Name: Culturas Primárias de Astrócitos de Rato e Microglia e Seu Uso no Estudo da Esclerose Lateral Amiotrófica (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-23T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 36 s
Description: Aprenda a preparar culturas primárias de astrócitos e microglia de rato para estudar sinalização de cálcio intracelular na esclerose lateral amiotrófica. Este método permite análise detalhada do comportamento celular em condições neuroinflamatórias.

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Este trabalho foi apoiado pelo Ministério da Educação, Contrato de Ciência e Desenvolvimento Tecnológico da República da Sérvia nº 451-03-9/2021-14 / 200178, o projeto FENS - NENS Education and Training Cluster "Trilateral Course on Glia in Neuroinflammation" e o EC H2020 MSCA RISE grant #778405. Agradecemos a Marija Adžić e Mina Perić por fornecerem as imagens imuno-histoquímicas e a Danijela Bataveljić por ajudarem com a escrita em papel.

Todos os experimentos foram realizados de acordo com as diretivas da UE sobre a proteção de animais para fins científicos e com permissão da Comissão de Ética da Faculdade de Biologia da Universidade de Belgrado (número de aprovação EK-BF-2016/08). Em relação ao material do paciente (soros para IgGs), este foi coletado para exame clínico de rotina com o consentimento informado do paciente, de acordo com o Código de Ética da Associação Médica Mundial (Declaração de Helsinque) para experimentos envolvendo seres humanos. O protocolo foi aprovado pelo Comitê de Ética do Centro Clínico da Sérvia (No. 850/6).
1. Preparação da cultura celular primária
<ol><li>Isolamento do tecido cerebral NOTA: O isolamento deve ser realizado em gelo, utilizando soluções geladas.<ol><li>Utilizar filhotes recém-nascidos de 1 a 3 dias de idade para cultura primária de células neonatais33. NOTA: Para o estudo aqui apresentado, foram utilizados ratos Sprague Dawley hSOD1G93A e não transgênicos. Para genotipagem, caudas de ratos foram usadas para posterior extração de DNA e PCR.</li>
		<li>Polvilhe a cabeça do filhote com etanol a 70% e imediatamente decapite-o rapidamente usando uma tesoura.</li>
		<li>Abra a pele usando uma tesoura de ângulo pequeno para expor o crânio. Abra o crânio fazendo um corte do forame magno em direção às órbitas. Em seguida, faça um corte perpendicular da linha média. Remova o cérebro do crânio e coloque-o em uma placa de Petri contendo solução salina tamponada com fosfato (PBS). NOTA: Limpe as ferramentas entre filhotes para evitar a contaminação cruzada entre filhotes transgênicos e não transgênicos. O isolamento dos córtices do resto do cérebro deve ser feito sob um estereomicroscópio.</li>
		<li>Usando a ponta do fórceps, rasgue as conexões entre os dois hemisférios. Em seguida, separe os hemisférios com pinças curvas empurrando suavemente um hemisfério do centro para o lado.</li>
		<li>Remova as meninges rasgando-as cuidadosamente com pinças retas e curvas.</li>
		<li>Remova o hipocampo apertando-o com uma pinça curva. Descarte o hipocampo ou use-o para outra preparação de cultura de células. NOTA: Outras etapas devem ser executadas sob o exaustor de fluxo laminar para garantir condições estéreis.</li>
	</ol></li>
	<li>Homogeneização e dissociação tecidual<ol><li>Transfira um córtex para um tubo de 15 mL preenchido com 3 mL de PBS frio. Pipete a suspensão para cima e para baixo com uma ponta de 1 mL, completando 10-15 cursos até que a suspensão se torne homogênea. NOTA: Seja muito cauteloso para não produzir bolhas neste processo.</li>
		<li>Centrífuga a 500 × g durante 5 min. Remova o sobrenadante e ressuspenda o pellet em 3 mL de PBS frio, pipetando-o para cima e para baixo com uma ponta de 1 mL. Repita a etapa de centrifugação. NOTA: Todas as soluções utilizadas a partir deste ponto devem ser pré-aquecidas a 37 °C.</li>
		<li>Descarte o sobrenadante e ressuscite o pellet em 2 mL de Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) completo suplementado com soro fetal bovino (FBS) a 10% e antibióticos (penicilina e estreptomicina). Transfira o homogeneizado para um tubo de 2 mL.</li>
		<li>Passe o homogeneizado através de agulhas de 21 G e 23 G (três vezes cada) para fazer uma suspensão de células únicas. NOTA: Seja muito cauteloso para não produzir bolhas neste processo.</li>
	</ol></li>
	<li>Despeje a suspensão celular preparada a partir de um córtex em uma placa de Petri de 60 mm de diâmetro ou em um frasco T25 (com a superfície pré-tratada com um revestimento polipeptídico para o crescimento de células aderentes) contendo 3 mL de DMEM completo. Agite levemente a placa de Petri para que a suspensão seja uniformemente distribuída.</li>
	<li>Cultivar as células na incubadora em uma atmosfera umidificada de 5% de CO2/95% de ar a 37 °C.</li>
	<li>Troque o meio 48 h após o isolamento e substitua o meio a cada 3 dias.</li>
	<li>Para promover o crescimento de astrócitos, quando as células atingirem 70% a 80% de confluência, lave-as com PBS pré-aquecido para remover as células gliais frouxamente ligadas e os vestígios de FBS no meio.<ol><li>Tripsinize a camada subjacente de astrócitos adicionando 1 mL de solução de tripsina pré-aquecida (tripsina a 0,25%, EDTA a 0,02% em PBS, filtrada estéril).</li>
		<li>Coloque o prato na incubadora a 37 °C durante 2-5 min.</li>
		<li>Verifique as células sob o microscópio. Quando começarem a se desprender, adicione 4 mL de DMEM completo.</li>
		<li>Recolher a suspensão celular e transferi-la para um tubo de 15 ml. Centrífuga a 500 × g durante 5 min.</li>
		<li>Descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet em 1 mL de meio completo. Conte as células usando um hemocitômetro.</li>
		<li>Replacar as células a uma densidade de 104 células/cm2 em 5 mL de DMEM completo fresco.</li>
	</ol></li>
	<li>Mude o meio a cada 3 dias. Para minimizar a presença de outros tipos de células gliais, após os astrócitos atingirem 50% de confluência e antes de cada meio de substituição, lavar as células com DMEM completo.<ol><li>Aspirar o meio sobrenadante com uma pipeta de 1 ml e dispensá-lo suavemente sobre a camada de células várias vezes. Certifique-se de que toda a superfície da camada celular esteja coberta durante esta etapa de lavagem.</li>
	</ol></li>
	<li>Quando as células atingirem 80% de confluência (geralmente após 14 dias), repita a tripsinização e a coleta de astrócitos, conforme descrito na etapa 1.6.</li>
	<li>A semente 5 × 103 de astrócitos em uma tampa de vidro circular de 7 mm revestida com poli-L-lisina (50 μg/mL). Use-os em experimentos após 48 h.</li>
	<li>Para promover a micróglia, após o passo 1.7, permita que as células gliais atinjam uma camada confluente34. Quando as células microgliais aparecerem no topo da camada de astrócitos (após 10-15 dias, reconhecidos por seus corpos menores, mais ovais e processos mais curtos), agite a placa de Petri em um agitador orbital por 2 h a 220 rpm.</li>
	<li>Dispersão e semeadura de células microgliais<ol><li>Lave levemente as células separadas e frouxamente presas aspirando o meio sobrenadante com uma ponta de pipeta de 1 mL e distribua-o suavemente na camada de células várias vezes. Certifique-se de cobrir toda a superfície da camada celular durante esta etapa de lavagem, coletar o meio com as células separadas e transferi-lo para um tubo de 15 mL.</li>
		<li>Centrífuga a 500 × g durante 5 min. Descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet em 1 mL de meio.</li>
		<li>Passe a suspensão celular através de uma agulha 21 G para obter uma suspensão de célula única. NOTA: A maioria dos métodos publicados usa tripsina ou papaína para dissociar o tecido; no entanto, as agulhas 21 G têm a vantagem de prevenir a superdigestão das células, permitindo uma dissociação mais suave.</li>
		<li>Conte as células usando um hemocitômetro. A semente 5 × 103 células microgliais em uma tampa de vidro circular de 7 mm revestida com poli-L-lisina (50 μg/mL). Use-os em experimentos após 48 h. NOTA: É difícil obter uma cultura microglial pura por agitação, uma vez que as células precursoras de oligodendrócitos e astrócitos ainda podem estar presentes em um número variável, dependendo da experiência do experimentador. O protocolo imunocitoquímico utilizado para estimar a presença de diferentes populações celulares em culturas gliais foi descrito em outros artigos35.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Imunocitoquímica
<ol><li>Enxaguar as células revestidas em folhas de cobertura em PBS, 2 x 1 min.</li>
	<li>Fixar as células em paraformaldeído a 4% durante 20 min à temperatura ambiente (RT).</li>
	<li>Lave em PBS 3 x 5 min.</li>
	<li>Incubar em solução bloqueadora contendo 10% de soro de burro normal (NDS)/1% de albumina sérica bovina (BSA)/Triton X-100 a 0,1% por 45 min no RT.<ol><li>Adicionar 50 μL de uma solução de bloqueio por deslizamento de cobertura de 10 mm de diâmetro.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparar anticorpos primários em 1% NDS/1% BSA/0,1% TritonX-100 nas seguintes diluições: camundongo anti-GFAP 1:300, cabra anti-Iba1 1:500. Incubar as células com anticorpos primários durante a noite a +4 °C.</li>
	<li>Enxaguar em PBS, 3 x 10 min.</li>
	<li>Incubar com os anticorpos secundários conjugados com um fluoróforo: burro anti-rato (excitação 488 nm [1:200)) ou burro anti-cabra (excitado a 647 nm [1:200)). Incubar as células por 2 h no RT no escuro.</li>
	<li>Lave em PBS, 7 x 5 min.</li>
	<li>Incubar as células com 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI, 1:4.000) por 10 min no RT.</li>
	<li>Lave em PBS 5 x 5 min.</li>
	<li>Monte as tampas em lâminas de microscópio usando uma solução de montagem; use uma gota dele por tampa. NOTA: As diluições de anticorpos podem variar dependendo do produtor. Os usuários devem determinar diluições ideais para seus experimentos.</li>
</ol>3. Imagem de vídeo de lapso de tempo
NOTA: As soluções que contêm o corante fluorescente devem ser protegidas da luz direta. Antes de iniciar o experimento de imagem, certifique-se de que a tampa de vidro não se mova ao ligar a perfusão.
<ol><li>Preparação de soluções e células<ol><li>Prepare solução extracelular (ECS) para imagens: 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCal 2, 2 mM MgCl2, 10 mM D-glicose e 10 mM HEPES. Ajuste o pH para 7,4. Certifique-se de que a osmolaridade seja de 280-300 mOsm/kg e prepare ECS sem Ca2+: 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM MgCl2, 10 mM D-glicose, 10 mM HEPES e 0,1 mM EGTA.</li>
		<li>Preparar as soluções de teste: 100 μM de ATP dissolvido em ECS, 1 μM de Thg em ECS sem Ca2+ e 0,1 mg/mL de ALS IgG em ECS8.</li>
		<li>Transfira uma tampa para um prato com ECS para lavar o DMEM completo. Preparar a solução de carga de corante diluindo a solução-mãe de 1 mM de Fluo-4 AM com ECS até à concentração final de 5 μM de Fluo-4 AM.<ol><li>Coloque a tampa com células na solução de carregamento do corante por 30 minutos a RT no escuro. Lave as células em ECS por 20 min.</li>
		</ol></li>
		<li>Se as células não estiverem adequadamente carregadas (ou seja, se o nível basal de fluorescência for muito baixo <5% da faixa dinâmica da câmera com tempo de exposição superior a 400 ms), aumente o tempo de carregamento para até 45 min a 1 h a 37 °C. Alternativamente, misture a solução-mãe de Fluo-4 AM com um volume igual de 20% (p/v) de detergente (Pluronic) em DMSO antes de diluir em ECS, tornando a concentração Plurônica final ~0,02%. NOTA: Os exemplos experimentais deste estudo foram realizados com IgG humana isolada dos soros sanguíneos de pacientes com ELA, conforme descrito anteriormente 4,5,11. Cada experimento foi realizado com amostras de IgG de um único paciente.</li>
	</ol></li>
	<li>Imagem de vídeo NOTA: Neste protocolo, o Video Imaging System foi combinado com uma lâmpada de arco curto de xenônio, um sistema policromador e um microscópio de epifluorescência invertida equipado com metaiscina de imersão em água, glicerina e óleo. A imagem de timelapse foi realizada por meio de um Sistema de Câmera Digital.<ol><li>Ligue os componentes da configuração de imagem 15 minutos antes do experimento para permitir que o sistema atinja a temperatura de trabalho.</li>
		<li>Coloque a folha de cobertura na câmara de registo com 1 ml de solução de trabalho (ECS ou ECS sem Ca2+).</li>
		<li>Para escolher o protocolo de imagem correto, abra o software de imagem e, no painel Aquisição , escolha os pares de filtros para Fluo4-AM com um comprimento de onda de excitação a 480 nm, um espelho dicroico a 505 nm e um comprimento de onda de emissão a 535 nm.</li>
		<li>Escolha o campo de visão tomando cuidado para ter um número consistente de células ao longo do experimento. Ajuste o tempo de exposição e o ganho do detector adequadamente, de modo que o sinal não esteja saturado. Escolha o modo de pseudocor para aquisição. Para obter instruções mais detalhadas, consulte o manual fornecido pelo fabricante.</li>
		<li>Ajuste a taxa de amostragem para 1 Hz (1 quadro por segundo).</li>
		<li>Inicie a imagem adquirindo o nível basal de fluorescência por 3-5 min para a determinação basal (F0). Garantir um fluxo constante da solução de trabalho.</li>
		<li>Pare o fluxo da solução de trabalho e alterne para a solução de teste pelo período de tempo desejado (consulte também as barras de tempo nos exemplos da Figura 2 e da Figura 3). Entre cada solução de teste, lave as células com um fluxo constante da solução de trabalho por 3-5 min.</li>
		<li>Manter o volume da solução na câmara de registo a ~1 ml, organizando uma sucção constante a partir da parte superior da solução (ver Figura 2E). NOTA: Para aplicar o tratamento diretamente nas células fotografadas, um sistema de entrega personalizado feito de uma pipeta de vidro (0,8 mm de diâmetro interno) foi posicionado a ~350 μm de distância e ~1 mm acima das células, em um ângulo de 45° combinado com o sistema de troca de solução contendo válvulas de pinça e um controlador eletrônico de válvulas (ver Figura 2E).</li>
	</ol></li>
</ol>4. Análise dos dados
<ol><li>Defina uma região de interesse (ROI) que corresponda à célula individual.<ol><li>Escolha o quadro com a maior intensidade de sinal (ou seja, a partir da aplicação de ATP) e cerque uma célula usando a ferramenta poligonal do aplicativo. Repita para todas as células no campo adquirido. Escolha cinco ROIs em segundo plano usando a Ferramenta Círculo.</li>
		<li>Para medir a intensidade média do sinal de uma única célula e o plano de fundo para cada período de tempo, selecione todos os ROIs e use o comando Multi Measure no ROI Manager no ImageJ ou qualquer comando equivalente em software comercial (consulte a Tabela de Materiais).</li>
	</ol></li>
	<li>Exporte os valores médios de intensidade de sinal dos ROIs como uma planilha.</li>
	<li>Média de cinco ROIs de fundo e subtraia o fundo médio de cada quadro da intensidade média do ROI do quadro adquirido ao mesmo tempo.</li>
	<li>Para normalizar os dados obtidos para o sinal de linha de base, use a equação (1): ΔF/F 0 = (F - F 0)/F0 (1) onde F é a intensidade do sinal de cada período de tempo após a subtração de fundo, e F0 é a fluorescência Fluo-4 basal. NOTA: Um código personalizado foi utilizado neste estudo.</li>
	<li>Para analisar a atividade do cálcio, determine vários parâmetros4: a amplitude do pico de cálcio (ΔF/F 0), a mudança integrada (integral de tempo, superfície sob o registro da resposta) do transiente de cálcio (ΔF/F 0 × s), o tempo decorrido do início do pico desde o início da estimulação até o máximo do(s) transiente(s) de cálcio, o tempo-tempo de elevação decorrido desde o início da estimulação até o valor de ΔF/F 0 que atinge 50%-80% da(s) amplitude(s) máxima(s), meia-largura-largura total de um transitório a meia-amplitude máxima(s), frequência de respostas se forem repetitivas (Hz).</li>
</ol>

Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.

Este trabalho apresenta o método de cultura celular primária como uma ferramenta rápida e "dentro do orçamento" para o estudo de diferentes aspectos da fisiologia celular (pato), como a ELA, no modelo hSOD1G93A de ratos. A técnica é, portanto, adequada para estudos no nível de célula única que podem ser extrapolados e investigados em um nível mais alto de organização (ou seja, em fatias de tecido ou em um animal vivo). A cultura celular como técnica, no entanto, tem algumas ressalvas. É mais importante fazer o...

As técnicas de cultura de células deram origem a inúmeros avanços em diversos campos da neurofisiologia celular na saúde e na doença. Particularmente, as culturas de células primárias, recém-isoladas do tecido neuronal de um animal de laboratório, permitem que o experimentador estude de perto o comportamento de diversas células em diferentes meios bioquímicos e configurações fisiológicas. O uso de diferentes indicadores fisiológicos fluorescentes, como os corantes sensíveis ao Ca2+, em combinação com a microscopia de vídeo de lapso de tempo, fornece uma melhor visão dos processos biofísicos e bioquímicos celulares em tempo real.
A ELA é uma doença neurodegenerativa devastadora que afeta os neurônios motores superiores e inferiores1. A doença tem uma patogênese complexa do tipo familiar, mas principalmente da forma esporádica (90% dos casos)2. Sabe-se que mecanismos autônomos não celulares contribuem para a fisiopatologia da ELA, principalmente devido ao papel essencial das células gliais3. A ELA também é bem caracterizada como uma doença neuroinflamatória com envolvimento de fatores humorais e celulares de inflamação.
A imunoglobulina G é amplamente utilizada como marcador molecular na ELA e em outras doenças neurodegenerativas. Estudar o nível sérico desse marcador pode indicar a presença e o estágio da neuroinflamação na doença 4,5,6, enquanto sua presença no líquido cefalorraquidiano pode indicar uma violação da barreira hematoencefálica 7. IgGs também foram identificadas como depósitos nos neurônios motores da medula espinhal de pacientes com ELA7. No entanto, essa abordagem tem mostrado algumas inconsistências na correlação do nível de IgGs com o estágio e as características da doença6.
A IgG isolada dos soros de pacientes com ELA (ALS IgG) pode induzir uma resposta de cálcio em astrócitos ingênuos8 e liberação de glutamato em neurônios, apontando para um efeito excitotóxico - uma característica da patologia da ELA9. No entanto, estudos sobre o modelo de camundongo HSA hSOD1G93A (contendo múltiplas cópias da mutação humanaSOD1 10) mostraram uma série de marcadores de estresse oxidativo em células neurogliais cultivadas 11, tecidos 12,13,14 ou animais vivos 13. Ressalta-se que os astrócitos cultivados a partir do modelo de ratos com ELA foram mais propensos ao estresse oxidativo induzido pelo peróxido do que a astroglia de companheiros de ninhada não transgênicos11.
As células microgliais em cultura são afetadas pela ELA IgG de forma menos aparente. Ou seja, uma linhagem celular microglial BV-2 apresentou um aumento no sinal de marcadores fluorescentes de estresse oxidativo em resposta à aplicação de apenas 4/11 amostras de pacientes com ELA IgG15. Sabe-se que a micróglia participa de muitas patologias neuroinflamatórias, aumentando o estresse oxidativo e a fase de progressão tardia no mecanismo autônomo não celular da ELA16,17. No entanto, os dados com IgGs da ELA indicaram que essas células podem não ser tão reativas quanto os astrócitos a esses fatores humorais da inflamação da ELA. Vários estudos têm sido realizados com astrócitos primários de modelos murinos de ELA, não apenas em filhotes, mas também em animais sintomáticos, seja no cérebro ou na medula espinhal 18,19,20,21. Isso também é verdade para culturas primárias microgliais, embora em menor grau do que os astrócitos e principalmente de regiões cerebrais no estágio embrionário22,23,24.
Usamos imagens de vídeo de lapso de tempo de Ca2+ em células em cultura principalmente como um meio de seguir os transientes intracelulares deste íon como um marcador fisiológico de excitotoxicidade. Assim, pela caracterização biofísica desses transientes (amplitude, área sob transiente, tempo de subida, frequência) o pesquisador pode obter parâmetros diagnósticos experimentais a partir de diversos modelos celulares de neurodegeneração. Esta técnica oferece, portanto, uma vantagem de uma avaliação fisiológica quantitativa de IgGs como biomarcadores da doença. Há um grande corpo de literatura sobre o papel das IgGs e Ca2+ na indução da ELA. A maioria desses estudos foi realizada induzindo ELA injetando IgGs de pacientes em animais experimentais 25,26,27,28,29, que então mostraram elevação intracelular de Ca 2+ e deposições de IgG. Uma linha de estudos explorou o efeito da ELA IgGs na sinapse motora in vitro30,31,32. No contexto acima, a técnica aqui apresentada coloca o foco nas células gliais como atores importantes no mecanismo autônomo não celular da ELA e quantifica sua potencial resposta excitotóxica às IgGs como fatores humorais da neuroinflamação. Essa abordagem pode ter uma aplicação mais ampla no teste de outros fatores humorais como soros inteiros, LCR ou citocinas em diferentes sistemas de cultura celular e em modelos celulares de inflamação geral.
Este artigo descreve como preparar culturas primárias de células gliais, astrócitos e micróglia a partir dos córtices de ratos Sprague Dawley e como usar essas células para estudar a fisiopatologia da ELA com IgG derivada de soros de pacientes. Os protocolos são detalhados para o carregamento de corante de células cultivadas (Figura 1) e as gravações de alterações de Ca2+ em experimentos de imagem de vídeo de lapso de tempo. Exemplos de gravações de vídeo mostrarão como as células gliais reagem à ALS IgG em comparação com o ATP, este último ativando os receptores de membrana purinérgicos. Mostrado pela primeira vez é um exemplo de como os astrócitos isolados do cérebro de ratos hSOD1G93A ALS reagem com uma resposta mais pronunciada de Ca 2+ à ALS IgG em comparação com controles não transgênicos e como relacionar esse processo com as diferenças na operação de armazenamento de Ca2+. Também é mostrado um exemplo de imagem de cálcio em células microgliais agudamente desafiadas com ALS IgG, com apenas uma resposta modesta de cálcio intracelular.

<table><tbody><tr><td>Tubo de 15 mL</td><td>Sarstedt, Alemanha</td><td>62 554 502</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de 2 mL</td><td>Sarstedt, Alemanha</td><td>72.691</td><td></td></tr><tr><td>Agulha de 21 G</td><td>Nipro, Japão</td><td>HN-2138-ET</td><td></td></tr><tr><td>Agulha de 23 G</td><td>Nipro, Japão</td><td>HN-2338-ET</td><td></td></tr><tr><td>Seringa de 5 mL</td><td>Nipro, Japão</td><td>SY3-5SC-EC</td><td></td></tr><tr><td>Lamínula de vidro circular de 6 mm</td><td>Menzel Glasser, Alemanha</td><td>630-2113</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Petri de 60 mm</td><td>ThermoFisher Sientific, EUA</td><td>130181</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma-Aldrich, Alemanha</td><td>A9062</td><td></td></tr><tr><td>AxioObserver A1</td><td>Carl Zeiss, Alemanha</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino</td><td>Sigma-Aldrich, Alemanha</td><td>B6917</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de cálcio</td><td>Sigma-Aldrich, Alemanha</td><td>2110</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>Eppendorf, Alemanha</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich, Alemanha</td><td>10236276001</td><td></td></tr><tr><td>D-glicose</td><td>Sigma-Aldrich, Alemanha</td><td>158968</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Sigma-Aldrich, Alemanha</td><td>D5648</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-burro AlexaFluor 647 IgG anticorpo</td><td>Invitrogen, EUA</td><td>A-21447</td><td></td></tr><tr><td>Rato anti-burro AlexaFluor 488 IgG anticorpo</td><td>Invitrogen, EUA</td><td>A-21202</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich, Alemanha</td><td>EDS-100G</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich, Alemanha</td><td>E4378</td><td></td></tr><tr><td>" evolve"-EM 512 Sistema de Câmera Digital</td><td>Fotometria, EUA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Soro fetal bovino (FBS)</td><td>Gibco, ThermoFisher Scientific, EUA</td><td>10500064</td><td></td></tr><tr><td>Fiji Software</td><td>ImageJ Código aberto sob a Licença</td><td></td><td></td>Pública Geral GNU</tr><tr><td>Conjunto de filtros FITC</td><td>Chroma Technology Inc., EUA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sondas Moleculares Fluo-4 AM</td><td>, EUA</td><td>F14201</td><td></td></tr><tr><td>Cabra anti-IBA1</td><td>Fujifilm Wako Chemicals, EUA</td><td>011-27991</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Biowest, França</td><td>P5455</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de troca de soluções de alta velocidade</td><td>ALA Scientific Instruments, EUA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Incubadora</td><td>Memmert GmbH + Co. KG, Alemanha</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de magnésio</td><td>Sigma-Aldrich, Alemanha</td><td>M2393</td><td></td></tr><tr><td>Software Matlab</td><td>Math Works, EUA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mouse anti-GFAP</td><td>Merck Millipore, EUA</td><td>MAB360</td><td></td></tr><tr><td>Mowiol 40-88</td><td>Sigma-Aldrich, Alemanha</td><td>324590</td><td></td></tr><tr><td>Soro de burro normal</td><td>Sigma-Aldrich, Alemanha</td><td>D9663</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeído</td><td>Sigma-Aldrich, Alemanha</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina e Estreptomicina</td><td>ThermoFisher Sientific, EUA</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Poli-L-lisina</td><td>Sigma-Aldrich, Alemanha</td><td>P5899</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de potássio</td><td>Sigma-Aldrich, Alemanha</td><td>P5405</td><td></td></tr><tr><td>Di-hidrogenofosfato de potássio</td><td>Carlo Erba Reagents, Espanha</td><td></td> 471686 <td></td></tr><tr><td>Shaker DELFIA PlateShake</td><td>PerkinElmer Life Sciencies, EUA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato de sódio</td><td>Sigma-Aldrich, Alemanha</td><td>S3817</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de sódio</td><td>Sigma-Aldrich, Alemanha</td><td>S5886</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de sódio dibásico heptahidratado</td><td>Carl ROTH GmbH</td><td>X987.2</td><td></td></tr><tr><td>Piruvato de sódio</td><td>Sigma-Aldrich, Alemanha</td><td>P5280</td><td></td></tr><tr><td>Thapsigargine</td><td>Tocris Bioscience, Reino Unido</td><td>1138</td><td></td></tr><tr><td>Triton X - 100</td><td>Sigma-Aldrich, Alemanha</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>Sigma-Aldrich, Alemanha</td><td>T4799</td><td></td></tr><tr><td>Osmômetro de pressão de vapor Vapro 5520</td><td>Wescor, ELITechGroup Inc., EUA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ViiFluor Imaging System</td><td>Visitron System Gmbh, Alemanha</td><td></td><td></td></tr><tr><td>VisiChrome Polychromator System</td><td>Visitron System Gmbh, Alemanha</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Configuração de alto desempenho VisiView</td><td>Visitron System Gmbh, Alemanha</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lâmpada de arco curto de xenônio</td><td>Ushio, Japão</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

culturas primárias de astrócitos de rato e microglia e seu uso no estudo da esclerose lateral amiotrófica

Primary Cultures of Rat Astrocytes and Microglia and Their Use in the Study of Amyotrophic Lateral Sclerosis

Este protocolo demonstra como preparar culturas primárias de células gliais, astrócitos e micróglia a partir dos córtices de ratos Sprague Dawley e como usar essas células com a finalidade de estudar a fisiopatologia da esclerose lateral amiotrófica (ELA) no modelo hSOD1G93A de ratos. Primeiro, o protocolo mostra como isolar e cultivar astrócitos e micróglias de córtices de ratos pós-natais e, em seguida, como caracterizar e testar a pureza dessas culturas por imunocitoquímica usando o marcador de proteína ácida fibrilar glial (GFAP) de astrócitos e o marcador microglial da molécula adaptadora de ligação ao cálcio ionizado 1 (Iba1). Na próxima etapa, são descritos métodos para o carregamento de corantes (Fluo 4-AM sensível ao cálcio) de células cultivadas e as gravações de alterações de Ca2+ em experimentos de imagem de vídeo em células vivas.
Os exemplos de gravações de vídeo consistem em: (1) casos de imagem de Ca2+ de astrócitos cultivados agudamente expostos à imunoglobulina G (IgG) isolados de pacientes com ELA, mostrando uma resposta característica e específica em comparação com a resposta ao ATP, conforme demonstrado no mesmo experimento. Exemplos também mostram um aumento transitório mais pronunciado na concentração intracelular de cálcio evocada pela ELA IgG em astrócitos hSOD1G93A em comparação com controles não transgênicos; (2) Imagem Ca 2+ de astrócitos cultivados durante uma depleção dos estoques de cálcio pela thapsigargina (Thg), um inibidor não competitivo do retículo endoplasmático Ca 2+ ATPase, seguido pela entrada de cálcio operada em armazém provocada pela adição de cálcio na solução de registro, o que demonstra a diferença entre a operação de armazenamento de Ca2+ em hSOD1G93A e em astrócitos não transgênicos; (3) Imagens de Ca 2+ da micróglia cultivada mostraram predominantemente uma falta de resposta à IgG da ELA, enquanto a aplicação de ATP provocou uma alteração de Ca2+. Este artigo também enfatiza possíveis ressalvas e advertências em relação à densidade celular crítica e pureza das culturas, escolhendo a concentração correta do corante Ca2+ e das técnicas de carregamento de corantes.

Caracterização de diferentes tipos de células gliais em cultura Geralmente leva de 15 a 21 dias para produzir astrócitos para experimentos, enquanto as células microgliais levam de 10 a 15 dias para crescer. A imunocoloração foi realizada para avaliar a pureza celular da cultura. A Figura 1 mostra a expressão da dupla marcação do marcador astrocítico GFAP e do marcador microglial Iba1 nas respectivas culturas.
Sabe-se que a imagem de cálcio rev...

Apresentamos aqui um protocolo sobre como preparar culturas primárias de células gliais, astrócitos e micróglias de córtices de ratos para imagens de vídeo de lapso de tempo de Ca2+ intracelular para pesquisa sobre fisiopatologia da esclerose lateral amiotrófica no modelo de rato hSOD1G93A .

Culturas Primárias de Astrócitos de Rato e Microglia e Seu Uso no Estudo da Esclerose Lateral Amiotrófica

This protocol demonstrates how to prepare primary cultures of glial cells, astrocytes, and microglia from the cortices of Sprague Dawley rats and how to ...

Este protocolo permite revelar o padrão de sinalização intercelular de cálcio que caracteriza cada resposta do tipo celular na saúde, bem como na doença. Esta técnica permite a caracterização biofísica rápida e detalhada do comportamento celular complexo. Planejamos usar essa sinalização de cálcio induzida por IgG como uma impressão digital para a medicina personalizada de doenças neuroinflamatórias.No cenário da vida real, não é fácil ver e acompanhar todos os processos e eventos, especialmente aqueles que acontecem sob o microscópio. Por isso, os dados visuais são importantes. Depois de decapitar filhotes de um a três dias de idade, exponha o crânio cortando a pele usando pequenas tesouras angulares.Em seguida, abra o crânio cortando o forame magno em direção às órbitas e faça um corte perpendicular da linha média. Remova o cérebro do crânio e coloque-o em uma placa de Petri contendo PBS. Use a ponta da pinça para rasgar as conexões entre os dois hemisférios e separe os hemisférios com pinças curvas empurrando suavemente um hemisfério do centro para o lado.Use pinças retas e curvas para remover as meninges, rasgando-as cuidadosamente. Em seguida, remova o hipocampo, beliscando-o com pinça curva e descarte, ou use-o para outra preparação de cultura de células. Em seguida, transfira o córtex para um tubo de 15 mililitros contendo três mililitros de PBS frio e homogeneize o tecido pipetando para cima e para baixo 10 a 15 vezes com uma ponta de um mililitro.Centrifugar as células a 500 g durante cinco minutos. Descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet em três mililitros de PBS frio pipetando com uma ponta de um mililitro. Centrifugar mais uma vez e ressuspender o pellet em dois mililitros de DMEM completo suplementado com 10% FBS e antibióticos.Depois de transferir o homogeneizado para um tubo de dois mililitros, passe o homogeneizado através de agulhas de calibre 21 e 23 para fazer uma suspensão de células únicas. Despeje a suspensão celular preparada a partir de um córtex em uma placa de Petri de 60 milímetros contendo três mililitros de DMEM completo e agite levemente a placa de Petri, de modo que a suspensão seja uniformemente distribuída. Incubar as células em uma incubadora umidificada com 5% de dióxido de carbono e 95% de ar a 37 graus Celsius.Para promover o crescimento de astrócitos, remova o meio antigo e lave a célula com PBS pré-aquecido para remover as células gliais frouxamente ligadas e os vestígios de FBS uma vez que atinjam 70 a 80% de confluência. Em seguida, tripsnize a camada subjacente de astrócitos adicionando um mililitro de solução de tripsina pré-aquecida e incube a 37 graus Celsius por dois a cinco minutos. Use um microscópio para verificar se as células começam a se desprender e adicione quatro mililitros de DMEM completo.Colete a suspensão celular e transfira-a para um tubo de 15 mililitros. Em seguida, centrifugar o tubo a 500 g durante cinco minutos. Descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet em um mililitro de meio completo.Conte as células usando um hemocitômetro. Em seguida, prepare o prato de cultura e adicione o meio de cultura. Reemplacar as células a uma densidade de 10 a quartas células por centímetro quadrado em cinco mililitros de DMEM completo fresco e lavar as células com DMEM completo antes de cada substituição do meio.Depois de atingir 70 a 80% de confluência, repita a tripsinização e semeie cinco vezes 10 aos terceiros astrócitos em uma cobertura de vidro circular revestida de poli-Llisina de sete milímetros. Deixe-os anexar por 10 minutos e adicione DMEM completo. Use-os em experimentos após 48 horas.Depois de preparar as culturas microgliais, para promover a micróglia, permita que as células gliais se tornem confluentes e a micróglia aparecerá no topo da camada de astrócitos após 10 a 15 dias. Agite a placa de Petri em um agitador orbital por duas horas a 220 RPM. Agora, lave levemente as células separadas e frouxamente presas, aspirando o sobrenadante com uma ponta de pipeta de um mililitro.Dispense suavemente o sobrenadante na camada de células várias vezes, garantindo cobrir toda a superfície da camada celular durante esta etapa de lavagem. Colete o meio com as células separadas e transfira-o para um tubo de 15 mililitros. Centrifugar, ressuspender e contar as células conforme demonstrado anteriormente.Semeie cinco vezes 10 até a terceira micróglia em uma tampa de vidro circular revestida de poli-L-lisina de sete milímetros. Deixe-os anexar por 10 minutos e adicione DMEM completo. Use-os em experimentos após 48 horas.Para lavar o DMEM completo, transfira uma folha de cobertura para um prato com solução extracelular. Preparar a solução de carregamento de corante diluindo um milimolar Fluo-4 AM com solução extracelular para atingir a concentração final de cinco micromolares. Coloque a tampa deslizante com células na solução de carregamento do corante por 30 minutos à temperatura ambiente no escuro e lave as células em solução extracelular por 20 minutos.Coloque a folha de cobertura na câmara de gravação com um mililitro de solução de trabalho. Escolha o campo de visão com um número consistente de células ao longo do experimento. Inicie a imagem e determine a linha de base adquirindo o nível basal de fluorescência por três a cinco minutos.Em seguida, pare o fluxo da solução de trabalho e mude para a solução de teste pelo período de tempo desejado. Entre cada solução de ensaio, lavar as células com um fluxo constante da solução de trabalho durante três a cinco minutos. Mantenha o volume da solução na câmara de gravação em um mililitro, organizando uma sucção constante a partir do topo da solução.Escolha o quadro de intensidade de sinal mais alto e circule uma célula usando o aplicativo da ferramenta Poligonal. Depois de circundar todas as células no campo adquirido, escolha cinco regiões de interesse no plano de fundo usando a ferramenta Círculo. Em seguida, meça a intensidade média do sinal de uma única célula e o fundo para cada período de tempo.Selecione todas as regiões de interesse e use o comando Multi-Measure no ROI Manager no ImageJ ou qualquer comando equivalente em software comercial. Depois de importar os dados no software MATLAB, faça uma média de cinco ROIs de fundo e subtraia o plano de fundo médio de cada quadro da intensidade média do ROI dos quadros adquiridos simultaneamente. Posteriormente, analise a atividade do cálcio determinando a amplitude do pico de cálcio, a mudança integrada do transiente de cálcio, o tempo de pico, o tempo de subida, a meia largura e a frequência.GFAP é usado para visualizar astrócitos e Iba1 para visualizar a micróglia. Os astrócitos hSOD1G93A respondem à imunoglobulina G da ELA com maior amplitude do transiente de cálcio, uma alteração global integrada mais considerável e um tempo mais curto para atingir o pico do que os astrócitos não transgênicos. A resposta à imunoglobulina G da ELA é distinguível da resposta à ATP.Os astrócitos hSOD1G93A apresentaram um maior nível de íons cálcio nos estoques, conforme revelado pela depleção do estoque, indicando uma sobrecarga desse íon. Microglias foram cultivadas e a intensidade média de fluorescência foi extraída ao longo do tempo. Os traços de cálcio de três células representaram que apenas uma célula respondeu à imunoglobulina G da ELA, enquanto todas as células responderam ao ATP.As imagens pseudocoloridas representaram a intensidade de fluorescência e a linha de base em resposta à ELA, IgG e ATP. As células precisam ser adequadamente carregadas e os parâmetros do sistema de imagem precisam ser ajustados adequadamente, de modo que o sinal não seja separado durante o experimento. Juntamente com a emissão de cálcio, o clampeamento do adesivo pode ser realizado.Assim, um quadro mais completo da correlação entre diferentes correntes de íons de membrana e emissores de cálcio pode ser obtido. A compreensão da homeostase intracelular do cálcio é de importância essencial para a exploração de diversas respostas a estímulos naturais, bem como a estímulos estressantes e externos.

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Aqui nós fornecemos um protocolo para a cultura de neurônios corticais de ratos na presença de uma camada de alimentação glial. Os neurônios cultivados estabelecer polaridade e criar sinapses, e pode ser separada da glia para uso em diversas aplicações, tais como eletrofisiologia, imageamento de cálcio, ensaios de sobrevivência celular, imunocitoquímica e RNA / DNA / isolamento de proteínas.

Bilaminar Co-cultura de neurônios de rato Primária Cortical e Glia

Isolar microglia primária a partir da heterogeneidade celular do cérebro é essencial para investigar o seu papel em ambas as condições fisiológicas e patológicas. Este protocolo descreve um isolamento mecânico e técnica de cultura mista de células que fornece alto rendimento e elevada pureza, viáveis ​​primárias células microgliais...

Isolamento Microglia primária a partir de cultura mista de células gliais de tecido de cérebro de rato neonatal

O vídeo demonstra uma técnica para cultivar astrócitos primários do córtex de ratos. O córtex é mecanicamente dissociado para obter uma suspensão homogênea de células gliais, que é então plaqueada em placas revestidas com polipeptídeos para promover a proliferação seletiva de astrócitos. Posteriormente, os astrócitos são dissociados enzimaticamente das placas e transferidos para meios frescos, permitindo a cultura de astrócitos puros.

Gerando uma cultura primária de astrócitos a partir de um cérebro de filhote de rato

Este vídeo demonstra um método para isolar e cultivar microglia de cérebros de ratos. Envolve a separação da microglia de outras células neuronais e não neuronais usando placas revestidas com um anticorpo monoclonal específico para a microglia.

Isolamento e cultura de microglia de cérebros de ratos usando meios sem soro

Os astrócitos têm sido reconhecidos como células versáteis que participam em processos biológicos fundamentais, que são essenciais para o desenvolvimento do cérebro e função normais, e reparação do sistema nervoso central. Aqui apresenta-se um processo rápido de obtenção de culturas de astrócitos de rato puros para estudar a biologia desta classe importante de centrais células do sistema nervoso.

Isolamento e Cultura de astrócitos corticais de rato

Astrócitos fenotipicamente selvagens e células-tronco neurais colhidas de camundongos modificados com alelos oncogênicos condicionais floxed e transformados por meio de recombinação viral mediada por Cre podem ser usados para modelar a patogênese do astrocitoma in vitro e in vivo por injeção ortotópica de células transformadas em cérebros de irmãos de ninhada singênicos e imunocompetentes.

Modelagem astrocitoma Patogênese In Vitro E In Vivo Usando Cortical astrócitos ou células-tronco neurais de condicional, Geneticamente Modificadas Ratos

O desenvolvimento de dor neuropática envolve alterações patológicas das células gliais medula espinhal. Um sistema de cultura de células gliais de confiança derivados de tecidos de medula espinal adulta e concebido para estudar estas células in vitro é inexistente. Portanto, vamos mostrar aqui como estabelecer culturas gliais mistas primárias de tecido da medula espinhal do rato adulto.

Preparação de culturas mista glial primários de rato adulto Spinal Cord Tissue

O protocolo AWESAM descrito aqui é ideal para o cultivo de astrócitos murino em isolamento de outras células do cérebro de forma rápida, simples e barato. Astrócitos AWESAM exposição espontânea Ca2 + sinalização, morfologia e gene expressão perfis semelhantes de astrócitos na vivo.

Cultivo In Vivo-gosto murino astrócitos usando o protocolo AWESAM rápida, simples e barato

Esforços para entender a função microglial no detalhe tem sido prejudicados pela falta de modelos de cultura microglial que recapitular as propriedades de micróglia maduro na vivo . Este protocolo descreve uma abordagem de isolamento e cultura projetada para manter a sobrevivência robusta de rato maduro altamente ramificados microglia sob condições definidas e médias.

Isolamento e cultura de roedor Microglia para promover uma dinâmica ramificada morfologia em meio livre de soro

Descrevemos um método para diferenciar astrócitos e neurônios derivados pluripotentes induzidos por humanos da medula espinhal e sua co-cultura para registro eletrofisiológico.

Estabelecimento de uma plataforma eletrofisiológica para modelagem da ELA com astrócitos e neurônios derivados de células-tronco pluripotentes humanas regionalmente específicas

Este protocolo descreve o isolamento de astrócitos purificados e microglia da medula espinhal de camundongos adultos, facilitando aplicações subsequentes, como análise de RNA e cultura celular. Inclui métodos e procedimentos detalhados de dissociação celular projetados para melhorar a qualidade e o rendimento das células isoladas.

Isolamento de Astrócitos Puros e Microglia da Medula Espinhal de Camundongos Adultos para Ensaios In Vitro e Estudos Transcriptômicos

Aprenda a preparar culturas primárias de astrócitos e microglia de rato para estudar sinalização de cálcio intracelular na esclerose lateral amiotrófica. Este método permite análise detalhada do comportamento celular em condições neuroinflamatórias.

Culturas Primárias de Astrócitos de Rato e Microglia e Seu Uso no Estudo da Esclerose Lateral Amiotrófica

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