Name: Remoção de olhos em larvas de zebrafish vivos para examinar o crescimento e desenvolvimento dependentes da inervação do sistema visual (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min
Description: Aprenda a remover unilateralmente o olho em larvas de zebrafish vivos para estudar o desenvolvimento do tecto óptico dependente da inervação retiniana. Este método permite comparar lobos inervados e desnervados no mesmo animal.

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O financiamento para este trabalho foi apoiado principalmente por fundos inativos da Reed College para a KLC, fundos da Helen Stafford Research Fellowship para a OLH, e uma Reed College Science Research Fellowship para yk. Este projeto começou no laboratório de Steve Wilson como uma colaboração com a HR, que foi apoiada por uma Wellcome Trust Studentship (2009-2014). Agradecemos a Máté Varga, Steve Wilson e outros membros do laboratório Wilson pelas discussões iniciais sobre este projeto, e agradecemos especialmente a Florencia Cavodeassi e Kate Edwards, que foram as primeiras a ensinar a KLC como montar embriões em agarose e realizar dissecções cerebrais de zebrafish. Agradecemos também a Greta Glover e Jay Ewing pela ajuda na montagem do nosso dispositivo de afiação de agulha de tungstênio.

Os métodos deste artigo foram conduzidos de acordo com as diretrizes e aprovação dos Comitês Institucionais de Cuidados e Uso de Animais da Reed College e university College London. Consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes sobre as cepas de zebrafish utilizadas neste estudo.
1. Prepare materiais e ferramentas
<ol><li>Faça soluções.<ol>
<li>Faça o embrião médio (E314) diluindo um estoque de 60x (300 mM NaCl, 10,2 mM KCl, 20 mM CaCl 2-dihidrato e 20 mM MgCl2-hexahidrato em água desionizada, autoclavada e armazenada à temperatura ambiente). Adicione 160 mL de 60x E3 a 10 L de água desionizada. Armazene em temperatura ambiente.</li>
		<li>Faça 1% de baixo ponto de fusão (LMP) agarose em E3. Dissolver 1 g de LMP agarose em 100 mL de E3 fervendo no micro-ondas por 1-2 min em alta potência. Aliquot derretido agarose em tubos de microfuça de 1,7 mL, e armazenar a 4 °C. Ferva em um banho de água e segure em um bloco de calor de 40 °C quando estiver pronto para uso para incorporação.</li>
		<li>Faça a solução isotônica de Ringers Modificados da Marc (MMR15) diluindo uma ação de 10x (1 M NaCl, 20 mM KCl, 10 mM MgSO4, 20 mM CaCl 2-dihidrato, 50 mM HEPES, pH ajustado para 7,5 com 10 M NaOH, depois autoclavado e armazenado à temperatura ambiente). Adicione 10 mL de 10x MMR a 90 mL de água deionizada.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Despeje as placas Sylgard de acordo com as instruções do fabricante, permitindo que elas sequem e sequem por vários dias16.</li>
	<li>Afiar eletróticamente agulhas de tungstênio (protocolo modificado a partir de 17).<ol>
<li>Primeiro, prepare uma solução KOH de 10% (w/v) adicionando 200 mL de água desionizada a um frasco de vidro de boca larga com uma tampa de rosca. Mexa lentamente em 20 g de pelotas KOH. NOTA: Esta solução cáustica é altamente exotérmica. Use luvas e proteção ocular, e mexa a solução no capô.</li>
		<li>Corte um fio de tungstênio de 2-3 cm e insira-o no suporte da agulha.</li>
		<li>Conecte os fios de cátodo e ânodo à fonte de alimentação. Conecte o clipe de jacaré na extremidade do fio do cátodo a um clipe de papel parcialmente endireitado e insira o clipe de papel na solução KOH, anexando-o ao lado do frasco.</li>
		<li>Em seguida, coloque o clipe do jacaré do fio ânodo no pescoço do suporte da agulha. Ligue a energia (para ~20 V) e mergulhe o fio de tungstênio na solução KOH, puxando o fio para fora da solução em um ângulo para afiar eleticamente o fio em uma ponta fina. NOTA: As bolhas virão do clipe de papel à medida que a reação prossegue.</li>
		<li>Verifique a ponta da agulha sob o microscópio de dissecação para garantir que ela esteja afiada o suficiente.</li>
		<li>Enxágüe a agulha com água deionizada para remover todo o resíduo KOH. Faça várias agulhas com antecedência e mantenha-as até as cirurgias larvais e dissecções.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Faça slides com câmara para imagens de espécimes de zebrafish com um microscópio confocal vertical.<ol>
<li>Obtenha slides de microscópio de vidro e resina epóxi em duas partes (veja a Tabela de Materiais). Misture o epóxi de acordo com as instruções da embalagem, e pinte anéis ou retângulos espessos nos slides de vidro. Deixe os slides curarem e secarem no capô por pelo menos 24 horas antes de usar.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Coleta e criação de embriões
<ol><li>Par de peixes adultos machos e fêmeas dos genótipos desejados em caixas de reprodução no final da tarde/início da noite. Na manhã seguinte, depois de desovarem, colete ovos recém-fertilizados com um coador de malha e transfira-os para a E3 em pratos petri de 100 mm.</li>
	<li>Incubar os embriões a ~27,5 °C com um ciclo escuro de 14 h/10 h até o dia da cirurgia. Mude o E3 diariamente ou conforme necessário.</li>
	<li>Alimente as larvas usando um cabide cheio de rotifers colhidos uma vez por dia, começando em 5 dias após a fertilização (dpf) ou um dia após a cirurgia. Depois que as larvas tiverem várias horas para comer, troque o E3 para remover quaisquer rotifers restantes e resíduos. NOTA: Não alimente larvas no dia da cirurgia.</li>
</ol>3. Prepare larvas para cirurgia
<ol><li>No dia da cirurgia, use uma pipeta pasteur de vidro larga para transferir 10-15 larvas para uma placa de Petri de 35 mm cheia de E3 fresca.</li>
	<li>Anestesiar as larvas adicionando 3-5 gotas de 0,4% w/v solução tricaine (0,4 g Tricaine dissolvido em 210 mM Tris, pH 9; solução final ajustada a um pH de 7,4 se necessário18) ao prato para uma concentração final de ~0,0015% w/v Tricaine. Procure por falta de resposta ao toque para determinar se as larvas estão adequadamente anestesiadas. Se eles ainda estiverem respondendo ao toque após ~3 min, adicione mais 2-3 gotas de 0,4% c/v solução tricaine e reavalie. NOTA: Nesta fase de desenvolvimento, é possível monitorar o fluxo sanguíneo e a frequência cardíaca, além da motilidade sob o microscópio dissecando.</li>
	<li>Imobilize as larvas anesterizadas de zebrafish incorporando-as em 1% de LMP agarose dissolvida em E3.<ol>
<li>Primeiro, coloque a tampa de uma placa de Petri de 35 mm de frente para cima sob o microscópio de dissecação. Em seguida, leve uma larva para cima em uma pipeta pasteur de vidro estreita com apenas uma pequena quantidade de E3.</li>
		<li>Em seguida, aspire ~200 μL de derretido, quente (~40 °C) 1% LMP agarose na pipeta com a larva. Por fim, esguiche a larva e agarose na tampa da placa de Petri de cabeça para baixo.</li>
		<li>Use uma agulha de tungstênio maçante para manobrar rapidamente, mas suavemente, a larva para que ela seja lateral, com um olho voltado para cima. Aguarde a agarose para definir (~5 min). NOTA: Se a agarose endurecer enquanto a larva não estiver lateral, liberte-a da agarose (como descrito na etapa 5) e devolva-a ao prato com E3 e tricaine.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Remoção ocular
<ol><li>Uma vez que a agarose é definida, e a larva é posicionada lateralmente, use a ponta de uma agulha de tungstênio muito fina e eletróticamente afiada para perfurar a pele ao redor do olho, seguindo a borda da órbita ocular.</li>
	<li>Em seguida, deslize a borda da agulha (não a ponta) sob o olho do lado temporal-ventral do olho. Use pressão controlada para soltar o olho da tomada.</li>
	<li>Use fórceps cirúrgicos muito finos para remover o olho, beliscando o nervo óptico e empurrando o olho de medial para lateral. Alternativamente, basta continuar pressionando o olho dorsal e anteriormente com o lado da agulha, eventualmente cortando através do nervo óptico e liberando o olho. NOTA: Se tecidos diferentes do olho forem acidentalmente esfaqueados durante a cirurgia, mate a larva de forma rápida e humana por decapitação rápida.</li>
</ol>5. Cuidados pós-operatórios até o ponto final experimental
<ol><li>Após a remoção bem sucedida do olho, cubra a agarose com a solução MMR.</li>
	<li>Liberte cada larva da agarose escovando suavemente uma agulha de tungstênio em torno de sua cabeça e, em seguida, em torno de seu corpo enquanto estabiliza a tampa da placa de Petri com fórceps.</li>
	<li>Transfira as larvas de um olho só para uma placa de Petri de 35 mm que contém MMR suplementada com uma diluição de 1:100 de um coquetel de penicilina/estreptomicina. Incubar os embriões a ~27,5 °C com um ciclo escuro de 14 h/10 h. NOTA: Esta solução isotônica de RMM suplementada com antibióticos inicialmente auxilia a cicatrização e sobrevivência larval. Cada prato pode conter até 15 larvas em recuperação.</li>
	<li>No dia seguinte, devolva as larvas para a E3. A partir da tarde seguinte à cirurgia, alimentado larvas (~6 dpf e mais velhos) usando um cabide cheio de rotifers colhidos uma vez por dia. Depois que as larvas tiverem várias horas para comer, troque o E3 para remover quaisquer rotifers restantes e resíduos.</li>
</ol>6. Fixação de larvas
<ol><li>Uma vez que as larvas tenham atingido o estágio de desenvolvimento desejado para análise, anestesia-as com uma dose letal de tricaine (~0,4% de concentração final) até que seus corações parem.</li>
	<li>Pipeta até 30 larvas por tubo microfuça de 1,5 mL. Remova o excesso de E3 e adicione 0,5-1 mL de solução fixa (4% paraformaldeído (PFA) e 4% de sacarose em soro fisiológico tamponado de fosfato (PBS)) para fixar o tecido. Incubar as larvas durante a noite a 4 °C.</li>
	<li>Lave as larvas com PBS no dia seguinte removendo o fixador e enxaguando as larvas 3-4 vezes com PBS. Armazene as larvas a 4 °C por até 7 dias antes da dissecação.</li>
</ol>7. Dissecando larvas para revelar cérebros (adaptados a partir de 15)
<ol><li>Suspenda as larvas fixas em gotículas PBS em uma placa Sylgard sob um microscópio dissecando. Fixá-los lateralmente colocando dois pinos de tungstênio (agulhas de tungstênio tipicamente antigas que têm menos de 2 cm) através do notochord, com um pino apenas posterior à área pigmentada cobrindo a região de aorta-gonad-mesonephros (AGM) e outro em linha com a extremidade da extensão da gema. NOTA: Posicione os pinos de tungstênio no menor número possível de tentativas, pois o tecido se tornará mais friável a cada punção.</li>
	<li>Use uma agulha de tungstênio muito afiada e fórceps afiados para expor o cérebro removendo, nesta ordem, o olho(s), orelha, mandíbula, trato digestivo e pele craniana dorsal.<ol>
<li>Primeiro, remova o olho usando uma técnica semelhante à remoção cirúrgica dos olhos na etapa 4. Em seguida, despreecupe a larva e gire-a para o lado oposto, para que o outro olho seja acessível e repita. Alternativamente, cutuque a agulha através da mandíbula para o outro lado e remova o olho sem despinar. NOTA: Os olhos podem ser coletados neste momento se a análise desse tecido for desejada (semelhante a 19).</li>
		<li>Em seguida, use a agulha de tungstênio para raspar do temporal para o lado ventral da orelha. Na mesma ação/movimento, leve a agulha posterior à mandíbula e puxe suavemente anteriormente até que a orelha e a mandíbula sejam removidas.</li>
		<li>Use fórceps para puxar os órgãos ventral e qualquer gema restante para fora.</li>
		<li>Finalmente, faça uma incisão rasa na pele craniana dorsal perto da junção entre o cérebro traseiro e a medula espinhal. Levante a pele com os fórceps e puxe-a anteriormente e ao redor do telencephalon. Se isso se mostrar muito difícil, comece com a incisão inicial no cérebro traseiro e puxe a pele primeiro lateralmente e depois ventrally e anteriormente, tomando muito cuidado para não arranhar as bordas laterais do tectum. NOTA: Como o cérebro médio é objeto de estudo, o cérebro traseiro pode ser cortado; no entanto, uma incisão profunda pode resultar em decapitação.</li>
		<li>Remova qualquer tecido restante com fórceps. Despreecupe a larva e transfira para PBS em um tubo de microfuça de 1,5 mL. NOTA: Deixe a cauda presa ao cérebro para melhor visibilidade ao executar protocolos de valor integral.</li>
	</ol>
</li>
</ol>8. Desidratação cerebral e armazenamento
<ol><li>Remova o PBS do cérebro e adicione 1 mL de PBS contendo TritonX-100 (PBST) de 0,1%. Incubar por 5-10 min em temperatura ambiente.</li>
	<li>Remova o PBST e substitua-o por uma solução de metanol:PBST 50:50. Incubar por 5-10 min em temperatura ambiente.</li>
	<li>Lave os cérebros com 100% de metanol (MeOH) duas vezes por 5 min cada a temperatura ambiente.</li>
	<li>Armazene os cérebros em 100% MeOH a -20 °C por pelo menos 16 h antes de realizar a imunohistoquímica ou outros procedimentos de totalidade. NOTA: Os cérebros podem ser armazenados em MeOH por até 2 anos a -20 °C.</li>
</ol>9. Imunohistoquímica
NOTA: Protocolos estabelecidos para muitas técnicas úteis de integral em zebrafish podem ser encontrados no ZFIN20. Este manuscrito fornece exemplos comparando larvas de um olho e dois olhos que estavam imunossuídas com anticorpos que reconhecem a proteína fluorescente vermelha (RFP), que é expressa em axônios nervosos ópticos na linha Tg[atoh7:RFP] (Figura 2), ou histone H3 (PH3), que destaca células mitóticas (Figura 3). Um protocolo padrão de imunohistoquímica para embriões e larvas de todo o montante é resumido abaixo.
<ol><li>Primeiro, reidratar os cérebros larvais com uma série classificada de MeOH:PBST lava à temperatura ambiente incubando os espécimes em 50:50 MeOH:PBST por 5 min, depois em 30:70 MeOH:PBST por 5 min, e terminando com 3 lavagens de PBST.</li>
	<li>Para permeabilizar os cérebros, incuba-os em PBST suplementado com proteinase K (PK) em uma concentração final de 20 μg/ml PK por 30 min a 37 °C. Armazene alíquotas de 10 mg/mL PK a -20 °C e descongele-as antes de usá-las.</li>
	<li>Remova a solução PK e lave qualquer enzima restante enxaguando os cérebros com PBST 3 vezes ao longo de 15 minutos.</li>
	<li>Refixe os cérebros permeabilizados incubando-os em 4% pfa por 20 min a 25 °C (ou temperatura ambiente). Em seguida, remova o PFA e lave qualquer fixação restante enxaguando os cérebros 3 vezes mais de 15 minutos com PBST.</li>
	<li>Substitua a lavagem final pbst por tampão de imunobloqueio (IB) recém-feito (soro de cabra 10% normal e 1% DMSO em PBST) e incubar à temperatura ambiente por pelo menos 1 h.</li>
	<li>Diluir anticorpos primários no tampão IB na concentração apropriada (por exemplo, 1:500 para RFP e 1:300 para anticorpos PH3).</li>
	<li>Remova o tampão IB dos cérebros e substitua-o pela diluição do anticorpo primário. Incubar durante a noite a 4 °C em um agitador orbital com balanço suave. Certifique-se de que os tubos estão firmemente descansando em seus lados.</li>
	<li>Na manhã seguinte, remova a solução de anticorpos primária com uma micropipette, enxágue algumas vezes em PBST, e depois lave os cérebros em PBST em temperatura ambiente por 4 x 30 min. NOTA: As diluições de anticorpos primários podem ser reutilizadas uma vez dentro de ~7 dias se armazenadas a 4 °C.</li>
	<li>Enxágüe os cérebros no tampão IB enquanto dilui anticorpos secundários no tampão IB na concentração apropriada (por exemplo, 1:500 para Alexa-fluor 568 anti-coelho).</li>
	<li>Remova o tampão IB e substitua-o pela diluição de anticorpos secundários. Incubar durante a noite a 4 °C em um agitador orbital com balanço suave dos tubos descansando em seus lados.</li>
	<li>Na manhã seguinte, remova a solução secundária de anticorpos, enxágue com PBST e depois lave os cérebros em PBST em temperatura ambiente por 4 x 30 min.</li>
	<li>Contra-retenção com 4',6-diamidino-2-fenildole (DAPI) ou ToPro3 (1:5.000 em PBST a 4 °C durante a noite).</li>
	<li>Na manhã seguinte, transfira os cérebros larvais para a PBS e prossiga para as etapas de montagem e imagem listadas abaixo.</li>
</ol>10. Montagem e imagem
<ol><li>Fixar um deslizamento de câmara na tampa de uma placa de Petri de 100 mm com graxa de vácuo.</li>
	<li>Transfira as larvas imunossuadas e processadas para uma placa de poço ou deslizamento de depressão para vê-las com um microscópio dissecando.</li>
	<li>Monte as larvas no escorregador em colunas de 1% de LMP agarose.<ol>
<li>Usando uma pipeta pasteur de vidro, coloque uma larva no escorregador de câmara, depositando o mínimo de PBS possível. Com a mesma pipeta, cubra a larva com agarose LMP derretida de 1% (~40 °C).</li>
		<li>Com uma agulha de tungstênio ou fórceps, desenhe a agarose em uma coluna e, em seguida, posicione a larva o mais simétrico possível, com a superfície dorsal visível.</li>
		<li>Repita este procedimento para as larvas restantes.</li>
		<li>Uma vez que a agarose tenha gelado, cubra-o com algumas gotas de PBS e, em seguida, coloque-o no palco do microscópio confocal.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Alinhe a lente objetiva com a amostra, concentre o microscópio usando luz transmitida e ilumine a amostra com os lasers apropriados. NOTA: Neste exemplo, foram utilizados comprimentos de onda de 405 nm e 568 nm para excitar DAPI e RFP, respectivamente.</li>
	<li>Ajuste o ganho, deslocamento e potência do laser movendo as barras de controle deslizante para um nível apropriado em relação ao sinal e ao detector usado. Verifique os histogramas de cada canal e clique no botão estado de indicador de saturação acima da imagem para medir o nível de exposição, garantindo que nenhum dos pixels esteja saturado e que a relação sinal-ruído seja alta. Para um exemplo de parâmetros de imagem confocal ideais para resolução celular e subcelular dentro do zebrafish, consulte 21.</li>
	<li>Defina os limites superiores e inferiores da pilha de z-planes usando a roda de rolagem no mouse para encontrar a parte superior e inferior da amostra. Clique nos limites superior e inferior para aquisição de imagens e, em seguida, acione a captura de pilha de z clicando no botão Executar agora . NOTA: Dependendo de quão simetricamente o cérebro é montado, a profundidade total z para um cérebro de zebrafish larval de 9 dpf será ~150-200 μm.</li>
	<li>Processe e colora as imagens com acessibilidade daltônica em mente (por exemplo, use azul e laranja ou magenta e verde para imagens bicolores). Configure tabelas de pesquisa no software usado para capturar as imagens ou softwares de processamento de imagens, como o Photoshop da Adobe.</li>
	<li>No Photoshop, fotomicógrafos brutos de cor salvos como TIFF (Tagged Image File Format, formato de arquivo de imagem) de 8 bits por (i) convertendo o Modo de Imagem em RGB e (ii) acessando a opção Curvas sob a imagem | Ajustes menus e, em seguida, (iii) deslizando as saídas de luz coloridas apropriadas para 0 ou 255 níveis para alcançar a cor desejada. Por exemplo, para obter um sinal verde, selecione o canal Vermelho e deslize sua saída para 0; em seguida, selecione o canal Azul e deslize sua saída para 0 também. Da mesma forma, para obter um sinal magenta, selecione o canal Verde e deslize sua saída para 0; deixe os canais vermelho e azul como eles são. NOTA: Etapas semelhantes podem ser executadas no Programa gratuito de Manipulação de Imagens Gnu (GIMP).</li>
	<li>Quantifique manualmente o número de células exibindo um marcador específico usando o plugin do contador de células na ImageJ22, disponível no menu Analisar no menu Plugins. Exemplos de como usar o ImageJ para contagem de células podem ser encontrados em muitos tutoriais, incluindo 23.</li>
	<li>Gerar representações gráficas de dados em softwares estatísticos como rstudio (ver dados suplementares para . Arquivo Rmd).</li>
</ol>

<ol><li>Butler, A. B., Hodos, W. Optic tectum. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aButler%2C+AB+%22Comparative+Vertebrate+Neuroanatomy%3A+Evolution+and+Adaptation%22">Comparative Vertebrate Neuroanatomy: Evolution and Adaptation</a>. , John Wiley & Sons, Inc. 311-340 (2005).</li>
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</ol>

Os autores não têm conflitos de interesse para divulgar.

As técnicas descritas neste artigo ilustram uma das muitas abordagens para estudar o desenvolvimento de sistemas visuais de vertebrados em zebrafish. Outros pesquisadores publicaram métodos para dissecar a retina embrionária e realizar análises de expressão genética19 ou visualizar a atividade neuronal no tectumóptico 30. Este artigo fornece uma abordagem para explorar como a entrada diferencial da retina pode influenciar os comportamentos celulares no tectum óptico.
<p...

O objetivo deste método é investigar como a entrada da retina influencia o crescimento e o desenvolvimento do tectum óptico, o centro de processamento visual no cérebro de zebrafish. Removendo um olho e, em seguida, comparando os dois lados do tectum óptico, alterações tectal dentro do mesmo espécime podem ser observadas e normalizadas, permitindo a comparação entre vários espécimes. Abordagens moleculares modernas combinadas com esta técnica produzirão insights sobre os mecanismos subjacentes ao crescimento e desenvolvimento do sistema visual, bem como a degeneração e regeneração axonal.
Sistemas sensoriais - visuais, auditivos e somatosensoriais - coletam informações de órgãos externos e retransmitem essas informações para o sistema nervoso central, gerando "mapas" do mundo externo em todo o cérebro médio 1,2. A visão é a modalidade sensorial dominante para quase todos os vertebrados, incluindo muitos peixes. A retina, o tecido neural no olho, reúne informações com um circuito neuronal composto principalmente por fotorreceptores, células bipolares e células gânglios da retina (RGCs), os neurônios de projeção da retina. Os RGCs têm longos axônios que encontram seu caminho através da superfície interna da retina até a cabeça do nervo óptico, onde eles fasciculam e viajam juntos através do cérebro, terminando no centro de processamento visual no cérebro dorsal. Esta estrutura é chamada de tectum óptico em peixes e outros vertebrados não-mamíferos e é homóloga ao colegiado superior em mamíferos3.
O tectum óptico é uma estrutura multicamadas bilateralmente simétrica no cérebro médio dorsal. Em zebrafish e na maioria dos outros peixes, cada lóbulo do tectum óptico recebe entrada visual apenas do olho contralateral, de modo que o nervo óptico esquerdo termina no lobo tectal direito e o nervo óptico direito termina no lobo tectal esquerdo4 (Figura 1). Assim como sua contraparte mamífera, o collículo superior, o tectum óptico integra informações visuais com outras entradas sensoriais, incluindo audição e somatosensação, controlando mudanças na atenção visual e movimentos oculares, como saccades 1,5,6. No entanto, ao contrário do colículo superior mamífero, o tectum óptico gera continuamente novos neurônios e glia a partir de um nicho especializado de células-tronco perto das bordas medial e caudal dos lobos tectais chamado zona de proliferação tectal7. A manutenção de progenitores proliferativos no tecto óptico e em outras regiões do sistema nervoso central contribui, em parte, para a notável capacidade regenerativa documentada no zebrafish8.
Trabalhos anteriores examinando os cérebros de peixes cegos ou caolho revelaram que o tamanho do tectum óptico é diretamente proporcional à quantidade de inervação da retina que recebe 9,10,11. Em peixes de cavernas adultos, cujos olhos degeneram em embriogênese precoce, o tectum óptico é visivelmente menor do que o de peixes de superfície9 intimamente relacionados. A degeneração dos olhos dos peixes das cavernas pode ser bloqueada substituindo a lente endógena por uma lente de um peixe superficial durante a embriogênese. Quando esses peixes de caverna de um olho só são criados até a idade adulta, o lobo tectal inervatado contém aproximadamente 10% mais células do que o lobo tectal não inervado9. Da mesma forma, em killifish larval que foram incubados com tratamentos químicos para gerar olhos de diferentes tamanhos dentro do mesmo indivíduo, o lado do tectum com mais inervação foi maior e continha mais neurônios10. Evidências de experimentos de esmagamento de nervo óptico em peixes-dourados adultos indicam que a inervação promove a proliferação, com a proliferação de células tectais diminuindo quando a inervação foi interrompida11.
Confirmando e ampliando esses estudos clássicos, vários relatórios recentes fornecem dados sugerindo que a proliferação em resposta à inervação é modulada, pelo menos em parte, pela via BDNF-TrkB12,13. Muitas questões abertas sobre o crescimento e desenvolvimento do tectum óptico permanecem, incluindo como um sistema sensorial em desenvolvimento lida com lesões e degeneração do axônio, que os sinais celulares e moleculares permitem a entrada da retina para regular o crescimento do tectum óptico, quando esses mecanismos se tornam ativos, e se a proliferação e diferenciação ligadas à invasão permitem que a retina e seu tecido alvo coordenem as taxas de crescimento e garantam um mapeamento retinotópico preciso. Além disso, há questões muito maiores sobre o desenvolvimento dependente da atividade que podem ser abordadas interrogando o sistema visual de zebrafish com abordagens cirúrgicas como a descrita abaixo.
Para investigar os mecanismos celulares e moleculares pelos quais a atividade neural, especificamente a partir da entrada visual, altera a sobrevivência e a proliferação celular, a abordagem descrita compara diretamente os lobos tectal invatados e denervados (Figura 1) dentro de larvas individuais de zebrafish. Este método permite a documentação da degeneração do axônio RGC no tectum óptico e a confirmação de que o número de células mitóticas se correlaciona com a inervação.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63509/63509fig01.jpg"> Figura 1: Esboços de larvas de zebrafish antes e depois da remoção unilateral dos olhos. (A) Desenho de 5 larvas dpf vistas sob um microscópio dissecador. Cada larva é embutida em agarose de ponto de derretimento baixo e orientada lateralmente antes que uma agulha de tungstênio com uma ponta afiada e ligada seja usada para colher o olho voltado para cima (olho esquerdo neste exemplo). (B) Desenho da visão dorsal de uma larva de 9 dpf resultante da cirurgia retratada em A. Apenas três axônios RGC altamente esquematizados do olho direito são mostrados desfigurando e conectando-se com neurônios no lobo tectal esquerdo. Abreviaturas: dpf = dias pós fertilização; dps = dias após a cirurgia; RGC = células gânglios de retina. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63509/63509fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

<table><tbody><tr><td><forte>Equipamentos e suprimentos:</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Caixas de criação</td><td>Aquaneering</td><td>ZHCT100</td><td></td></tr><tr><td>graxa de alto vácuo Dow Corning</td><td>Sigma ou fornecedor equivalente</td><td>Z273554</td><td></td></tr><tr><td>frascos Erlenmeyer (125 mL)</td><td></td><td></td><td>Para fazer Marc's Modified Ringers (MMR) com antibióticos para incubação pós-cirúrgica.</td></tr><tr><td>Pinça fina - Dumont #5</td><td>Fine Science Tools (FST)</td><td>11252-20</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas de vidro Pasteur</td><td>DWK Lifescience</td><td>63A53 & 63A53WT</td><td>Para pipetagem de embriões e larvas.</td></tr><tr><td>Lâminas de vidro para microscopia</td><td>VWR ou fornecedor equivalente</td><td>48311-703</td><td>As lâminas de microscópio de vidro padrão podem ser encomendadas a muitos fornecedores de laboratórios diferentes.</td></tr><tr><td>Vidraria, incluindo garrafas graduadas e cilindros</td><td></td><td></td> graduados <td>Para fazer e armazenar soluções.</td></tr><tr><td>Resina epóxi de 2 partes</td><td>ACE Hardware ou outro fornecedor equivalente de Gorilla Glue ou</td><td>seringa equivalente de 0,85 oz</td><td>https://www.acehardware.com/departments/paint-and-supplies/tape-glues-and-adhesives/glues-and-epoxy/1590793</td></tr><tr><td>tubo de microcentrífuga (1,7 mL)</td><td>VWR ou fornecedor equivalente</td><td>22234-046</td><td></td></tr><tr><td>Suporte de pino niquelado (17 cm de comprimento)</td><td>Fine Science Tools (FST)</td><td>26018-17</td><td>Para segurar o fio de tungstênio enquanto afia e realiza cirurgias / dissecações.</td></tr><tr><td>Filtro de chá de malha de nylon ou equivalente</td><td>Ali Express ou equivalente</td><td></td><td>Para a colheita de ovos de peixe-zebra após a desova; https://www.aliexpress.com/item/1005002219569756.html</td></tr><tr><td>Clipe</td><td></td><td></td> de papel <td>para dispositivo de afiação de agulha de tungstênio.</td></tr><tr><td>Placas de Petri 100 mm</td><td>Fischer Scientific ou fornecedor equivalente</td><td>50-190-0267</td><td></td></tr><tr><td>Placas de Petri 35 mm</td><td>Fischer Scientific ou fornecedor equivalente</td><td>08-757-100A</td><td></td></tr><tr><td>Bomba de pipeta</td><td>SP Bel-Art ou equivalente</td><td>F37898-0000</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de potássio (KOH)</td><td>Sigma</td><td>909122</td><td>Para dispositivo de afiação de agulha de tungstênio. Faça uma solução a 10% p/v de KOH no exaustor adicionando pellets à água deionizada.</td></tr><tr><td>Fonte de alimentação (tensão variável)</td><td></td><td></td> <td>Para dispositivo de afiação de agulha de tungstênio. Qualquer fonte de alimentação com tensão variável funcionará (mesmo uma usada para eletroforese em gel).</td></tr><tr><td>Sylgard 184 Kit de elastômero</td><td>Dow Corning</td><td>3097358</td><td></td></tr><tr><td>Fio de tungstênio (0,125 mm de diâmetro)</td><td>World Precision Instruments (WPI)</td><td>TGW0515</td><td>Afie para remover o olho e dissecar as larvas.</td></tr><tr><td>Bloco de calor de temperatura variável</td><td>O Lab Depot ou fornecedor equivalente</td><td>BSH1001 ou BSH1002</td><td>Definido para 40-42 &deg; C à frente dos experimentos.</td></tr><tr><td>Frasco de vidro de boca larga com tampa (por exemplo, geléia limpa ou frasco de salsa)</td><td></td><td></td> <td>Para dispositivo de afiação de agulha de tungstênio.</td></tr><tr><td>Fios com cabos</td><td></td><td></td> de clipe jacaré <td>Para dispositivo de afiação de agulha de tungstênio.</td></tr><tr><td><forte>Microscópios:</forte></td>Microscópio de dissecação Qualquer tipo funcionará, <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>mas é preferível ter luz transmitida ajustável em uma base espelhada.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr>Microscópio <td></td><td></td><td>confocal de varredura a laser</td><td>Recomenda-se lente objetiva de imersão em água de alta NA, 20-25x. O software de controle de microscópio e captura de imagem (NIS-Elements da Nikon) é usado aqui, mas qualquer microscópio confocal funcionará.</td></tr><tr><td><forte>Reagentes para cirurgias e dissecções:</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de cálcio di-hidratado</td><td>Sigma</td><td>C7902</td><td>para anéis modificados de Marc (MMR) e meio embrionário (E3).</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H7006</td><td>Para Toques Modificados de Marc (MMR).</td></tr><tr><td>Baixo ponto de fusão agarose</td><td>Invitrogen</td><td>16520-050</td><td>Faça 1% em meio embrionário (E3) ou Marc's Modified Ringers (MMR).</td></tr><tr><td>Cloreto de magnésio hexahidratado</td><td>Sigma</td><td>1374248</td><td>Para meio embrionário (E3).</td></tr><tr><td>Sulfato de magnésio</td><td>Sigma</td><td>M7506</td><td>para anéis modificados de Marc (MMR).</td></tr><tr><td>Ciências de Microscopia Eletrônica</td> <td>de Paraformaldeído</td><td>19210</td><td>Diluir 8% (p / v) com 2x PBS concentrado (diluído de 10x estoque de PBS).</td></tr><tr><td>Penicilina / estreptomicina</td><td>Sigma</td><td>P4333-20ML</td><td>diluir 1:100 em toques modificados de Marc.</td></tr><tr><td>Comprimidos de solução salina tamponada com fosfato (PBS)</td><td>Diagnostic BioSystems</td><td>DMR E404-01</td><td>Faça 10x estoque em água deionizada, autoclave e armazene em temperatura ambiente. Diluir para 1x a concentração de trabalho.</td></tr><tr><td>Cloreto de potássio</td><td>Sigma</td><td>P3911</td><td>para anéis modificados de Marc (MMR) e meio embrionário (E3).</td></tr><tr><td>Cloreto de sódio</td><td>Sigma</td><td>S9888</td><td>Para Ringers modificados por Marc (MMR) e meio embrionário (E3).</td></tr><tr><td>Hidróxido de sódio</td><td>Sigma</td><td>S5881</td><td>Faça 10 M e use para ajustar o pH do MMR para 7,4.</td></tr><tr><td>Sacarose</td><td>Sigma</td><td>S9378</td><td></td></tr><tr><td>Tricaine-S</td><td>Pentair</td><td>100G #TRS1</td><td>Receita: https://zfin.atlassian.net/wiki/spaces/prot/pages/362220023/TRICAINE</td></tr><tr><td>Reagentes para imuno-histoquímica:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexafluor 568 marcado Anticorpo secundário para detectar IgG de coelho</td><td>Invitrogen</td><td>A-11011</td><td>Use na diluição de 1:500 para montagem integral imuno-histoquímica.</td></tr><tr><td>DAPI ou ToPro3</td><td>Invitrogen</td><td>1306 ou T3605</td><td>Compõem soluções de 1 mg / mL em DMSO; diluição 1: 5.000 para contracoloração.</td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido (DMSO)</td><td>Sigma</td><td>D8418</td><td>Um componente do tampão imunobloqueio.</td></tr><tr><td>Metanol (MeOH)</td><td>Sigma</td><td>34860</td><td>A mistura de MeOH com soluções aquosas como PBST é exotérmica. Faça as soluções MeOH/PBST com pelo menos várias horas de antecedência ou resfrie-as no gelo antes de usar.</td></tr><tr><td>Soro de cabra normal</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>50-062Z</td><td>Um componente do tampão imunobloqueio. Pode ser aliquotado em volumes de 1-10 mL e armazenado a -20 °C.</td></tr><tr><td>Anticorpo primário para detectar fosfohistona H3</td><td>Millipore</td><td>06-570</td><td>Use na diluição de 1:300 para imuno-histoquímica total.</td></tr><tr><td>Anticorpo primário para detectar a proteína fluorescente vermelha (RFP; detecta derivados dsRed)</td><td>MBL International</td><td>PM005</td><td>Use na diluição de 1:500 para imuno-histoquímica total.</td></tr><tr><td>Proteinase K (PK)</td><td>Sigma</td><td>P2308-10MG</td><td>Fazer 10 mg/mL de soluções estoque em PBS e usar a 10 &micro; g/mL.</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td>Útil para fazer uma solução de estoque de 20% (v / v) em PBS.</td></tr><tr><td>Software para análise de dados</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ (Fiji)</td><td></td><td></td><td>Freeware para análise de imagens; https://imagej.net/software/fiji/</td></tr> <tr><td>RStudio</td><td></td><td></td><td>Freeware para análise estatística e visualização de dados; https://www.rstudio.com/products/rstudio/download/</td></tr> <tr><td>Adobe Photoshop ou GIMP</td><td></td><td></td><td>Softwares proprietários de processamento de imagem (Adobe Photoshop e Illustrator) são frequentemente usados para compor figuras). Uma alternativa freeware é o Gnu Image Manipulation Program (GIMP; https://www.gimp.org/)</td></tr><tr><td>Zebrafish strains. Este estudo utilizou as cepas AB, TU, Tg[atoh7:RFP].</td><td></td><td></td><td>Disponível no&nbsp; Centros Internacionais de Recursos do Peixe-Zebra nos EUA (https://zebrafish.org/home/guide.php) ou na Europa (https://www.ezrc.kit.edu/). Cepas transgênicas especializadas que ainda não foram depositadas em nenhum dos centros de recursos podem ser solicitadas a laboratórios individuais após a publicação.</td></tr></tbody></table>

remoção de olhos em larvas de zebrafish vivos para examinar o crescimento e desenvolvimento dependentes da inervação do sistema visual

Eye Removal in Living Zebrafish Larvae to Examine Innervation-dependent Growth and Development of the Visual System

Os zebrafish exibem notável crescimento ao longo da vida e habilidades regenerativas. Por exemplo, nichos especializados de células-tronco estabelecidos durante a embriogênese suportam o crescimento contínuo de todo o sistema visual, tanto no olho quanto no cérebro. O crescimento coordenado entre a retina e o tectum óptico garante um mapeamento retinotópico preciso à medida que novos neurônios são adicionados nos olhos e no cérebro. Para abordar se os axônios da retina fornecem informações cruciais para a regulação de comportamentos tectal e células progenitoras, como sobrevivência, proliferação e/ou diferenciação, é necessário ser capaz de comparar lóbulos tectal inervados e denervados dentro do mesmo animal e entre animais. 
A remoção cirúrgica de um olho de zebrafish larval vivo seguida da observação do tectum óptico atinge esse objetivo. O vídeo que acompanha demonstra como anestesiar larvas, afiar eleticamente agulhas de tungstênio e usá-las para remover um olho. Em seguida, mostra como dissecar cérebros de larvas de zebrafish fixas. Finalmente, o vídeo fornece uma visão geral do protocolo de imunohistoquímica e uma demonstração de como montar embriões manchados em agarose de ponto de baixa fusão para microscopia.

Para confirmar se a remoção dos olhos foi completa e avaliar como o tectum óptico muda, foram realizadas cirurgias na cepa Tg[atoh7:RFP], que rotula todas as RGCs com um RFP direcionado à membrana e, assim, todos os axônios que projetam a partir da retina e formam o nervo óptico24. Embora o uso dessa cepa não seja absolutamente necessário, permite a observação e visualização direta do nervo óptico termini no neuropil tectum óptico. Outras abordagens para rotular o nervo óptico, como o tra...

O artigo explica como remover cirurgicamente os olhos das larvas vivas de zebrafish como o primeiro passo para investigar como a entrada da retina influencia o crescimento e o desenvolvimento do tectum óptico. Além disso, o artigo fornece informações sobre anestesia larval, fixação e dissecção cerebral, seguida de imunohistoquímica e imagem confocal.

Remoção de olhos em larvas de zebrafish vivos para examinar o crescimento e desenvolvimento dependentes da inervação do sistema visual

Zebrafish exhibit remarkable life-long growth and regenerative abilities. For example, specialized stem cell niches established during embryogenesis ...

Então meu laboratório está interessado em entender como o olho e o cérebro crescem juntos. Essa técnica nos permite estudar como a entrada da retina influencia o crescimento e o desenvolvimento do cérebro. A remoção cirúrgica de um olho do zebrafish larval vivo, seguida da observação do tectum óptico, permite comparar lobos tectal inervados e denervados dentro do mesmo animal e em animais.Combinar essa técnica com abordagens moleculares modernas pode dar uma nova visão sobre mecanismos subjacentes ao desenvolvimento neural, regeneração e degeneração. Para começar, conecte os fios de cátodo e ânodo à fonte de alimentação. Conecte o clipe de jacaré na extremidade do fio do cátodo a um clipe de papel parcialmente endireitado e insira o clipe de papel na solução de hidróxido de potássio, prendendo-o ao lado do frasco.Coloque o clipe do jacaré do fio ânodo no pescoço do suporte da agulha. Gire a energia para aproximadamente 20 volts e mergulhe o fio de tungstênio na solução de hidróxido de potássio, puxando o fio para fora da solução em um ângulo para afiar eleticamente o fio em uma ponta fina. Verifique a ponta da agulha sob o microscópio de dissecação para garantir que ela esteja afiada o suficiente.A ponta da agulha curva resulta quando a agulha afiada é dobrada tocando-a suavemente na placa de Petri. No dia da cirurgia, use uma pipeta de pastagem de vidro de furo largo para transferir de 10 a 15 larvas para uma placa de Petri de 35 milímetros cheia de E3 fresca. Adicione três a cinco gotas de anestésico à larva. Para determinar se as larvas estão adequadamente anestesiadas, procure a falta de resposta ao toque.Adicione mais duas a três gotas do anestésico se as larvas ainda responderem ao toque após três minutos e reavaliar. Para imobilizar a larva para cirurgia, leve uma larva para cima em uma pipeta de pastagem de vidro com apenas uma pequena quantidade de E3. Em seguida, pegue aproximadamente 200 microliters de ponto de fusão derretido 1% baixo ou LMP agarose na pipeta contendo a larva e misture para garantir que a larva seja suspensa na agarose LMP. Coloque a tampa de uma placa de Petri de 35 milímetros virada sob o microscópio dissecando, em seguida, esguiche a larva e a agarose sobre a tampa da placa de Petri de cabeça para baixo.Espalhe a agarose para que a larva esteja no centro da queda. Usando uma agulha de tungstênio maçante, manobrar rapidamente, mas suavemente, a larva para que fique lateral com um olho voltado para cima. Espere vários minutos para a agarose definir.Seguindo a borda da órbita dos olhos, use a ponta de uma fina agulha de tungstênio eleticamente afiada para perfurar a pele ao redor do olho. Em seguida, deslize a borda da agulha sob o olho do lado temporal-ventral do olho. Use pressão controlada para soltar o olho da tomada.Continue pressionando o olho dorsalmente e anteriormente com o lado da agulha, eventualmente cortando através do nervo óptico e liberando o olho. Alternativamente, você pode usar fórceps cirúrgicos muito finos para remover o olho, beliscando o nervo óptico e empurrando o olho de medial para lateral. Após uma remoção bem sucedida do olho, cubra a agarose com solução MMR, liberte cada larva da agarose escovando suavemente uma agulha de tungstênio em torno de sua cabeça e, em seguida, em torno de seu corpo, enquanto estabiliza a tampa da placa de Petri com fórceps.Após as cirurgias, coloque a larva na solução mmr complementada com antibióticos até o dia seguinte, depois devolva a larva para a E3 e elare as até o ponto final do experimento. Depois que a larva for anestesiada terminalmente, fixe-as com 4% de paraformaldeído. Suspenda as larvas fixas em gotículas PBS em uma placa de vedação sob um microscópio dissecando.Fixe-os lateralmente colocando dois pinos de tungstênio através do notochord com um pino posterior à área pigmentada cobrindo a região AGM e outro em linha com a extremidade da extensão da gema. Remova o olho com uma agulha de tungstênio afiada e fórceps finos. Às vezes é possível cutucar a agulha através da mandíbula para o lado oposto e remover o outro olho.Use a agulha de tungstênio para coçar do temporal para o lado ventral da orelha. Na mesma ação em movimento, leve a agulha posterior à mandíbula e puxe suavemente anteriormente até que a orelha e a mandíbula sejam removidas. Remova o outro olho e orelha cutucando a agulha através da mandíbula.Use fórceps para retirar os órgãos ventrais e a gema restante. Finalmente, faça uma incisão rasa na pele craniana dorsal perto da junção entre o cérebro traseiro e a medula espinhal. Levante a pele com os fórceps e puxe-a anteriormente e ao redor do telencephalon.Remova qualquer tecido restante com fórceps. Despreeça a larva e transfira para PBS em tubo de microcentrífugo de 1,5 mililitro. Fixar um deslizamento de câmara na tampa de uma placa de Petri de 100 milímetros com graxa de vácuo.Transfira a larva imunossu detida e processada para uma placa de poço ou deslizamento de depressão para vê-las com um microscópio dissecando. Monte a larva no escorregador de câmara em colunas de agarose de 1%LMP. Usando um copo além da pipeta, coloque uma larva no escorregador de câmara, depositando o mínimo de PBS possível.Cubra a larva com agarose derretida e quente de 1%LMP usando a mesma pipeta. Pipeta o LMP surgiu em uma coluna e, em seguida, posicionar a larva tão simetricamente quanto possível com a superfície dorsal visível. Após a remoção dos olhos, observou-se degeneração progressiva dos axônios de retina no neuropil tectum óptico.Em dois dias após a cirurgia, os axônios rotulados pela RFP exibiram marcas de rápida degeneração walleriana, como blabbing e fragmentação. Os punctas positivos rfp foram notados dentro e fora do neuropil no lado direito do tectum, conforme indicado pelas setas. Em quatro dias após a cirurgia, axônios fragmentados e detritos axonais rotulados por RFP foram consideravelmente reduzidos no lobo tectal direito, indicando uma liberação relativamente rápida dos axônios moribundos e degenerados.O cérebro foi exposto dissecando os olhos, mandíbula, orelhas e crânio da pele e tecidos conjuntivos. Idealmente, o cérebro permanece intacto durante este procedimento. No entanto, partes do cérebro da frente, particularmente a lâmpada olfativa, foram provavelmente danificadas ou completamente removidas quando a tampa do crânio da pele ou mandíbula foi removida.Além disso, às vezes a borda lateral do tectum é cortada ao perfurar ou beliscar a pele para retirá-la do cérebro. Nenhuma amostra é idêntica. Então você precisa ser capaz de fazer adaptações sutis através da remoção dos olhos e dissecção cerebral conforme necessário.Pacientes e ferramentas afiadas são essenciais para o sucesso. Essa técnica pode ser acompanhada de abordagens celulares e moleculares, como a imagem de células vivas in vivo ou sequenciamento de RNA para obter novas percepções sobre os mecanismos moleculares e celulares do crescimento e desenvolvimento do tectum óptico.

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

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Usando folha de luz microscopia de fluorescência para Imagem Desenvolvimento Zebrafish Eye

Uma combinação das técnicas de microscopia com longo comprimento de onda multi fóton fluorescência de excitação de laser ópticas foi implementada para capturar imagens de alta resolução, tridimensional, em tempo real de migração da crista neural em Tg (sox10:EGFP) e Tg (foxd3:GFP) zebrafish embriões.

Fóton multi tempo lapso imagem para visualizar o desenvolvimento em tempo real: visualização de migrar as células da crista Neural em embriões de peixe-zebra

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Remoção de olhos em larvas de zebrafish vivos para examinar o crescimento e desenvolvimento dependentes da inervação do sistema visual (Vídeo) | JoVE Journal

Remoção de olhos em larvas de zebrafish vivos para examinar o crescimento e desenvolvimento dependentes da inervação do sistema visual

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