Name: Um ensaio repórter para analisar a maturação intronic microRNA em células mamíferas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-16T12:50:00.000+00:00
Duration: 6 min 48 s
Description: Aprenda a analisar a maturação de microRNA em células mamíferas usando um ensaio repórter com luciferase. Este método permite estudar o impacto de proteínas de ligação ao RNA na biogênese de microRNAs em diferentes linhagens celulares.

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Os autores são gratos a E. Makeyev (Nanyang Technology University, Cingapura) pelas células HeLa-Cre e plasmídeos pRD-RIPE e pCAGGS-Cre. Agradecemos o apoio de Edna Kimura, Carolina Purcell Goes, Gisela Ramos, Lucia Rossetti Lopes e Anselmo Moriscot.

Uma visão geral do protocolo descrito aqui é retratada na Figura 1.
1. Construção plasmid
<ol><li>pCAGGS-Cre: Este plasmídeo foi fornecido pelo Dr. E. Makeyev21.</li>
	<li>pRD-miR-17-92:<ol><li>Amplie pré-miR-17-92 por PCR usando 0,5 μM de cada primer específico (Tabela de Materiais), 150 ng de cDNA, 1 mM dNTPs, 1x tampão PCR Taq e 5 U de polimerase de DNA Taq de alta fidelidade. Realize uma reação pcr de controle sem modelo (use água em vez de cDNA) para verificar se há contaminação de DNA.</li>
		<li>Ligate o produto PCR em pRD-RIPE (gentilmente fornecido pelo Dr. E. Makeyev, Nanyang Technology University, Cingapura)21 dentro do intron entre os locais de restrição EcoRI e EcoRV usando ligase de DNA, criando pRD-miR-17-92. Confirme a integridade da sequência por sanger sequenciamento.</li>
	</ol></li>
	<li>pmiRGLO-RAP-IB<ol><li>Projete primers para frente e para trás ladeados por sites de restrição XhoI/XbaI e com um site de restrição NotI dentro. Misture as quantidades equimolares de primers dianteiros e invertidos e incubar a mistura a 90 °C por 5 min, depois transfira para 37 °C por 15 minutos. Como controles, use primers com sequências de alvo mexidas (Tabela de Materiais).</li>
		<li>Cutule os fragmentos enaltados usando enzimas de restrição XhoI/XbaI e liga-os a jusante da sequência luc2 em pmiR-GLO, gerando pmiRGLO-RAP-IB-30-UTR (Luc-RAP-1B) e pmiRGLO-mexido-30-UTR (Luc-scrambled) construções repórteres. Confirme a ligadura com o decote NotI. NOTA: Certifique-se de que as saliências criadas após o ressarem do primer são complementares ao vetor após a reação do decote.</li>
	</ol></li>
	<li>pFLAG-HuR<ol><li>Para gerar um plasmídeo de super-expressagem hur, amplie a sequência HuR com primers específicos. Misture 300 ng de cDNA, 0,5 μM de cada primer específico, 1 mM dNTPs mix, 1x tampão PCR e 5 U de polimerase de DNA Taq de alta fidelidade.</li>
		<li>Liga o produto PCR em pGEM-T e confirme a integridade da sequência de DNA pelo sequenciamento Sanger. Remova o fragmento hur do pGEM-T e subclone-o no vetor de expressão de mamíferos pFLAG-CMV-3 para gerar o vetor pFLAG-HuR.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Cultura celular
NOTA: A linha celular HeLa-Cre foi um presente do Dr. E. Makeyev21, e a célula cancerígena da tireoide papilar (BCPAP) foi gentilmente fornecida pelo Dr. Massimo Santoro (Universidade "Federico II", Nápoles, Itália). Células HeLa, células cancerígenas papilares (BCPAP) e HEK-293T foram usadas para sobreexpressar HuR.
<ol><li>Manter as células em DMEM/alta glicose suplementadas com soro bovino fetal de 10%, Piruvato de sódio 1 mM, 200 mM L-glutamina e 1x penicilina-estreptomicina (100 penicilina U/mL, 100 μg/mL streptomicin) em placas de Petri de 100 mm, salvo indicação em contrário. Incubar as células a 37 °C em uma incubadora umidificada e controlada (5% de CO2).</li>
	<li>Incubar células aderentes com trippsina/EDTA (mistura de solução de 0,5%) a 37 °C por 3-5 min. Deixe-os se desprender da placa (o período de incubação pode variar de acordo com o tipo celular).</li>
	<li>Realize transfecções com um reagente de transfecção à base de lipídio seguindo as instruções do fabricante. Certifique-se de que as culturas celulares são aproximadamente 70% confluentes. Use quantidades similares de DNA para todas as combinações de transfecção, conforme descrito abaixo, adicionando os DNAs apropriados. Realize experimentos de transfecção em réplicas.<ol><li>Misture 200 ng de DNA e 1,25 μL de reagente de transfecção em 100 μL do meio de cultura. Adicione a mistura de transfecção às células. Incubar as células com as misturas de transfecção por 4h a 37 °C. Em seguida, substitua o meio por meio contendo 10% de FBS e incuba por mais 24 horas antes de adicionar os antibióticos para seleção.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Superexpressão hur
<ol><li>Transfect pFLAG-HuR e pFLAG vazio em HeLa. Selecione células aumentando a concentração de geneticina (G418) (1 μg/mL) de 100 μg/mL para 1000 μg/mL, gerando linhas celulares estáveis.</li>
	<li>Confirme a superexpressão com PCR quantitativo usando primers específicos para HuR mRNA, conforme descrito na etapa 7.</li>
</ol>4. Isolamento total do RNA
<ol><li>Use células recém-coletadas. Trippsinize 70% de culturas celulares confluentes (para este ensaio, foram utilizadas células HeLa-Cre), conforme descrito na etapa 2.2.</li>
	<li>Coletar a pelota celular por centrifugação por 5 min a 500 x g a 4 °C e lavá-la com 1x PBS (salina tamponada com fosfato); repetir a centrifugação.</li>
	<li>Resuspenja a pelota de célula em 1 mL de PBS 1x e transfira-a para um tubo de microcentrifuuge de 1,5 mL.</li>
	<li>Centrifugar por 5 min a 500 x g a 4 °C.</li>
	<li>Pesar a pelota seca da célula e ajustar os volumes e o tamanho dos tubos em conformidade. 1 mg de células produz aproximadamente 1 μg de RNA total.</li>
	<li>Em um capô, adicione 500-1.000 μL de fenol/clorofórmio à pelota celular (idealmente 750 μL por 0,25 g de células) e homogeneize-o por pipetar para cima e para baixo e misturar com o vórtice.</li>
	<li>Incubar a mistura por 5 min a temperatura ambiente (20 °C a 25 °C) para permitir a dissociação completa dos complexos de nucleoproteína.</li>
	<li>Centrifugar a amostra a 500 x g por 5 min a 4 °C.</li>
	<li>Transfira o supernatante para um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 mL e adicione 200 μL de clorofórmio por 1 mL de fenol:clorofórmio usado. Tampe os tubos de amostra com segurança.</li>
	<li>Misture vigorosamente por 15 s (à mão ou brevemente vórtice a uma velocidade mais baixa) e incubar à temperatura ambiente (20 °C a 25 °C) por 2 min a 3 min.</li>
	<li>Centrifugar as amostras a 12.000 x g por 15 min a 4 °C.</li>
	<li>Verifique a presença de uma fase de fenol-clorofórmio vermelho inferior, uma fase intermediária e uma fase aquosa superior incolor. O RNA permanece na fase aquosa superior. Em um capô, colete a fase aquosa, evitando entrar em contato com a fase intermediária e transfira para um tubo fresco.</li>
	<li>Precipitar o RNA misturando a fase aquosa com 400 μL de isopropanol de grau molecular (proporção 1:1 para fenol/clorofórmio usado) e 2 μL de glicogênio em cada tubo (ajudará a visualizar a presença da pelota).</li>
	<li>Misture vigorosamente à mão ou homogeneize com a ponta para ~10 s. Incubar por 15 min ou durante a noite a −20 °C.</li>
	<li>Centrifugar a amostra a 12.000 x g por 20 min a 4 °C e descartar o sobrenatante.</li>
	<li>Lave a pelota de RNA adicionando 3 volumes de 100% de etanol (aproximadamente 1 mL, diluído com água DEPC) e misture a amostra por vórtice até que a pelota seja liberada e flutue do fundo.</li>
	<li>Centrifugar a 7.500 x g por 5 min a 4 °C.</li>
	<li>Lave a pelota de RNA 1x adicionando 1 mL de 75% de etanol e misture a amostra com vórtice até que a pelota seja liberada e flutue do fundo. Repita a centrifugação conforme descrito na etapa 4.17.</li>
	<li>Realize um giro adicional de centrifugação de 5 s para coletar líquido residual do lado do tubo e remova qualquer líquido residual com uma pipeta sem perturbar a pelota.</li>
	<li>Seque brevemente a pelota de RNA abrindo a tampa do tubo à temperatura ambiente por 3-5 min e dissolva a pelota de RNA em 20-50 μL de água tratada com DEPC sem RNase. Incubar o RNA por 10 min a 55-60 °C para facilitar a ressuspensão da pelota.</li>
</ol>5. Determinação da concentração e qualidade total do RNA
<ol><li>Determine a concentração de RNA medindo a absorvância a 260 nm e 280 nm usando um espectrofotômetro. Obtenha dados espectrais completos antes de usar as amostras em aplicações a jusante.</li>
	<li>Controle a qualidade do RNA resolvendo 800-1000 ng em um gel de 1,5% de agarose usando tampão 0,5X TBE (base Tris de 45 mM, ácido bórico de 45 mM, 1 mM EDTA). Total de RNA se separa em duas bandas referentes a 28S e 18S rRNAs.<ol><li>Faça todos os reagentes e lave todos os equipamentos utilizados para a execução do gel com água tratada com DEPC. A água tratada com DEPC é preparada no capô adicionando 1 mL de dietilpiroto a 1000 mL de água ultra-pura. Incubar por ~2 h em temperatura ambiente ou a 37 °C e autoclave. Guarde em temperatura ambiente por até 10 meses. NOTA: A eletroforese do total de RNAs de mamíferos leva à separação de rRNAs 28S e 18S a uma proporção de aproximadamente 2:1. As bandas devem estar intactas e visíveis como duas bandas afiadas. RNA degradado resultará em bandas embaçadas.</li>
	</ol></li>
</ol>6. Transcrição reversa
<ol><li>Defina a reação de transcrição reversa usando 1 μg de RNA total.</li>
	<li>Realize a transcrição reversa (RT) usando enzima transcriptase reversa (ver Tabela de Materiais) e primers de decamer aleatórios de 50 ng/μL.<ol><li>Misture RNA, primers aleatórios e 1 mM dNTP mix (10 mM) em 10 μL. Incubar a 65 °C por 5 min e no gelo por 1 min. Adicione os seguintes reagentes: tampão 1x RT, 5 mM MgCl2, 10 mM DTT, 40 U do inibidor RNase e 200 U de Transcriptase Reversa.</li>
		<li>Incubar por 10 min a 25 °C e por 1h a 50 °C (as temperaturas podem mudar se diferentes enzimas forem usadas). Termine a reação incubando a 85 °C por 5 min. cDNAs podem ser armazenados a −20 °C.</li>
	</ol></li>
</ol>7. PCR quantitativo
<ol><li>Para montar a reação em um volume final de 15 μL, misture 3 μL de cDNA (100 ng/μL), 3,2 pmol de cada primer, 6 μL de mix mestre contendo dNTPs e enzima, e 2,8 μL de água ultrapura. NOTA: Use primers para genes constitutivos endógenos como controles (genes de limpeza) para normalizar os níveis de expressão de HuR mRNA e miRNAs. β-Actin e snRNA U6 (RNU6B) são opções disponíveis para a normalização de mRNAs e miRNAs, respectivamente, mas outros genes também podem ser adequados dependendo do caso.</li>
	<li>Quantifique os níveis de expressão usando o método delta-delta Ct (2-ΔΔCt)20.</li>
</ol>8. O ensaio do repórter
<ol><li>Células usadas para o ensaio<ol><li>Transfeito os plasmídeos nas células HeLa-Cre da seguinte forma. Transfect com pTK-Renilla (40 ng), depois pRD-miR-17-92, gerando HeLa-Cre-miR-17-92, e selecionando com 1 μg/mL puramycina.</li>
		<li>Transfect HeLa-Cre-miR-17-92-pTK-Renilla com pmiRGLO-RAP-IB-30-UTR ou pmiRGLO-mexido-30-UTR, separadamente. Selecione usando penicilina (100 U/mL) e estreptomicina (100 μg/mL). Essas transfecções geram Luc-RAP-1-B e Luc-mexido.</li>
		<li>Transfem as células com pFLAG-HuR ou pFLAG vazio (passo 3).</li>
		<li>Prossiga para a cultura celular, conforme detalhado na etapa 2.2., com HeLa-Cre miR-17-92-luc, HeLa-Cre miR-17-92-mexido, HeLa-Cre miR-17-92-HuR, e HeLa-Cre miR-17-92-HuR-luc até aproximadamente 80% de confluência. Induza com 1 μL de doxiciclina (1 μg/mL) por 30 min a 37 °C. Além disso, mantenha todas as células sem doxiciclina como controles, pelo mesmo período. NOTA: A concentração final da doxiciclina depende da linha celular escolhida. Um excesso de doxiciclina pode ser tóxico para células de mamíferos.</li>
	</ol></li>
	<li>Ensaio luminescente<ol><li>Para quantificar e comparar diferentes intensidades de luminescência, use o kit de ensaio de repórter dual-luciferase. Descongele as soluções de ensaio de luciferase e deixe-as em temperatura ambiente antes de iniciar o ensaio.</li>
		<li>Prepare a mistura Stop and Glo (tubos de tampa azul) misturando 200 μL do substrato em 10 mL de Luciferase Assay Buffer II. Prepare a mistura LAR II (tubos de tampa verde) misturando 10 mL de Luciferase Assay Buffer II no frasco âmbar do Substrato de Ensaio De Luciferase II e agite bem.</li>
		<li>Transfira as soluções para tubos de centrífugas de 15 mL previamente identificados e protegidos contra a luz. NOTA: Como alternativa, as soluções podem ser previamente preparadas em alíquotas de 1-2 mL e congeladas a −80 °C protegidas da luz em papel alumínio.</li>
		<li>Realizar as leituras de luminescência utilizando um equipamento como Synergy; medida expressa luciferase como unidades de luz relativa (RLU).</li>
		<li>Exportar os resultados para uma planilha para análise estatística posterior.</li>
		<li>Realize a normalização da atividade de vagalume-luciferase pelo controle Renilla (luciferase/Renilla) e plote isso como unidades de luz relativas (RLU) em um gráfico. Repita isso para grupos com e sem indução de doxiciclina.</li>
		<li>Calcular o erro médio e padrão da média (SEM). Realize o teste t ou ANOVA bidirecional de um aluno seguido do pós-teste de Tukey para permitir a comparação em grupo. Essas análises estão disponíveis em um pacote como GraphPad Prism. As diferenças nos valores p < 0,05 são consideradas significativas.</li>
	</ol></li>
</ol>

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<li>Grammatikakis, I., Abdelmohsen, K., Gorospe, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Posttranslational+control+of+HuR+function%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdisciplinary+Reviews.+RNA%22%5BJournal%5D)">Posttranslational control of HuR function.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews. RNA. 8 (1), (2017).</li>
<li>Chang, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ELAVL1+regulates+alternative+splicing+of+eIF4E+transporter+to+promote+postnatal+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">ELAVL1 regulates alternative splicing of eIF4E transporter to promote postnatal angiogenesis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (51), 18309-18314 (2014).</li>
<li>Huang, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delivery+of+therapeutics+targeting+the+mRNA-binding+protein+HuR+using+3DNA+nanocarriers+suppresses+ovarian+tumor+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Delivery of therapeutics targeting the mRNA-binding protein HuR using 3DNA nanocarriers suppresses ovarian tumor growth.</a> Cancer Research. 76 (6), 1549-1559 (2016).</li>
<li>Wang, W., Caldwell, M. C., Lin, S., Furneaux, H., Gorospe, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HuR+regulates+cyclin+A+and+cyclin+B1+mRNA+stability+during+cell+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">HuR regulates cyclin A and cyclin B1 mRNA stability during cell proliferation.</a> The EMBO Journal. 19 (10), 2340-2350 (2000).</li>
<li>Guo, X., Connick, M. C., Vanderhoof, J., Ishak, M. A., Hartley, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA-16+modulates+HuR+regulation+of+cyclin+E1+in+breast+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">MicroRNA-16 modulates HuR regulation of cyclin E1 in breast cancer cells.</a> International Journal of Molecular Sciences. 16 (4), 7112-7132 (2015).</li>
</ol>

Os autores não têm conflitos de interesse.

O emenda pré-mRNA é um processo importante para a regulação da expressão genética, e seu controle pode desencadear efeitos fortes sobre modificações fenotípicascelulares 22,23. Mais de 70% dos miRNAs são transcritos de introns em humanos, e nós imaginamos que seu processamento e maturação poderiam ser facilitados por emendar proteínas regulatórias24,25. Desenvolvemos um método para analisar o processament...

O splicing precursor de mRNA é um processo importante para a regulação da expressão genética em eucariotes1. A remoção de introns e a união de exons em RNA maduro é catalisada pelo emendatoroso, um complexo de 2 megadalton ribonucleoproteína composto por 5 snRNAs (U1, U2, U4, U5 e U6) juntamente com mais de 100 proteínas 2,3. A reação de emenda ocorre co-transcrição, e o emendamento é montado a cada novo intron guiado pelo reconhecimento de locais de emenda conservados nos limites exon-intron e dentro do intron4. Diferentes introns podem ter diferentes taxas de emenda, apesar da notável conservação do complexo de emendas e seus componentes. Além das diferenças na conservação do local de emenda, as sequências regulatórias distribuídas em introns e exons podem guiar proteínas de ligação de RNA (RBP) e estimular ou reprimiro splicing 5,6. HuR é um RBP onipresentemente expresso e é um fator importante para controlar a estabilidade do mRNA7. Resultados anteriores do nosso grupo mostraram que o HuR pode se ligar a introns contendo miRNAs, indicando que essa proteína pode ser um fator importante para facilitar o processamento e a maturação do miRNA, levando também à geração de isóformes alternativos de emenda 6,8,9.
Muitas microRNAs (miRNAs) são codificadas a partir de sequências intrônicas. Enquanto alguns fazem parte do intron, outros são conhecidos como "mirtrons" e são formados por todo o intron10,11. miRNAs são RNAs curtas sem codificação, variando de 18 a 24 nucleotídeos no comprimento12. Sua sequência madura mostra complementaridade parcial ou total com sequências de destino em mRNAs, afetando, portanto, taxas de decadência de tradução e/ou mRNA. As combinações de miRNAs e alvos levam a célula a diferentes resultados. Vários miRNAs podem conduzir células para fenótipos pró ou anti-tumorais13. MiRNAs oncogênicas geralmente têm como alvo mRNAs que desencadeiam uma característica supressiva, levando ao aumento da proliferação celular, migração e invasão14. Por outro lado, miRNAs supressivas de tumores podem atingir mRNAs oncogênicas ou mRNAs relacionados ao aumento da proliferação celular.
O processamento e o amadurecimento das miRNAs também dependem de sua origem. A maioria dos miRNAs intrônicos são processados com a participação do microprocessador, formado pela ribonuclease Drosha e cofatores proteicos12. Mirtrons são processados com a atividade do emendarosome independentemente de Drosha15. Considerando a alta frequência de miRNAs encontradas dentro dos introns, imaginamos que as proteínas de ligação de RNA envolvidas com o splicing também poderiam facilitar o processamento e a maturação desses miRNAs. Notavelmente, o RBP hnRNP A2/B1 já foi associado com o microprocessador e a biogênese miRNA16. 
Já relatamos anteriormente que várias proteínas de ligação de RNA, como hnRNPs e HuR, estão associadas a miRNAs intrônicas por espectrometria de massa17. A associação de HuR (ELAVL1) com miRNAs do cluster tronic miR-17-92 foi confirmada por meio de imunoprecipitação e na análise de silico 9. miR-17-92 é um cluster miRNA intrônico composto por seis miRNAs com expressão aumentada em diferentes cânceres18,19. Este cluster também é conhecido como "oncomiR-1" e é composto por miR-17, miR-18a, miR-19a, miR-20, miR-19b, e miR-92a. miR-19a e miR-19b estão entre os miRNAs mais oncogênicos deste cluster19. O aumento da expressão do HuR estimula a síntese miR-19a e miR-19b 9. Uma vez que as regiões intrônicas que flanqueiam este aglomerado estão associadas ao HuR, desenvolvemos um método para investigar se essa proteína poderia regular a expressão e a maturação de miR-19b. Uma previsão importante de nossa hipótese foi que, como proteína regulatória, o HuR poderia facilitar a biogênese do miRNA, levando a alterações fenotípicas. Uma possibilidade era que os miRNAs fossem processados pela estimulação do HuR, mas não seriam maduros e funcionais e, portanto, os efeitos da proteína não impactariam diretamente o fenótipo. Por isso, desenvolvemos um ensaio de repórter emenda para investigar se um RBP como o HuR poderia afetar a biogênese e o amadurecimento de um miRNA intronic. Ao confirmar o processamento e amadurecimento do miRNA, nosso ensaio mostra a interação com a sequência de destino e a geração de um miRNA maduro e funcional. Em nosso ensaio, acoplamos a expressão de um aglomerado de miRNA intrônico com um plasmídeo de luciferase para verificar se há ligação de alvo de miRNA em células cultivadas.

<table><tbody><tr><td>DNA recombinante</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pCAGGS-Cre (plasmídeo codificador de Cre)</td><td></td><td></td><td>Um gentil presente de E. Makeyev de Khandelia et al., 2011</td></tr><tr><td>pFLAG-HuR</td><td></td><td></td><td>Gerado durante este trabalho</td></tr><tr><td>pmiRGLO-RAP-IB</td><td></td><td></td><td>Gerado durante este trabalho</td></tr><tr><td>pmiRGLO-scrambled</td><td></td><td></td><td>Gerado durante este trabalho</td></tr><tr><td>pRD-miR-17-92</td><td></td><td></td><td>Gerado durante este trabalho</td></tr><tr><td>pRD-RIPE-doador</td><td></td><td></td><td>Um presente gentil de E. Makeyev de Khandelia et al., 2011</td></tr><tr><td>pTK-Renilla</td><td>Promega</td><td>E2241</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpos</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>anti-B-actina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A5316</td><td></td></tr><tr><td>anti-HuR</td><td>Sinalização celular</td><td>mAb&nbsp; 12582</td><td></td></tr><tr><td>IRDye 680CW Cabra anti-rato IgG</td><td>Li-Cor Biosciences</td><td>926-68070</td><td></td></tr><tr><td>IRDye 800CW Cabra anti-coelho IgG</td><td>Li-Cor Biosciences</td><td>929-70020</td><td></td></tr><tr><td>Modelos experimentais: Linhas celulares</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HeLa-Cre</td><td></td><td></td><td>Um gentil presente de E. Makeyev de Khandelia et al., 2011</td></tr><tr><td>HeLa-Cre miR17-92</td><td></td><td></td><td>Gerado durante este trabalho</td></tr><tr><td>HeLa-Cre miR17-92-HuR</td><td></td><td></td><td>Gerado durante este trabalho</td></tr><tr><td>HeLa-Cre miR17-92-HuR-luc</td><td></td><td></td><td>Gerado durante este trabalho</td></tr><tr><td>HeLa-Cre miR17-92-luc</td><td></td><td></td><td>Gerado durante este trabalho</td></tr><tr><td>HeLa-Cre miR17-92-scrambled</td><td></td><td></td><td>Gerado durante este trabalho</td></tr><tr><td>Chemicals e Peptídeos< / forte ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>DMEM / alta glicose</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12800-017</td><td></td></tr><tr><td>Doxiciclina</td><td>BioBasic</td><td>MB719150</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de ensaio de luciferase Dual-Glo</td><td>Promega</td><td>E2940</td><td></td></tr><tr><td>EcoRI</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ER0271</td><td></td></tr><tr><td>EcoRV</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ER0301</td><td></td></tr><tr><td>Geneticina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>E859-EG</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM I</td><td>Life Technologies</td><td>31985-070</td><td></td></tr><tr><td>pFLAG-CMV&trade;-3 Vetor de Expressão</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E6783</td><td></td></tr><tr><td>pGEM-T</td><td>Promega</td><td>A3600</td><td></td></tr><tr><td>Platinum Taq DNA polimerase</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10966-030</td><td></td></tr><tr><td>pmiR-GLO</td><td>Promega</td><td>E1330</td><td></td></tr><tr><td>Puromicina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P8833</td><td></td></tr><tr><td>RNAse OUT</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>752899</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript IV kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>18091050</td><td></td></tr><tr><td>Trizol-LS reagente</td><td>Thermo Fisher</td><td>10296-028</td><td></td></tr><tr><td>tripsina/EDTA 10X</td><td>Life Technologies</td><td>15400-054</td><td></td></tr><tr><td>XbaI</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10131035</td><td></td></tr><tr><td>XhoI</td><td>Promega</td><td>R616A</td><td></td></tr><tr><td>Oligonucleotídeos</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>forward RAP-1B pmiRGLO</td><td>Exxtend</td><td>TCGAGTAGCGGCCGCTAGTAAG CTACTATCAGTTTGCACAT</td><td></td></tr><tr><td>reverse RAP-1B pmiRGLO</td><td>Exxtend</td><td>CTAGATGTGCAAACTGATATAGT AGCTTACTAGCGGCCGCTAC</td><td></td></tr><tr><td>forward scrambled pmiRGLO</td><td>Exxtend</td><td>TCGAGTAGCGGCCGCTAGTAA GCTACTATATCAGGGGTAAAAT</td><td></td></tr><tr><td>reverse scrambled pmiRGLO</td><td>Exxtend</td><td>CTAGATTTTACCCCTGATATAGT AGCTTACTAGCGGCCGCTAC</td><td></td></tr><tr><td>forward HuR pFLAG</td><td>Exxtend</td><td>GCCGCGAATTCAATGTCTAAT GGTTATGAAGAC</td><td></td></tr><tr><td>reverse HuR pFLAG</td><td>Exxtend</td><td>GCGCTGATATCGTTATTTGTG GGACTTGTTGG</td><td></td></tr><tr><td>forward pre-miR-1792 pRD-RIPE</td><td>Exxtend</td><td>ATCCTCGAGAATTCCCATTAG GGATTATGCTGAG</td><td></td></tr><tr><td>reverse pre-miR-1792 pRD-RIPE</td><td>Exxtend</td><td>ACTAAGCTTGATATCATCTTG TACATTTAACAGTG</td><td></td></tr><tr><td>forward snRNA U6 (RNU6B)</td><td>Exxtend</td><td>CTCGCTTCGGCAGCACATATAC</td><td></td></tr><tr><td>reverse snRNA U6 (RNU6B)</td><td>Exxtend</td><td>GGAACGCTTCACGAATTTGCGTG</td><td></td></tr><tr><td>forward B-Actin qPCR</td><td>Exxtend</td><td>ACCTTCTACAATGAGCTGCG</td><td></td></tr><tr><td>reverse B-Actin qPCR</td><td>Exxtend</td><td>CCTGGATAGCAACGTACATGG</td><td></td></tr><tr><td>forward HuR qPCR</td><td>Exxtend</td><td>ATCCTCTGGCAGATGTTTGG</td><td></td></tr><tr><td>reverse HuR qPCR</td><td>Exxtend</td><td>CATCGCGGCTTCTTCATAGT</td><td></td></tr><tr><td>forward pre-miR-1792 qPCR</td><td>Exxtend</td><td>GTGCTCGAGACGAATTCGTCA GAATAATGTCAAAGTG</td><td></td></tr><tr><td>reverse pre-miR-1792 qPCR</td><td>Exxtend</td><td>TCCAAGCTTAAGATATCCCAAAC TCAACAGGCCG</td><td></td></tr><tr><td>Software and Algorithms</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Prism 8 for Mac OS X</td><td>Graphpad</td><td></td><td></td>https://www.graphpad.com</tr><tr><td>ImageJ Institutos</td><td>Nacionais de Saúde</td><td>http://imagej.nih.gov/ij</td><td></td></tr></tbody></table>

um ensaio repórter para analisar a maturação intronic microrna em células mamíferas

A Reporter Assay to Analyze Intronic microRNA Maturation in Mammalian Cells

MicroRNAs (miRNAs) são moléculas de RNA curtas que são difundidas em eucariotes. A maioria dos miRNAs são transcritas de introns, e sua maturação envolve diferentes proteínas de ligação de RNA no núcleo. MiRNAs maduras frequentemente mediam o silenciamento genético, e isso se tornou uma ferramenta importante para compreender eventos pós-transcrição. Além disso, pode ser explorado como uma metodologia promissora para terapias genéticas. No entanto, atualmente há uma falta de métodos diretos para avaliar a expressão miRNA em culturas de células mamíferas. Aqui, descrevemos um método eficiente e simples que auxilia na determinação da biogênese e maturação do miRNA através da confirmação de sua interação com sequências de destino. Além disso, este sistema permite a separação da maturação exógena do miRNA de sua atividade endógena usando um promotor indutível de doxiciclina capaz de controlar a transcrição miRNA primária (pri-miRNA) com alta eficiência e baixo custo. Esta ferramenta também permite a modulação com proteínas de ligação de RNA em um plasmídeo separado. Além de seu uso com uma variedade de diferentes miRNAs e seus respectivos alvos, ele pode ser adaptado a diferentes linhas celulares, desde que sejam favoráveis à transfecção.

Nossa hipótese inicial era que o HuR poderia facilitar a biogênese miRNA intronic, vinculando-se à sua sequência pré-miRNA. Assim, a conexão da expressão HuR e da biogênese de cluster miR-17-92 poderia apontar para um novo mecanismo que rege o amadurecimento desses miRNAs. A superexpressão do HuR após a transfecção do pFLAG-HuR foi confirmada em três linhas celulares diferentes: HeLa, BCPAP e HEK-293T (Figura 2). Como controles, foram utilizadas células não traduzídas e células tran...

Desenvolvemos um ensaio de repórter de biogênese intrônica para ser usado em células in vitro com quatro plasmídeos: um com miRNA intrônico, um com o alvo, um para superexpressar uma proteína regulatória, e outro para a luciferase renilla. O miRNA foi processado e pôde controlar a expressão da luciferase ligando-se à sequência de alvos.

Um ensaio repórter para analisar a maturação intronic microRNA em células mamíferas

MicroRNAs (miRNAs) are short RNA molecules that are widespread in eukaryotes. Most miRNAs are transcribed from introns, and their maturation involves ...

Nosso protocolo aborda os efeitos das proteínas reguladoras de ligação de RNA na biogênese e maturação de microRNA, diretamente das culturas celulares. O método que descrevemos pode ser realizado com reagentes de cultura celular comum e é relativamente rápido. Este método pode ser importante para estudar os efeitos fenotípicos das microRNAs e seus alvos em diferentes tipos de células eucarióticas.Células normais ou semelhantes a doenças podem ser usadas. É importante escolher linhas celulares favoráveis à transfecção, realizar controles adequados de transfecção e indução, a fim de observar as mudanças na afinidade alvo através da atividade luciferase. Para começar, mantenha as células em DMEM, suplemento de alta glicose em placas de Petri de 100 milímetros e incubar as células a 37 graus Celsius em uma incubadora atmosférica úmida e controlada com 5% de dióxido de carbono.Para desapegar células aderentes, incuba-as com a solução trypsin-EDTA a 37 graus Celsius por três a cinco minutos. Para realizar transfeções, misture 200 nanogramas de DNA e 1,25 microlitres de reagente transfecção em 100 microliters do meio de cultura e adicione a mistura de transfecção às células. Em seguida, i

a-reporter-assay-to-analyze-intronic-microrna-maturation-mammalian

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Pesquisa sobre o Câncer

Aqui nós descrevemos um ensaio que utiliza o poder da microinjeção juntamente com...

Análise de Cinética mRNA Nuclear Exportação em células de mamíferos por microinjeção

MicroRNAs (miRNAs) são importantes reguladores da expressão gênica e foram mostrados a desempenhar um papel em inúmeros processos biológicos. Para entender melhor miRNA-UTR interações, criamos uma coleção de todo o genoma de três repórteres UTR luciferase emparelhado com um novo gene luciferase e reagentes de ensaio, o sistema de interruptor.

Metas de identificação de microRNAs humanos com o Sistema de ensaio de luciferase lightswitch usando 3&#39;UTR repórter-Constrói e um microRNA em células aderentes Mimic

Neste vídeo, demonstramos que, na presença de um inibidor de fosfodiéster, o ciclo celular do oócito é interrompido na prófase-I, durante o qual os mRNAs transcritos são armazenados na ausência de tradução. Após a liberação do inibidor, a maturação do oócito é retomada e as células entram na metáfase. O sinal do mRNA repórter fundido com o gene alvo na metáfase-I indica a ativação da maquinaria translacional e da expressão proteica.

O ensaio repórter de oócito único in vitro: uma técnica para estudar a regulação da tradução do mRNA alvo durante a maturação do oócito in vitro

O ensaio genético repórter é uma ferramenta bem estabelecida e poderosa para dissecar a relação entre as sequências de DNA e suas atividades reguladoras de genes. O acoplamento de elementos reguladores candidatos a genes repórteres que carregam etiquetas de sequência de identificação permite a paralelização massiva desses ensaios.

Ensaios Repórter Massively Parallel em células de mamíferos cultivadas

Com a intenção de caracterizar mudanças em miRNAs em células-tronco neurais humanas diferenciadas (hNSCs), descrevemos a diferenciação de hNSC em um sistema tridimensional, a avaliação de mudanças na expressão de microRNAs por matriz de PCR de miRNA e análise computacional para predição de alvos de miRNAs e sua validação por ensaio de luciferase dupla.

Diferenciação de uma linha de células-tronco neurais em Três Culturas dimensionais, os genes Análise de microRNA e putativo alvo

Aqui propomos uma estratégia para estudar o efeito de um fator de transcrição de interesse no transcriptoma de microRNA usando dados publicamente disponíveis, recursos computacionais e dados de alto rendimento de matrizes de microRNA após a transfecção de células com pequeno hairpin (sh)RNA visando um fator de transcrição de interesse.

Descrevendo um regulamento Dependente Fator de Transcrição do MicroRNA transcriptoma

Este relatório descreve um método rápido e confiável para validar alvos de mRNA de miRNAs celulares. O método usa biotinilado sintético baseado no LNA de ácido nucleico trancado miRNA imita para capturar o alvo do mRNA. Posteriormente, grânulos magnéticos streptavidin-revestidas são empregados para pulldown o alvo mRNA para quantificação por qPCR reação em cadeia da polimerase.

Pulldown biotina-baseado do ensaio para validar mRNA miRNAs alvos de celular

micro-RNAs (miRNAs) são sequências de RNA curtas e altamente homólogas, servindo como reguladores pós-transcricional de RNAs mensageiro (mRNAs). Métodos de deteção de miRNA atuais variam em sensibilidade e especificidade. Descreveremos um protocolo que combina a hibridação in situ e imunocoloração para a deteção simultânea de moléculas miRNA e proteína em cortes de tecido de coração de rato.

Tecido-específica miRNA Expression Profiling Mouse coração seções usando em hibridação in Situ

Este protocolo utiliza uma reação em cadeia da polimerase em tempo real (PCR), um ensaio de sulforhodamina B (SRB), 3 ' regiões não traduzidas (3 ' UTR) clonagem e um ensaio de luciferase para verificar os genes alvo de um miRNA de interesse e para compreender as funções de miRNAs.

Protocolo in vitro para avaliação de níveis de MicroRNA, funções e genes alvo associados em células tumorais

Este protocolo descreve um ensaio repórter para estudar a regulação da tradução de mRNA em oócitos únicos durante a maturação in vitro.

Definindo o Programa de Tradução materna mRNA durante a maturação in vitro usando um ensaio de repórter oócito único

Este protocolo descreve um ensaio de repórter minigene para monitorar o impacto de mutações de 5'-splices no splicing e desenvolve snRNA supressor U1 para o resgate da inibição de emenda induzida por mutação. As construções de snRNA do repórter e supressor U1 são expressas em células HeLa, e o splicing é analisado por extensão de primer ou RT-PCR.

Um ensaio celular baseado em repórter para monitorar a eficiência do splicing

Aprenda a analisar a maturação de microRNA em células mamíferas usando um ensaio repórter com luciferase. Este método permite estudar o impacto de proteínas de ligação ao RNA na biogênese de microRNAs em diferentes linhagens celulares.

Um ensaio repórter para analisar a maturação intronic microRNA em células mamíferas

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