Name: Análises de Proteinúria, Infiltração Renal de Leucócitos e Deposição Renal de Proteínas em Camundongos MRL/lpr propensos a Lúpus (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 43 s
Description: Aprenda a avaliar proteinúria, infiltração de leucócitos e deposição de proteínas em rins de camundongos MRL/lpr para estudar a progressão da nefrite lúpica. Este método oferece uma alternativa confiável e econômica para pesquisa em imunologia.

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Agradecemos ao Centro de Citometria de Fluxo, ao Laboratório de Histopatologia, ao Centro de Imagem Fralin do Instituto Politécnico da Virgínia e à Universidade Estadual pelo apoio técnico. Este trabalho é apoiado por várias subvenções internas e do NIH.

O presente protocolo é aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Virginia Tech. Como a doença de lúpus tem maior incidência em fêmeas, apenas os camundongos femininos mrl/lpr foram utilizados. A coleta de amostras foi iniciada com 4 semanas de idade e terminada com 15 semanas. Os camundongos foram obtidos a partir de fontes comerciais (ver Tabela de Materiais) e foram criados e mantidos em um ambiente específico livre de patógenos seguindo as diretrizes institucionais.
1. Teste de proteinúria
<ol><li>Coletar urina seguindo os passos abaixo.<ol><li>Esterilize o capô pulverizando 70% de etanol. Coloque uma folha de plástico estéril na superfície. Prepare dicas, tubos de 1,5 mL e uma pipeta para coletar cerca de 20 μL do líquido. NOTA: As pontas e os tubos devem ser estéreis e sem qualquer pré-tratamento.</li>
		<li>Pegue a gaiola e pulverize 70% de etanol antes de colocá-lo dentro do capô.</li>
		<li>Segure o mouse com uma mão e use a outra mão para massagear a área ventral de cima para baixo suavemente.</li>
		<li>Use um tubo de 1,5 mL ou pipeta para coletar a urina diretamente, ou se a amostra cair, recolhê-la da folha de plástico. Use luvas frescas, lençóis e dicas para cada amostra. NOTA: Se isso não funcionar, use um béquer estéril para isolar o mouse e, em seguida, coletar a urina do béquer depois que o rato urinar.</li>
		<li>Coloque o rato de volta na jaula. Pegue outro mouse e repita as etapas 1.1.3-1.1.4. NOTA: Limpe sempre a folha de plástico e o béquer com 70% de etanol após a coleta da amostra para cada rato. Pelo menos cinco camundongos por grupo são necessários para significância estatística. As amostras de urina podem ser armazenadas a -80 °C até o uso por até 12 meses.</li>
	</ol></li>
	<li>Quantifique as proteínas pelo método Bradford24.<ol><li>Permita que amostras de urina, padrão Albumina e o reagente bradford cheguem à temperatura ambiente (RT) mantendo-as fora do congelador por 10-20 minutos. NOTA: O reagente de Bradford e o padrão Albumin estão incluídos em um kit comercialmente disponível (ver Tabela de Materiais). A concentração inicial do padrão Albumin é de 2 mg/mL. Diluições seriais (1:2 seis vezes) devem ser feitas com água.</li>
		<li>Adicione o reagente bradford a uma placa de 96 poços (200 μL/well), não diluída.</li>
		<li>Pipeta 5 μL de amostra de urina não diluída por poço e use a ponta para pipetar para cima e para baixo várias vezes para misturar corretamente.</li>
		<li>Adicionar padrões (400, 200, 100, 50, 25, 12,5 mg/dL) em duplicatas. Deixe alguns poços como espaços em branco. NOTA: A adição de amostras e normas precisa ser feita rapidamente.</li>
		<li>Deixe-o ficar por 5-10 min na RT.</li>
		<li>Leia a placa a 595 nm em um leitor de placas de acordo com o protocolo do fabricante (ver Tabela de Materiais).</li>
	</ol></li>
</ol>2. Isolamento das células renais
<ol><li>Eutanize o camundongo com CO2 (taxa de fluxo: 30%-70% de volume/min, para alcançar inconsciência ou morte) em uma câmara seguida de deslocamento cervical. Prossiga com a dissecação para coletar os dois rins. Coloque um rim e meio em um meio C10 gelado. Coloque a outra metade do rim em OUTUBRO (etapa 3.1.1). NOTA: C10 é feito com RPMI 1640 suplementado com soro bovino fetal de 10%, 1 mM de piruvato de sódio, 1% de aminoácidos não essenciais mem de 100x, 10 mM de HEPES, 55 μM de 2-mercaptoetanol e 100 U/mL de penicilina-estreptomicina (ver Tabela de Materiais).</li>
	<li>Corte os rins em tamanho de grão (1-2 mm3 pedaços) e digerir em 5 mL de tampão de digestão contendo 1 mg/mL de colagenase e 0,2 mg/mL de DNase I (ver Tabela de Materiais) em RPMI 1640 médio contendo 10 mmol/L de HEPES para 1h com agitação suave contínua a 37 °C. NOTA: Adicione 1 mL de tampão de digestão em um tubo estéril de 2 mL e use uma tesoura estéril para cortar o rim.</li>
	<li>Adicione 10 mL de PBS gelado de 1x contendo 10 mM de ácido etilenodiaminatotraacético (EDTA) e incubar por 10 minutos no gelo. Em seguida, vórtice a suspensão duas vezes.</li>
	<li>Filtre a suspensão da célula através de um coador de 100 μM e lave com 10 mL de HBSS cheio. NOTA: O HBSS completo contém 5 mM de EDTA, 0,1% BSA e 10 mM de HEPES.</li>
	<li>Centrifugar a 350 x g por 10 min no RT.</li>
	<li>Prepare 30%, 37% e 70% solução Isotônica Percoll (SIP). NOTA: Misture 1 parte do volume de 10x PBS e 9 partes de volume de Percoll para preparar OIP (ver Tabela de Materiais); usar HBSS-full para diluir SIP para 30%, 37% e 70% SIP.</li>
	<li>Resuspend células em 5 mL de 30% SIP e carga 37% de 5 mL (superior) e 70% de 5 mL (inferior), fazendo gradiente SIP, lentamente com uma pipeta pasta.</li>
	<li>Centrifugar com Up9 down0 (ou freio 0) a 1000 x g por 30 min no RT.</li>
	<li>Colete leucócitos da interface 37%-70% e resuspensá-los em 5 mL de C10.</li>
	<li>Centrifugar a 350 x g por 10 min a 4 °C.</li>
	<li>Resuspenda a pelota de célula em 3 mL de tampão FACS. As células estão prontas para coloração FACS. NOTA: O buffer FACS contém 1x PBS e 0,1% Bovine Serum Albumin (BSA).</li>
	<li>Centrifugar a 350 x g por 5 min a 4 °C e descartar o supernadante (SN), deixando cerca de 50 μL. NOTA: Para remover o supernaspe, despeje cuidadosamente ou pipeta a solução longe do sólido ou use um vácuo semiautomático para aspirar o supernaspe.</li>
	<li>Adicionar 50 μL de bloco FcR (ver Tabela de Materiais) por tubo (prediluted 1/50 em 1x PBS); misturar e incubar no gelo no escuro por 10 minutos.</li>
	<li>Adicione 2 mL de tampão FACS para lavar.</li>
	<li>Centrifugar a 350 x g por 5 min a 4 °C e descartar SN, deixando cerca de 50 μL.</li>
	<li>Adicione 20 μL do corante fluorescente apropriado (diluir 1/100 com 1x PBS, ver Tabela de Materiais) e deixe-o ficar por 15-30 min no gelo.</li>
	<li>Adicione 50 μL de anticorpo15 mix por tubo: CD138-BV711 (1/200 em 1x PBS) e CD45-AF700 (1/200 em 1x PBS) (ver Tabela de Materiais).</li>
	<li>Incubar no gelo no escuro por 15-30 min e adicionar 3 mL de tampão FACS.</li>
	<li>Centrifugar a 350 x g por 5 min a 4 °C e aspirar SN, deixando cerca de 50 μL. Resuspend em 200 μL de 1x PBS. Isso agora está pronto para ser analisado por citometria de fluxo.</li>
</ol>3. Coloração imunofluorescente
<ol><li>Faça a coleta de amostras.<ol><li>Incorpore o meio rim no pequeno criomold plástico com o composto de temperatura de corte ideal (OCT) (ver Tabela de Materiais).</li>
		<li>Adicione gelo seco em uma caixa de espuma de poliestireno (ver Tabela de Materiais), e coloque cuidadosamente o criomold em cima do gelo seco. Certifique-se de que os criomoldes sejam colocados em terra. NOTA: Leva de 3 a 4 minutos para o composto OCT se solidificar e ficar branco.</li>
		<li>Pegue o criomold e enrole-o em papel alumínio. Armazene-o a -80 °C até que seja mais útil. NOTA: Este pode ser armazenado a -80 °C por pelo menos 1 ano.</li>
	</ol></li>
	<li>Realizar a secção e fixação da amostra.<ol><li>Corte as amostras em seções de 4 μm, espere pelo menos 2-3 h para secar e, em seguida, fixe com acetona fria (a 4 °C) por 10 minutos. NOTA: Tenha cuidado ao usar acetona, que requer uma capa química especializada.</li>
		<li>Depois de fixar os slides, o ar seque por 0,5-1 h e armazene-os por um curto período de tempo a -20 °C, ou por um longo tempo a -80 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>Manche as amostras.<ol><li>Refixe os slides em acetona fria por 5-10 min.</li>
		<li>Deixe as seções aquecerem para RT. Use uma caneta PAP (ver Tabela de Materiais) ao redor da seção e deixe secar. NOTA: O esmalte de unha também pode ser usado. Esta etapa evita que a diluição de anticorpos flutuasse por todo o escorregador.</li>
		<li>Coloque slides em 1x Salina tamponada tris (TBS) no frasco coplin (ver Tabela de Materiais) por 20 minutos, coloque o frasco no shaker e agite suavemente.</li>
		<li>Despeje 1x TBS e encha o frasco com 1x TBS, 5% BSA e 0,1% Tween 20. Incubar por 20 minutos no shaker, agite suavemente.</li>
		<li>Leve os slides para fora e limpe a parte inferior dos slides seco. Se necessário, agite as lâminas secas. Adicione 100 μL de anticorpos conjugados25 C3-FITC (1/100) e IgG2a-PE (1/100) à seção (ver Tabela de Materiais). Incubar na RT em uma câmara umidificada por 1 h.</li>
		<li>Lave a seção 3 vezes em 1x TBS, 5% BSA e 0,1 % Tween 20 por 10 min no shaker.</li>
		<li>Agite os slides e monte a seção com um reagente antifade (ver Tabela de Materiais) e, em seguida, um deslizamento de tampa.</li>
		<li>Armazene os slides a 4 °C até visualizar sob o microscópio (por exemplo, microscópio confocal ou microscópio do sistema de imagem). Quantifique imagens usando software e subtraia sinais de fundo ao comparar a intensidade de fluorescência entre regiões.</li>
		<li>Para análise de imagens usando o software ImageJ (ver Tabela de Materiais), delineie a região desejada.</li>
		<li>Defina parâmetros padrão clicando em Analisar e, em seguida, definir medidas e área de medida para obter os resultados.</li>
		<li>Transfira os dados obtidos das janelas de medida para uma planilha. NOTA: Uma pequena área pode ser selecionada a partir da imagem como um fundo; não deve ter fluorescência.</li>
		<li>Uma vez feito, clique em Analisar para medir a região e transferir dados novamente para a planilha anterior.</li>
		<li>Repetição de passos 3.3.11-3.3.12 para várias regiões.</li>
		<li>Calcule a fluorescência média como Fluorescência celular corrigida (CCF) = Densidade integrada - (Região celular selecionada x Fluorescência de fundo média).</li>
		<li>Calcule cada região e analise os dados utilizando o software de gráficos e estatísticas (ver Tabela de Materiais).</li>
	</ol></li>
</ol>

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</ol>

Os autores declaram que não há conflito de interesses.

A LN é uma das principais causas de mortalidade em pacientes com SLE, e os fatores que agravam a doença permanecem incertos. A aplicação deste protocolo é caracterizar a função renal utilizando múltiplos métodos, incluindo medição de proteinúria, análise FACS de leucócitos renais isolados e coloração de imunofluorescência de seções renais congeladas.
Um ponto importante a considerar durante a coleta de urina é que é preciso ser consistente com a hora do dia e a localização da coleta de urina. ...

A função primária do rim é a eliminação de substâncias tóxicas através da urina, mantendo a homeostase da água e sais1. Esta função está ameaçada em pacientes com lúpus eritematoso sistêmico (SLE), levando à chamada nefrite lúpus (LN). A LN é uma consequência do sistema imunológico atacar o rim, levando a inflamações renais persistentes, perdendo assim sua capacidade de limpar resíduos do sangue e regular concentrações de sal e fluidos. Isso eventualmente levará à insuficiência renal, que pode ser fatal. Durante o processo nefrástico, células B circulantes, células T e monócitos são recrutados para o rim, secretando quimiocinas, citocinas e autoanticorpos de formação de complexos imunológicos. Isso resulta em danos nas células endoteliais, lesões membranous, atrofia tubular renal e fibrose2.
MRL/Mp-Faslpr (MRL/lpr) é um modelo clássico de rato que exibe sinais clínicos semelhantes ao lúpus que se assemelham ao SLE3 humano. Este modelo tem sido fundamental na compreensão de uma das principais causas de mortalidade em pacientes com SLE, a nefrite lúpus (LN)4. Tanto no SLE humano quanto no camundongo, a LN é caracterizada por inflamação gradual desencadeada pela deposição renal de complexos imunológicos, seguida de ativação complementar, recrutamento de células inflamatórias e perda da função renal5. A deposição do complexo imunológico é o primeiro passo para induzir a produção de quimiocina e citocinas por células renais intrínsecas, o que expande a resposta inflamatória recrutando células imunes6. O protocolo atual apresenta várias técnicas para acompanhar a progressão da doença renal que analisam a infiltração celular e a deposição do complexo imunológico.
A urina coletada toda semana permite a detecção e visualização do curso de tempo de proteinúria antes, durante e depois do início do lúpus. Proteinúria como biomarcador pode determinar a progressão biológica da LN. Outras vantagens dessa técnica são que ela é não invasiva, econômica e fácil de implementar7. Quando o rim está funcionando perfeitamente, o nível de proteinúria é consistentemente baixo; no entanto, em camundongos MRL/lpr, após 8-9 semanas de idade, observa-se um aumento gradual do nível de proteinúria, que eventualmente é alto o suficiente para causar insuficiência renal8. Várias tiras de reagente e reagentes colorimétricos estão disponíveis comercialmente para monitorar o problema. No entanto, o ensaio de Bradford é barato e muito preciso na determinação do aparecimento de proteinúria e o curso de nefrite lúpus. Este ensaio é rápido, e o reagente não é afetado pela presença de solventes, buffers, agentes de redução e agentes de corte de metal que podem estar em sua amostra 9,10,11.
Um aspecto importante a considerar é a infiltração celular no rim. Esses infiltrados promovem a patogênese desencadeando a secreção de fatores solúveis, como citocinas, para piorar a inflamação12. Para entender melhor quais populações celulares estão presentes nos infiltrados, um método útil é isolar os leucócitos13. Aqui, a detecção de infiltração renal de células B é usada como exemplo. O procedimento começa com um processo de digestão com desoxyribonuclease (DNase) e colagenase, seguido pela separação gradiente de densidade que remove detritos, glóbulos vermelhos e granulócitos densos. A razão para isolar células B (CD19+) e células plasmáticas (CD138+) é que os rins de lúpus podem concentrar essas células14. Sugere-se que a presença de células B em pequenos agregados no rim pode indicar expansão clonal e, consequentemente, produção de imunoglobulina (Ig). As células plasmáticas são bem conhecidas por estarem presentes nestes agregados, bem como15. Uma vez que os leucócitos tenham sido isolados, a triagem celular ativada pela fluorescência (FACS) pode ser usada para analisar as células de interesse ao coloração com diferentes anticorpos conjugados pela fluorescência.
A imunofluorescência é um dos métodos de detecção de imunohistoquímica (IHC) que permite a visualização fluorescente de proteínas em amostras de tecido renal de 4 μm de espessura. Outros métodos de detecção de IHC dependem da natureza dos analitos, química de vinculação e outros fatores16. A imunofluorescência é um método de identificação rápida que expõe o antígeno ao seu anticorpo de contrapartida rotulado com um fluorocromo específico (ou um corante fluorescente). Quando excitado, produz luz que um microscópio de fluorescência pode detectar. Esta técnica pode ser usada para observar a deposição do complemento C3 e IgG2a17. A ativação excessiva da cascata de complementos pode estar associada a uma resposta imune descontrolada e perda de função18. A deposição imune de autoanticorpos de DNA anti-dsDNA (anti-dsDNA) no rim é uma grande preocupação19, onde aqueles com isótipo IgG2a foram associados com LN20. Especificamente, anticorpos anti-dsDNA apresentam mais patogenicidade e afinidade com materiais nucleares, formando complexos imunológicos21. Quando o IgG2a está presente, a cascata complementar, incluindo c3, é ativada para limpar os complexos imunológicos22. Os marcadores C3 e IgG2a podem ser quantificados individualmente ou sobrepostos para estabelecer sua correlação.
Notavelmente, a medição da creatinina sé serum é outra técnica confiável que pode ser usada em conjunto com hematuria microscópica e biópsias renais para diagnosticar LN23. No entanto, a presença de proteinúria é um forte indicador de danos glomerulares. Nesse sentido, o monitoramento do nível de proteinúria durante o lúpus pode detectar o aparecimento da doença e complementar outros métodos para o diagnóstico de lúpus. Além disso, os complexos imunológicos depositados em glomeruli podem induzir uma resposta inflamatória, ativar o sistema complementar e recrutar mais células inflamatórias. Outro ponto importante deste protocolo é a infiltração de células B no rim. Isso, juntamente com as células T infiltradas, amplifica as respostas imunes locais que desencadeiam danos nos órgãos. É importante ressaltar que a classificação da LN não se baseia apenas em alterações morfológicas glomerulares vistas na microscopia, mas também depósitos imunológicos observados com imunofluorescência. Portanto, neste protocolo, métodos precisos e econômicos para a análise da função renal são oferecidos em ambientes laboratoriais.

<table><tbody><tr><td>10x Tris-Buffered Saline (TBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>J60764. K2</td><td></td></tr><tr><td>2-mercaptoetanol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Humano/Rato C3</td><td>Cedarlane</td><td>CL7632F</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Rato CD138 BV711</td><td>Biolegend</td><td>142519</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Rato CD45 AF700</td><td>Biolegend</td><td>103127</td><td></td></tr><tr><td>Soro Bovino Albumina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9418-100G</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio</td> Confocal <td>11088882001</td><td></td><td>Sigma-Aldrich</td> de Colagenase</tr><tr><td>LSM 880</td><td>Zeiss</td><td>LSM 880</td><td></td></tr><tr><td>Frasco de Coplin</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-212-281</td><td></td></tr><tr><td>Cryomold</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9511236</td><td></td></tr><tr><td>Gradiente de densidade médio</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1440-02</td><td>Percoll</td></tr><tr><td>DEPC-Água</td><td>tratada Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9906</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4527</td><td></td></tr><tr><td>dsDNA-EC</td><td>InvivoGen</td><td>tlrl-ecdna</td><td></td></tr><tr><td>Ácido etilenodiaminotetracético</td><td>Fisher Scientific</td><td>S311-500</td><td>EDTA</td></tr><tr><td>EVOS M5000 Sistema de imagem de microscópio</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AMF5000</td><td></td></tr><tr><td>FACS Fusion Cell classificador</td><td>BD Biosciences</td><td>FACS Fusion</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Soro Bovino - Premium, Inativado por Calor</td><td>R& D systems</td><td>S11150H</td><td></td></tr><tr><td>Placas de Poliestireno de 96 Poços Fisherbrand</td><td>Prisma Graphpad Fisher Scientific</td><td>12-565-501</td><td></td></tr><tr><td></td><td>GraphPad N</td><td>/A</td><td></td></tr><tr><td>Hank' s Solução salina balanceada</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14175-079</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>Software ImageJ</td><td>National Institutes of Health</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Lactobacillus reuteri Kandler et al.</td><td>ATCC</td><td>23272</td><td></td></tr><tr><td>MEM aminoácidos não essenciais</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>MRL/MpJ-Fas lpr /J Ratos (MRL/lpr)</td><td>Jackson Lab</td><td>485</td><td></td></tr><tr><td>Esmalte de unhas</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Qualquer loja convencional</td></tr><tr><td>O.C.T composto</td><td>Tisse-Tek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>PAP caneta</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z377821</td><td></td></tr><tr><td>Moldes de incorporação descartáveis Peel-A-Way</td><td>Polysciences</td><td>R-30</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato (PBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>70011069</td><td></td></tr><tr><td>Pierce 20x TBS Buffer</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>28358</td><td></td></tr><tr><td>Pierce Coomassie Plus (Bradford) Kit</td> <td>de ensaioThermo Fisher Scientific</td><td>23236</td><td>Padrão de albumina incluído</td></tr><tr><td>ProLon Gold Antifade Mountant</td><td>ThermoFisher</td><td>P36934</td><td></td></tr><tr><td>Purificado Rato Anti-Rato CD16/CD32</td><td>BD Biosciences</td><td>553141</td><td>bloco FcR</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>Piruvato de sódio</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>SpectraMax M5</td><td>Molecular Devices</td><td>N/A</td><td>SoftMax Pro 6.1 software</td></tr><tr><td>Filtros de células estéreis 100 &micro; M</td><td>Fisher Scientific</td><td>22363549</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td>Cloridrato de Vancomicina</td><td>Goldbio</td><td>V-200-1</td><td></td></tr><tr><td>Zombie Aqua</td><td>Biolegend</td><td>Corante</td><td>fluorescente 423102 para análise de citometria de fluxo</td></tr></tbody></table>

análises de proteinúria, infiltração renal de leucócitos e deposição renal de proteínas em camundongos mrl/lpr propensos a lúpus

Analyses of Proteinuria, Renal Infiltration of Leukocytes, and Renal Deposition of Proteins in Lupus-prone MRL/lpr Mice

O lúpus eritematoso sistêmico (SLE) é uma doença autoimune sem cura conhecida e é caracterizada por inflamação persistente em muitos órgãos, incluindo os rins. Sob tais circunstâncias, o rim perde sua capacidade de limpar resíduos do sangue e regular concentrações de sal e fluidos, eventualmente levando à insuficiência renal. As mulheres, particularmente as em idade fértil, são diagnosticadas nove vezes mais frequentemente do que os homens. A doença renal é a principal causa de mortalidade em pacientes com SLE. O presente protocolo descreve um método rápido e simples para medir os níveis de proteína excretada na urina coletada, acompanhando a progressão do lúpus ao longo do tempo. Além disso, uma abordagem para isolar as células mononucleares renais é fornecida com base na seleção de tamanho e densidade para investigar a infiltração renal de leucócitos. Além disso, um método imunohistoquímico foi desenvolvido para caracterizar a deposição proteica na infiltração glomeruli e leucócito no espaço tubulointersticial. Juntos, esses métodos podem ajudar a investigar a progressão da inflamação crônica associada aos rins de camundongos mrl/lpr propensos ao lúpus.

O protocolo utiliza vários métodos para avaliar camundongos MRL/lpr para nefrite lúpus. Primeiro, um procedimento é descrito para estudar o aumento dos níveis de proteinúria devido à disfunção renal ao longo do tempo. Como mostrado na Figura 1, os camundongos fêmeas foram tratados com gavage oral de 200 μL de soro fisco tamponado (1x PBS) como o grupo controle e o probiótico Lactobacillus reuteri como o grupo de tratamento, numa concentração de 109 cfu/mL, duas vezes por ...

O presente protocolo descreve um método para rastrear a progressão do lúpus em camundongos. Dois procedimentos adicionais são apresentados para caracterizar a nefrite lúpus com base na infiltração celular e na deposição de proteínas nos rins.

Análises de Proteinúria, Infiltração Renal de Leucócitos e Deposição Renal de Proteínas em Camundongos MRL/lpr propensos a Lúpus

Systemic lupus erythematosus (SLE) is an autoimmune disorder with no known cure and is characterized by persistent inflammation in many organs, including ...

Esses métodos podem ajudar a investigar a progressão da inflamação crônica associada aos rins em pacientes com lúpus. Estamos oferecendo uma alternativa confiável e econômica que pode ser usada para monitorar o curso de doenças em lúpus. Comece a esterilizar o capô pulverizando 70% de etanol e coloque uma folha de plástico estéril na superfície.Em seguida, prepare dicas, tubos de 1,5 mililitro e uma pipeta para coletar cerca de 20 microliters da urina. Pegue a gaiola e pulverize 70% de etanol antes de colocá-la dentro do capô. Depois, segure o mouse com uma mão e use a outra mão para massagear suavemente a área ventral de cima para baixo.Usando um tubo de 1,5 mililitro ou pipeta, colete a urina diretamente. Ou se a amostra cair, colecione-a da folha de plástico. Então coloque o rato de volta na gaiola.Corte os rins dissecados em tamanho de grão e digerir em cinco mililitros de tampão de digestão contendo Colagenase e DNase 1 em RPMI 1640 médio contendo HEPES por uma hora com agitação suave contínua a 37 graus Celsius. Adicione 10 mililitros de PBS gelado contendo 10 mililitros de EDTA e incubar por 10 minutos no gelo. Em seguida, vórtice a suspensão duas vezes.Posteriormente, filtre a suspensão da célula através de um coador de 100 micrômetros e lave com 10 mililitros de HBSS cheios. Depois, centrífuga a 350 vezes G por 10 minutos em temperatura ambiente. Prepare uma solução percoll isotônica de 30, 37% e 70% de estoque e adicione uma camada de solução percoll de 37% em cima da solução de 70%.Suspenda as células em cinco mililitros de 30% de estoque isotônico Percoll. Usando uma pipeta Pasteur carga lentamente 37% de cinco mililitros superiores e 70% de cinco mililitros na parte inferior, fazendo o gradiente percoll isotônico de estoque. Em seguida, centrífuga com o número nove e para baixo número zero a 1000 vezes G por 30 minutos em temperatura ambiente.Depois, colete leucócitos da interface de 37 a 70% e suspenda-os em cinco mililitros de C 10. Novamente, centrífuga a 350 vezes G por 10 minutos a quatro graus Celsius. Posteriormente, suspenda a pelota de célula em três mililitros de tampão de fax e centrífuga a 350 vezes G por cinco minutos a quatro graus Celsius.Em seguida, descarte o supernatante deixando cerca de 50 microliters do volume total. Adicione 50 microliters de bloco receptor FC por tubo. Seguindo esta mistura e incubar no gelo no escuro por 10 minutos.Mais tarde, adicione dois mililitros de tampão de fax para lavagem. Em seguida, centrífuga a 350 vezes G por cinco minutos a quatro graus Celsius e descartar o supernacente deixando cerca de 50 microliters do volume total. Em seguida, adicione 20 microliters do corante fluorescente apropriado e deixe-o ficar por 15 a 30 minutos no gelo.Adicione 50 microliters de mistura de anticorpos por tubo contendo CD 138 violeta brilhante sete 11 e CD 45 Alexa Fluor 700 e incubar no gelo no escuro por 15 a 30 minutos. Depois, adicione três mililitros de tampão de fax. Centrifugar a 350 vezes G por cinco minutos a quatro graus Celsius.Remova o supernatante por vácuo deixando cerca de 50 microliters do volume total. Mais tarde, suspenda a pelota celular em 200 microliters da PBS. Para coletar a amostra incorpore o meio rim no pequeno criomold plástico com o composto de temperatura de corte ideal.Em seguida, adicione gelo seco em uma caixa de espuma de poliestireno e coloque cuidadosamente o criomold em cima do gelo seco. Em seguida, remova a criomold, enrole-a em papel alumínio e armazene-a a menos 80 graus Celsius até usar mais. Em seguida, fixar o seco em quatro seções de micrômetros com acetona fria por 10 minutos.Depois de fixar os slides, o ar seco por 0,5 a uma hora e armazená-los a menos 20 graus Celsius por um curto período de tempo ou menos 80 graus Celsius por um longo tempo. Para colorar as amostras, refixe os slides em acetona fria por cinco a 10 minutos e deixe que as seções aqueçam até a temperatura ambiente. Depois, usando uma caneta de tapinha, desenhe um círculo hidrofóbico ao redor da seção e deixe-o secar.Em seguida, coloque slides em TBS no frasco de Copeland por 20 minutos e agite suavemente colocando o frasco no shaker. Posteriormente, despeje o TBS e encha o frasco com TBS 5%BSA e 0,1%TW 20. Mais tarde, incubar o frasco por 20 minutos sacudindo suavemente o shaker.Em seguida, tire os slides e limpe a parte inferior dos slides. Adicione 100 microliters de anticorpos conjugados C3 encaixe C e IgG2 APE à seção e incubar a temperatura ambiente em uma câmara umidificada por uma hora. Lave a seção três vezes em PBS 5%BSA e 0,1%TW 20 por 10 minutos no agitador e depois agite os slides.Monte a seção com um reagente anti-fade e, em seguida, com um deslizamento de cobertura. Em seguida, armazene os slides a quatro graus Celsius até visualizar sob o microscópio. Para análise de imagem usando o software imagem J, delineie a região desejada.Depois, defina parâmetros padrão clicando em analisar e, em seguida, definir medidas e medir a área para obter os resultados. Em seguida, transfira os dados obtidos das janelas de medida para uma planilha. Uma vez feito, clique em analisar para medir a região e transferir os dados novamente para a planilha anterior.Os níveis de proteína na urina dos camundongos MRL LPR foram detectados ao longo do tempo em que foram tratados com soro fisiológico tamponado fosfato como o grupo controle e lactobacillus reuteri como o grupo de tratamento. O grupo de camundongos tratado com L.reuteri em uma progressão de proteinúria mais agressiva do que o grupo controle. A análise de fax foi realizada para os leucócitos renais isolados analisarem as células plasmáticas.Além disso, os camundongos foram tratados com vancomicina ou vancomicina, juntamente com DNA duplo encalhado de Escherichia coli. Embora espera-se que o DNA duplo encalhado de Escherichia coli desencadeie a infiltração renal, nenhuma diferença significativa foi encontrada na porcentagem de células plasmáticas. O complemento C3 e IgG2a foram detectados através de coloração de imunofluorescência em seções renais mrl ipr femininas.Os fatores ambientais eficazes na deposição renal de C3 e IgG2a foram comparados para o pão de camundongos interno na instalação animal e aqueles comprados de um vendedor. A análise imunohistoquímica não mostrou diferença entre os dois grupos. Adicionar cada camada da solução de estoque percentual ISO 20 Percoll pode ser desafiador, e se eles se misturarem, você tem que começar de novo.Este procedimento ajuda com o citómetro de fluxo e em experimentos vitter, de modo que você não pode estudar o tipo diferente de células renais de populações. Este procedimento nos permite estudar as células B infiltradas nos rins e não há muita informação na literatura.

analyses-proteinuria-renal-infiltration-leukocytes-renal-deposition

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

A transferência de linfócitos bm12 para um receptor C57BL/6 é um modelo estabelecido de lúpus eritematoso sistêmico. Aqui descrevemos como iniciar a doença usando este modelo e como caracterizar células T foliculares auxiliares, células B do centro germinativo e células plasmáticas por citometria de fluxo.

O Inducible Modelo BM12 de Lúpus Eritematoso Sistêmico (LES) em camundongos C57BL / 6

Aqui, descrevemos a indução de síndrome nefrótica experimental em ratos 129S1/SvImJ por injeção retrobulbar rápida de doxorrubicina. Também tratamos nefrótico ratos com pelotas de liberação sustentada contendo aprotinina para inibir a atividade de protease de serina urinária e evitar a retenção de sódio.

Indução de síndrome nefrótica em camundongos por injeção Retrobulbar de doxorrubicina e na prevenção da retenção de Volume por liberação sustentada aprotinina

Este protocolo descreve um rim completo check-up que deve ser realizado em modelos do rato da doença glomerular. Os métodos permitem análise detalhada funcional, estrutural e mecanicista da função glomerular, que pode ser aplicada a todos os modelos do rato da doença glomerular.

Avaliação da função renal em modelos do rato da doença Glomerular

Aqui, apresentamos três métodos para avaliar a migração de neutrófilos e infiltração tanto in vivo quanto in vitro. Esses métodos podem ser usados para descobrir terapêuticas promissoras visando a migração de neutrófilos.

Detectando migração e infiltração de neutrófilos em camundongos

microRNAs estão envolvidos na patogênese da nefropatia por IgA. Desenvolvemos um método confiável para detectar os níveis de expressão de microRNA nos rins de um modelo de nefropatia por IgA em camundongos (camundongos HIGA). Este novo método facilitará a verificação do envolvimento de miRNAs na nefropatia por IgA.

Detecção da Expressão de MicroRNA nos Rins de Camundongos Nefropáticos com Imunoglobulina A

Aqui, apresentamos um protocolo utilizando microscopia de 2 fótons em ratos Wistar Fromter de Munique com glomérulos superficiais para quantificar os efeitos da obstrução ureteral prolongada na dinâmica e função glomerular.

Usando a microscopia de 2-fótons para quantificar os efeitos da obstrução ureteral unilateral crônica nos processos glomerulares

Este protocolo fornece um método de isolamento de DNA simples e econômico para a análise de alterações da microbiota intestinal murina durante o desenvolvimento de doenças autoimunes.

Análise da dinâmica da microbiota fecal em camundongos propensos a lúpus usando um método de isolamento de DNA simples e econômico

Este protocolo descreve um método para induzir obstrução ureteral unilateral (UUO) em camundongos para estudar a progressão da fibrose tecidual na nefropatia obstrutiva. Inclui procedimentos cirúrgicos, cuidados pós-operatórios e métodos para avaliação da fibrose.

Modelo de obstrução ureteral unilateral para investigação de fibrose intersticial renal

Aqui, apresentamos um protocolo detalhado para análise proteômica de todo o rim, túbulo cortical isolado e proteomas medulares. O estudo também compara proteomas regionais em um modelo de camundongo diabético e camundongos não diabéticos.

Análise proteômica comparativa de rins inteiros, medula e túbulos corticais na patogênese diabética da lesão renal em camundongos

Esse protocolo descreve um procedimento de sobrevivência para linfadenectomia renal bilateral murina segura e bem tolerada.

Linfodenectomia Renal Bilateral Murina

Aprenda a avaliar proteinúria, infiltração de leucócitos e deposição de proteínas em rins de camundongos MRL/lpr para estudar a progressão da nefrite lúpica. Este método oferece uma alternativa confiável e econômica para pesquisa em imunologia.

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Análises de Proteinúria, Infiltração Renal de Leucócitos e Deposição Renal de Proteínas em Camundongos MRL/lpr propensos a Lúpus

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