Decifrando o Mecanismo Molecular da Montagem de Histonas pela Técnica de Cortina de DNA
9 de março de 2022
A cortina de DNA, uma técnica de imagem de molécula única de alto rendimento, fornece uma plataforma para visualização em tempo real de diversas interações proteína-DNA. O presente protocolo utiliza a técnica de cortina de DNA para investigar o papel biológico e o mecanismo molecular de Abo1, uma Schizosaccharomyces pombe contendo bromodomínio AAA+ ATPase.
Este protocolo mostra como a técnica de cortina de DNA é utilizada para estudar a dinâmica da cromatina, em particular investigando a função molecular de chaperonas de histonas. A técnica de imagem de molécula única de alto rendimento A cortina de DNA supera as limitações dos experimentos em massa e facilita a obtenção de imagens em tempo real, permitindo a caracterização detalhada das interações da Biomolécula. Coloque um papel limpo de dimensão 5 por 35 milímetros no centro da fita dupla face.
Fixe a fita sobre a lâmina para cobrir os dois orifícios e nano padrões com o papel. Em seguida, extire o papel usando uma lâmina limpa. Coloque uma tampa de vidro por cima da fita dupla face e esfregue a tampa usando uma ponta de pipeta para formar uma câmara microfluídica.
Coloque a célula de fluxo montada entre duas lâminas do microscópio e corte-as. Asse a célula de fluxo em forno a vácuo a 120 graus Celsius por 45 minutos. Conecte o conector de fluido para a análise baseada em chip a cada orifício aberto usando uma pistola de cola quente.
E conecte as duas linhas de tubulação de bloqueio de isca. Conecte uma seringa de bloqueio de isca contendo três mililitros de água deionizada e lave a câmara. Lave novamente a câmara com três mililitros de tampão lipídico através de conexão gota a gota.
Injetar um mililitro de lipídio biotinilado 0,04x em tampão lipídico, na câmara, em dois disparos, com incubação de cinco minutos por disparo. Injetar 0,025 miligramas por mililitro de estreptavidina em um mililitro de BSA, com duas injeções, e uma incubação de 10 minutos por injeção. Injetar aproximadamente 30 picomolares de DNA de fagos lambda biotinilados em um mililitro de tampão BSA, na câmara com dois tiros e incubações de 10 minutos por disparo.
Conecte uma seringa contendo 10 mililitros de tampão de imagem a uma bomba de seringa e remova bolhas em todas as linhas de tubulação no sistema microfluídico. Junte a célula de fluxo preparada com o sistema microfluídico através de conexão gota-a-gota para evitar a injeção de bolhas na célula de fluxo. Monte a célula de fluxo e os suportes de célula de fluxo e monte o conjunto em um microscópio de fluorescência de reflexão interna total construído sob medida.
Injetar 200 microlitros de corante YOYO-1 em tampão de imagem através de 100 microlitros de alça de amostra para corar moléculas de DNA Lambda. Execute um software de imagem e ligue o laser de 488 nanômetros para verificar se as cortinas de DNA estão bem formadas. Após a remoção do corante YOYO-1, injete a amostra de proteína pré-incubada.
Quando as proteínas atingirem a cortina de DNA, desligue a bomba da seringa, desligue a válvula de desligamento e incube por 15 minutos para carregamento de histona por Abo1. Lave as proteínas Abo1 e histonas não ligadas por cinco minutos. Desligue transitoriamente o fluxo tampão para verificar se as proteínas de histona estão carregadas no DNA.
A formação de cortinas de DNA foi verificada pela coloração de moléculas de DNA com um corante interpolador. Linhas verdes mostradas em arranjos paralelos indicaram que YOYO1 intercalado em moléculas de DNA estavam bem alinhadas e esticadas em uma barreira de difusão sob fluxo hidrodinâmico. Quando dímeros Cy5-H3-H4 foram injetados na cortina de DNA na ausência de Abo1, Cy5-H3-H4 não se ligou ao DNA, indicando uma falta de ligação espontânea dos dímeros H3-H4 ao DNA.
Quando Cy5-H3-H4 foi injetado com Abo1, puncta fluorescentes vermelhos foram vistos em moléculas de DNA, sugerindo que Abo1 carrega dímeros H3-H4 no DNA. Os sinais fluorescentes desapareceram na ausência de fluxo tampão e reapareceram quando o fluxo foi retomado, sugerindo que dímeros H3-H4 se ligam ao DNA. A ligação dos dímeros H3-H4 ao DNA também foi confirmada pelo quimógrafo, no qual os sinais de fluorescência desapareciam sempre que o fluxo era desligado.
Poucos pontos fluorescentes apareceram na cortina de DNA, seja na ausência de nucleotídeo ou na presença de ADP, indicando que dímeros H3-H4 raramente se ligam ao DNA, seja no estado Apo ou na presença de ADP. A análise quantitativa mostra que o número de dímeros H3-H4 ligados ao DNA aumenta na presença de ATP. Os resultados sugerem que a hidrólise de ATP é essencial para a carga de H3-H4 no DNA por Abo1.
Evitar a injeção de bolhas na célula de fluxo é o mais crítico para todas as etapas. Então, neste protocolo, enfatizamos as conexões gota a gota. O ensaio de cortina de DNA pode ser estendido para cortinas de DNA de dupla amarração com nanopadrões duplos.
Além disso, podemos fazer outro tipo de cortina de DNA com filamentos de DNA de fita simples, RNA ou actina. A cortina de DNA permite a visualização do movimento da proteína no DNA e facilita o estudo do mecanismo de busca de alvos. A cortina de DNA pode ser estendida para estudar o metabolismo do DNA, incluindo replicação e transcrição.
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Visão Geral
A técnica da cortina de DNA é um método de imagem de molécula única de alto rendimento que permite a visualização em tempo real de interações proteína-DNA. Este protocolo enfoca o uso da cortina de DNA para explorar o papel biológico e o mecanismo molecular da Abo1, uma ATPase AAA+ contendo domínio bromo em Schizosaccharomyces pombe.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biologia Celular
- Biologia Molecular
Antecedentes
- A técnica de cortina de DNA permite a caracterização detalhada das interações entre biomoléculas.
- Superam as limitações dos experimentos em massa.
- A imagem em tempo real facilita o estudo da dinâmica da cromatina.
- As chaperonas de histonas desempenham um papel fundamental no remodelamento da cromatina.
Objetivo do Estudo
- Investigar a função molecular da Abo1.
- Compreender as interações proteína-DNA em tempo real.
- Aprimorar o conhecimento sobre a dinâmica da cromatina.
Métodos Utilizados
- Preparação de uma câmara microfluídica utilizando fita adesiva dupla face e lamínulas.
- Aplicação da técnica de cortina de DNA para imageamento.
- Imageamento de molécula única de alto rendimento.
- Observação em tempo real de interações proteína-DNA.
Resultados Principais
- Visualização bem-sucedida das interações de Abo1 com o DNA.
- Compreensão do papel de Abo1 na dinâmica da cromatina.
- Demonstração da eficácia da técnica de cortina de DNA.
- A imagem em tempo real forneceu dados detalhados sobre as interações.
Conclusões
- A técnica de cortina de DNA é uma ferramenta poderosa para estudar interações proteína-DNA.
- O Abo1 desempenha um papel significativo na dinâmica da cromatina.
- Este método pode ser aplicado a outros estudos biomoleculares.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A tecnologia de cortinas de DNA de molécula única permite a visualização em tempo real e alto rendimento da montagem de nucleossomos mediada por chaperonas de histonas, abordando um gargalo crítico na biologia da cromatina para a descoberta de fármacos. Esta plataforma fornece clareza mecanicista sobre as interações proteína-DNA, apoiando a confiança preditiva na validação de alvos e na redução de riscos em portfólios de descoberta precoce. Sua capacidade de dissecar etapas de montagem dependentes de ATP informa tanto a investigação de alvos quanto o desenvolvimento de ensaios para terapêuticas que modificam a cromatina.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Permite a observação direta da atividade de chaperonas de histonas e da dinâmica de montagem de nucleossomos.
- Esclarece a dependência de ATP no processo de montagem da cromatina, apoiando a desmistificação mecanicista de alvos epigenéticos.
- Facilita a validação funcional de reguladores da cromatina em sistemas relevantes para doenças.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Oferece uma plataforma validada de molécula única para medição quantitativa de interações proteína-DNA.
- Permite a padronização e reprodutibilidade de ensaios para estudos de montagem da cromatina.
- Permite a prontidão para triagem em alto rendimento de moduladores da função de chaperonas de histonas.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Alinha insights mecanicistas com estratégias translacionais de biomarcadores em biologia da cromatina.
- Apoia a continuidade do mecanismo molecular até a validação em modelos pré-clínicos para alvos epigenéticos.
- Informa o avanço ajustado ao risco de agentes modificadores da cromatina.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
A técnica de cortina de DNA integra-se ao continuum de descoberta, desde estudos mecanicistas iniciais até o desenvolvimento de ensaios e validação pré-clínica, especialmente para alvos de cromatina e epigenéticos.
- Biologia da Descoberta: Permite testar hipóteses sobre a função de coadjuvantes de histonas e a dependência de ATP na montagem de nucleossomos.
- Triagem: Fornece leituras quantitativas e reprodutíveis para eventos de ligação proteína-DNA e montagem.
- Análises: Oferece medições em tempo real, em nível de molécula única, para comparar condições e apoiar análises estatísticas.
- Pesquisa Translacional: Conecta descobertas mecanicistas a estados de cromatina relevantes para doenças e ao desenvolvimento de biomarcadores.
- Reutilização Empresarial: Oferece uma plataforma universal adaptável a diversos estudos de interação proteína-DNA em programas de P&D.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva na validação de alvos de cromatina e reduz a ambiguidade mecanicista.
- Valor Operacional: Padroniza fluxos de trabalho de molécula única para garantir reprodutibilidade e escalabilidade na pesquisa de cromatina.
- Valor Estratégico: Melhora as decisões de prosseguir ou interromper projetos e a eficiência do capital ao esclarecer mecanismos-alvo precocemente.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de programas terapêuticos epigenéticos e de modificação da cromatina.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em imagem individual de moléculas e montagem de sistemas microfluídicos.
- Exige acesso à microscopia de fluorescência por reflexão total (TIRF) e infraestrutura de células de fluxo personalizadas.
- Necessita padronização rigorosa entre equipes para geração de dados reprodutíveis.
- Adaptável a diversos substratos de DNA e complexos proteicos mediante modificações no protocolo.
- É fundamental evitar a introdução de bolhas durante a preparação da célula de fluxo para manter a integridade do ensaio.
Perguntas Frequentes sobre Biotecnologia Farmacêutica
Chapters in this video
0:00
Introduction
0:28
Preparation of the Flow Cell
2:16
Connecting Flow Cell to the Microfluidic System and Loading on Microscope
2:49
Histone Assembly by Abo1 Using DNA Curtain
3:46
Results: Visualization of Histone Loading by Abo1 Using Single‐Molecule DNA Curtain
5:46
Conclusion
