da onda II para a colocação do pescoço. Essa diferença de tempo provavelmente reflete os locais da geração neural ABR em relação à colocação do eletrodo.

As respostas entre as duas orelhas foram semelhantes com pequenas alterações nas amplitudes de pico provavelmente devido ao posicionamento do fone de ouvido. A latência do ouvido esquerdo e direito ser equivalente suporta a função igualmente saudável de ambas as orelhas e hemisférios tronco cerebral no frango filhote. A colocação correta do transdutor de som pode distinguir entre bons e nenhum resultado.

O frango ABR deve ser robusto com uma boa relação sinal-ruído. Todas as questões abordadas pelos estudos da ABR em outras espécies aviárias podem ser aplicadas ao frango. Além disso, pesquisas de fisiologia molecular em frango embrionário podem incorporar essa metodologia in vivo.