Name: Isolamento da Microglia Primária do Rato por Triagem celular ativada por magnético em modelos animais de desmielinização (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 53 s
Description: Aprenda a isolar microglia primária de lesões de desmielinização em cérebro de rato adulto usando triagem celular ativada por magnético. Este método otimiza tempo e recursos para estudos de neuroinflamação.

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O estudo foi apoiado pela Tongji Hospital (HUST) Foundation for Excellent Young Scientist (Grant No. 2020YQ06).

Todos os procedimentos animais foram aprovados pelo Comitê de Cuidados Com Animais do Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, China.
1. Materiais
<ol><li>Prepare as seguintes soluções antes de iniciar o protocolo.<ol>
<li>Prepare o tampão de carga adicionando soro bovino fetal (FBS, 2%) à solução salina tamponada de fosfato (PBS).</li>
		<li>Adicione corante vermelho neutro (NR) (1%) final ao PBS.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Prepare as seguintes soluções utilizando o Kit de Dissociação cerebral Adulta disponível comercialmente (veja a Tabela de Materiais).<ol>
<li>Para preparar a mistura de enzimas 1, pipeta 1,9 mL de Buffer Z e 50 μL de Enzima P em um tubo centrífuga de 15 mL.</li>
		<li>Para preparar a mistura de enzimas 2, pipeta 20 μL de Buffer Y e 10 μL de Enzima A em um tubo de microcentrifutura de 1,5 mL.</li>
		<li>Prepare a solução de remoção de detritos.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Perfusão e dissecção de camundongos
<ol><li>Intraperitoneal (i.p.) injete o mouse com 500 μL de corante de 1% NR em PBS 2-3 h antes da anestesia. NOTA: A injeção intraperitoneal de NR em modelos desmielinizadores de camundongos ajuda a discernir as lesões (Figura 1).</li>
	<li>Anestesiar o mouse com pentobarbital (50 mg/kg, i.p.), e garantir que o mouse seja anestesiado com sucesso examinando as respostas à dor.</li>
	<li>Abra a cavidade torácica do rato e exponha o coração.</li>
	<li>Corte um pequeno canto do átrio direito cuidadosamente e intracardialmente perprendo o mouse com 20-30 mL de PBS frio do ventrículo esquerdo.</li>
	<li>Decapitar o rato sob anestesia.</li>
	<li>Abra o crânio do rato e liberte cuidadosamente o cérebro do crânio.</li>
	<li>Transfira o cérebro para o cérebro do rato cortar o molde e cortar o cérebro em fatias de 0,1 cm.</li>
	<li>Remova as fatias cerebrais e coloque-as em PBS frio em uma placa de Petri (60/15 mm). Microdissto as lesões rotuladas por corante NR ao redor do caloso corpus sob um estereoscópio usando fórceps microcirúrgicos. NOTA: Certifique-se de que o tecido dissecado esteja o mais completo possível para facilitar a transferência subsequente; o progresso total da dissecção deve ser concluído em 2 h.</li>
	<li>Transfira o tecido dissecado para tubos de centrífugas de 15 mL contendo a quantidade apropriada de tampão de carga a frio. NOTA: Misture o tecido de caloso corpus de 2-3 ratos juntos em um tubo como uma amostra.</li>
</ol>3. Dissociação tecidual
<ol><li>Centrifugar o tecido dissecado a 300 ×g por 30 s (depois de atingir essa velocidade) para coletar a amostra na parte inferior do tubo.</li>
	<li>Mistura de enzima pré-aqueça 1 e misture enzimas de 2 a 37 °C em uma incubadora.</li>
	<li>Adicione 1.950 μL de enzima pré-aque mistura 1 a uma amostra e digerir em uma incubadora a 37 °C por 5 min.</li>
	<li>Adicione 30 μL de mistura de enzimas pré-aque 2 e misture delicadamente.</li>
	<li>Digerir em uma incubadora a 37 °C por 15 min e misturar suavemente a cada 5 minutos.</li>
	<li>Adicione 4 mL de PBS frio ao tubo após a digestão e agite suavemente.</li>
	<li>Coloque filtros de 70 μm em tubos de centrífugas de 50 mL e prewet os filtros com 500 μL de PBS frio. Filtre o tecido dissociado passando as amostras de tecido digerido através dos filtros e transfira a suspensão filtrada no tubo centrífuga de 50 mL para um tubo de centrífuga de 15 mL. NOTA: Pule esta etapa se a quantidade de tecido for muito pequena.</li>
	<li>Centrifugar as amostras de tecido filtrado a 300 ×g por 10 min a 4 °C e aspirar o sobrenante lentamente e completamente. NOTA: Todas as etapas devem ser realizadas no gelo, exceto pela digestão enzimática.</li>
</ol>4. Remoção de detritos
<ol><li>Resuspenque a pelota de célula suavemente com 1.550 μL de PBS frio.</li>
	<li>Adicione 450 μL de solução fria para remoção de detritos e misture bem.</li>
	<li>Sobreponha a mistura acima muito lentamente e suavemente com 2 x 1 mL de PBS frio usando uma pipeta de 1.000 μL. NOTA: Incline o tubo de centrífuga por 45 ° e adicione lentamente PBS ao longo da parede do tubo com a pipeta.</li>
	<li>Transfira o tubo lentamente e suavemente para uma centrífuga e gire a 4 °C e 3.000 × g por 10 min.</li>
	<li>Procure por três camadas após a centrifugação. Aspire as duas camadas superiores completamente usando uma pipeta de 1.000 μL (Figura 2).</li>
	<li>Encha o tubo até 5 mL com tampão de carregamento a frio e inverta suavemente o tubo três vezes.</li>
	<li>Centrifugar a 4 °C e 1.000 × g por 10 min. Aspire completamente o supernatante e evite interromper a pelota celular.</li>
</ol>5. Separação magnética de células microgliais
<ol><li>Resuspenja a pelota celular com 90 μL de tampão de carga e adicione 10 μL de contas CD11b (Microglia).</li>
	<li>Misture bem e incubar por 15 min a 4 °C.</li>
	<li>Adicione 1 mL de tampão de carga e pipeta o líquido suavemente para cima e para baixo com uma pipeta de 1.000 μL para lavar as células após a incubação. Centrifugar as células a 4 °C e 300 × g por 10 minutos e aspirar o supernatante completamente para remover as contas desvinculadas.</li>
	<li>Resuspende as células em 500 μL de tampão de carga.</li>
	<li>Coloque a coluna MS com seu separador para seleção positiva no campo magnético.</li>
	<li>Enxágüe a coluna com 500 μL de tampão de carga para proteger as células e garantir a eficiência da classificação magnética com base no protocolo do fabricante.</li>
	<li>Aplique a suspensão da célula na coluna MS e descarte o fluxo através de células não rotuladas.</li>
	<li>Adicione 500 μL de tampão de carga à coluna três vezes para lavar as células que aderem à parede da coluna e descartar o fluxo através do fluxo. NOTA: Adicione apenas um novo tampão de carregamento para lavagem quando o reservatório da coluna estiver completamente vazio.</li>
	<li>Retire a coluna do separador após lavar a coluna e coloque-a em um tubo de centrífuga de 15 mL.</li>
	<li>Adicione 1 mL de tampão de carga na coluna e empurre o êmbolo para a parte inferior da coluna para liberar as células rotuladas magneticamente. Repita esta etapa três vezes para coletar completamente as células magneticamente rotuladas.</li>
</ol>

<ol><li>Ginhoux, F., et al. Fate mapping analysis reveals that adult microglia derive from primitive macrophages. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGinhoux%2C+F+%22Science%22">Science</a>. 330 (6005), New York, N.Y. 841-845 (2010).</li>
<li>Schulz, C., et al. A lineage of myeloid cells independent of Myb and hematopoietic stem cells. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSchulz%2C+C+%22Science%22">Science</a>. 336 (6077), New York, N.Y. 86-90 (2012).</li>
<li>Paolicelli, R. C., et al. Synaptic pruning by microglia is necessary for normal brain development. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPaolicelli%2C+RC+%22Science%22">Science</a>. 333 (6048), New York, N.Y. 1456-1458 (2011).</li>
<li>Squarzoni, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+modulate+wiring+of+the+embryonic+forebrain%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Microglia modulate wiring of the embryonic forebrain.</a> Cell Reports. 8 (5), 1271-1279 (2014).</li>
<li>Ueno, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Layer+V+cortical+neurons+require+microglial+support+for+survival+during+postnatal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Layer V cortical neurons require microglial support for survival during postnatal development.</a> Nature Neuroscience. 16 (5), 543-551 (2013).</li>
<li>Cunningham, C. L., Martínez-Cerdeño, V., Noctor, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+regulate+the+number+of+neural+precursor+cells+in+the+developing+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%3A+The+Official+Journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Microglia regulate the number of neural precursor cells in the developing cerebral cortex.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 33 (10), 4216-4233 (2013).</li>
<li>Colonna, M., Butovsky, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+function+in+the+central+nervous+system+during+health+and+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Microglia function in the central nervous system during health and neurodegeneration.</a> Annual Review of Immunology. 35, 441-468 (2017).</li>
<li>Benmamar-Badel, A., Owens, T., Wlodarczyk, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+microglial+subset+in+development%2C+aging%2C+and+disease%3A+Lessons+from+transcriptomic+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Protective microglial subset in development, aging, and disease: Lessons from transcriptomic studies.</a> Frontiers in Immunology. 11, 430(2020).</li>
<li>Yıldızhan, K., Nazıroğlu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+and+its+role+in+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Neuroscience+and+Oxidative+Stress%22%5BJournal%5D)">Microglia and its role in neurodegenerative diseases.</a> Journal of Cellular Neuroscience and Oxidative Stress. 11 (2), 861-873 (2019).</li>
<li>Gutmann, D. H., Kettenmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia%2Fbrain+macrophages+as+central+drivers+of+brain+tumor+pathobiology%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Microglia/brain macrophages as central drivers of brain tumor pathobiology.</a> Neuron. 104 (3), 442-449 (2019).</li>
<li>Hammond, T. R., Robinton, D., Stevens, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+and+the+brain%3A+Complementary+partners+in+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Microglia and the brain: Complementary partners in development and disease.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 34, 523-544 (2018).</li>
<li>Menassa, D. A., Gomez-Nicola, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglial+dynamics+during+human+brain+development%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Microglial dynamics during human brain development.</a> Frontiers in Immunology. 9, 1014(2018).</li>
<li>Masuda, T., Sankowski, R., Staszewski, O., Prinz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+heterogeneity+in+the+single-cell+era%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Microglia heterogeneity in the single-cell era.</a> Cell Reports. 30 (5), 1271-1281 (2020).</li>
<li>Ni, M., Aschner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neonatal+rat+primary+microglia%3A+isolation%2C+culturing%2C+and+selected+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Neonatal rat primary microglia: isolation, culturing, and selected applications.</a> Current Protocols in Toxicology. , Chapter 12, Unit 12.17 (2010).</li>
<li>Yildizhan, K., Naziroglu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutathione+depletion+and+parkinsonian+neurotoxin+MPP%28%2B%29-induced+TRPM2+channel+activation+play+central+roles+in+oxidative+cytotoxicity+and+inflammation+in+microglia%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Glutathione depletion and parkinsonian neurotoxin MPP(+)-induced TRPM2 channel activation play central roles in oxidative cytotoxicity and inflammation in microglia.</a> Molecular Neurobiology. 57 (8), 3508-3525 (2020).</li>
<li>Bohlen, C. J., Bennett, F. C., Bennett, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+microglia%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of microglia.</a> Current Protocols in Immunology. 125 (1), 70(2019).</li>
<li>Bennett, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+tools+for+studying+microglia+in+the+mouse+and+human+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">New tools for studying microglia in the mouse and human CNS.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 1738-1746 (2016).</li>
<li>Gordon, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+magnetic+separation+method+for+high-yield+isolation+of+pure+primary+microglia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">A simple magnetic separation method for high-yield isolation of pure primary microglia.</a> Journal of Neuroscience Methods. 194 (2), 287-296 (2011).</li>
<li>Pan, J., Wan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methodological+comparison+of+FACS+and+MACS+isolation+of+enriched+microglia+and+astrocytes+from+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Methodological comparison of FACS and MACS isolation of enriched microglia and astrocytes from mouse brain.</a> Journal of Immunological Methods. 486, 112834(2020).</li>
<li>Baydyuk, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+the+evolution+of+CNS+remyelinating+lesion+in+mice+with+neutral+red+dye%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Tracking the evolution of CNS remyelinating lesion in mice with neutral red dye.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (28), 14290-14299 (2019).</li>
<li>Sahel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alteration+of+synaptic+connectivity+of+oligodendrocyte+precursor+cells+following+demyelination%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Alteration of synaptic connectivity of oligodendrocyte precursor cells following demyelination.</a> Frontiers in Cell Neuroscience. 9, 77(2015).</li>
<li>Schroeter, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One+brain-all+cells%3A+A+comprehensive+protocol+to+isolate+all+principal+CNS-resident+cell+types+from+brain+and+spinal+cord+of+adult+healthy+and+EAE+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">One brain-all cells: A comprehensive protocol to isolate all principal CNS-resident cell types from brain and spinal cord of adult healthy and EAE mice.</a> Cells. 10 (3), 651(2021).</li>
<li>Liu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissociation+of+microdissected+mouse+brain+tissue+for+artifact+free+single-cell+RNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protocols%22%5BJournal%5D)">Dissociation of microdissected mouse brain tissue for artifact free single-cell RNA sequencing.</a> STAR Protocols. 2 (2), 100590(2021).</li>
<li>Marsh, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+sequencing+reveals+glial+specific+responses+to+tissue+processing+%26+enzymatic+dissociation+in+mice+and+humans%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Single cell sequencing reveals glial specific responses to tissue processing & enzymatic dissociation in mice and humans.</a> bioRxiv. , (2020).</li>
<li>Holt, L. M., Olsen, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+applications+of+magnetic+cell+sorting+to+analyze+cell-type+specific+gene+and+protein+expression+in+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Novel applications of magnetic cell sorting to analyze cell-type specific gene and protein expression in the central nervous system.</a> PLoS One. 11 (2), 0150290(2016).</li>
<li>He, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+sequencing+analysis+reveals+quiescent+microglia+isolation+methods+from+postnatal+mouse+brains+and+limitations+of+BV2+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">RNA sequencing analysis reveals quiescent microglia isolation methods from postnatal mouse brains and limitations of BV2 cells.</a> Journal of Neuroinflammation. 15 (1), 153(2018).</li>
</ol>

Os autores declararam que não existem interesses concorrentes.

O protocolo propõe um método para isolar a microglia em torno das lesões desmielinizantes, que podem ajudar a estudar as características funcionais da microglia em doenças desmielinizantes inflamatórias. Microglia capturadas usando contas CD11b exibem alta pureza e viabilidade. As etapas críticas do protocolo incluem a localização precisa de focos e a purificação microglial ideal. No protocolo passo 2.1, é necessário injetar a solução NR 2 h antes de sacrificar o mouse para garantir que as lesões possam ser exibidas com ...

A microglia é originária de progenitores de gema-sac, que atingem o cérebro embrionário muito cedo e participam do desenvolvimento do CNS 1,2. Por exemplo, eles estão envolvidos na poda sináptica3 e na regulação do crescimento axonal4. Eles secretam fatores que promovem a sobrevivência neuronal e ajudam a localização neuronal5. Ao mesmo tempo, eles estão envolvidos na remoção de células anormais e células apoptóticas para garantir o desenvolvimento cerebral normal6. Além disso, como as células imuno-competentes do cérebro, microglia vigia continuamente o parnchyma cerebral para limpar células mortas, sinapses disfuncionais e detritos celulares7. Foi demonstrado que a ativação microglial desempenha um papel importante em uma variedade de doenças, incluindo doenças inflamatórias desmielinizantes, doenças neurodegenerativas e tumores cerebrais. Microglia ativada na esclerose múltipla (EM) contribuem para a diferenciação das células precursoras oligodendrocytos (OPCs) e a regeneração da mielina, engolindo detritos de mielina8.
Na doença de Alzheimer (DA), o acúmulo de beta amiloide (Aβ) ativa a microglia, que afeta as funções fagocíticas e inflamatórias da microglia9. A microglia ativada no tecido glioma, chamada microglia associada ao glioma (GAM), pode regular a progressão do glioma e, em última instância, afetar o prognóstico dos pacientes10. A ativação altera profundamente o transcriptome microglial, resultando em alterações morfológicas, expressão de receptores imunológicos, aumento da atividade fagocítica e secreção decitocinas aprimorada 11. Existem diferentes subconjuntos de microglia ativada em doenças neurodegenerativas, como microglia associada à doença (DAM), microglia de resposta ativada (ARM) e fenótipo neurodegenerativo microglial (MGnD)8.
Da mesma forma, múltiplos subconjuntos funcionais dinâmicos de microglia também coexistem no cérebro em doenças inflamatórias desmielinizantes12. Compreender a heterogeneidade entre diferentes subconjuntos de microglia é essencial para investigar a patogênese das doenças inflamatórias desmielinizantes e encontrar suas potenciais estratégias terapêuticas. A heterogeneidade da microglia depende principalmente da especificidade molecular8. É essencial descrever as alterações moleculares da microglia com precisão para o estudo da heterogeneidade. Os avanços na tecnologia de sequenciamento de RNA unicelular (RNA-seq) permitiram a identificação das características moleculares da microglia ativada em condições patológicas13. Portanto, a capacidade de isolar populações celulares é fundamental para uma investigação mais aprofundada dessas células-alvo em condições específicas.
Estudos realizados para entender as características e funções da microglia são geralmente estudos in vitro, uma vez que se descobriu que um grande número de microglia primária pode ser preparada e cultivada a partir de cérebros de filhotes de camundongos (1-3 dias de idade), que se ligam aos frascos de cultura e crescem na superfície plástica com outras células glias mistas. Posteriormente, a microglia pura pode ser isolada com base naadesividade diferente das células glias mistas14,15. No entanto, este método só pode isolar a microglia do cérebro perinatal e leva várias semanas. Variáveis potenciais na cultura celular podem influenciar características microgliais, como a expressão molecular16. Além disso, a microglia isolada por esses métodos só pode participar de experimentos in vitro simulando as condições das doenças do SNC e não pode representar as características e funções da microglia in vivo estados da doença. Portanto, é necessário desenvolver métodos para isolar microglia do cérebro de camundongo adulto.
A triagem celular ativada pela fluorescência (FACS) e a separação magnética são dois métodos amplamente utilizados, embora tenham suas próprias limitações diferentes 16,17,18,19. Suas respectivas vantagens e desvantagens serão contrastadas na seção de discussão. O amadurecimento da tecnologia MACS oferece a possibilidade de purificar rapidamente as células. Huang et al. desenvolveram um método conveniente para rotular lesões desmielinizando no cérebro20. Combinando essas duas abordagens técnicas, propomos um protocolo de separação magnética CD11b rápido e eficiente, fornecendo uma descrição passo a passo para isolar a microglia em torno de lesões desmielinizantes em cérebros de camundongos adultos e preservar as características moleculares da microglia. As lesões desmielinizadores focais foram causadas pela injeção estereotática de 2 μL de solução de lisolecithin (1% LPC em 0,9% NaCl) no calosum do corpus 3 dias antes de iniciar o protocolo21. Este protocolo estabelece as bases para realizar o próximo passo em experimentos in vitro. Além disso, este protocolo economiza tempo e permanece viável para uso generalizado em vários experimentos.

<table><tbody><tr><td>Tubos de Micro Centrífuga de 1,5 mL</td><td>BIOFIL</td><td>CFT001015</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de Centrífuga de 15 mL</td><td>BIOFIL</td><td>CFT011150</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de Centrífuga de 50 mL</td><td>BIOFIL</td><td>CFT011500</td><td></td></tr><tr><td>70 &micro; m Filtro</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-095-823</td><td></td></tr><tr><td>Kit de Dissociação do Cérebro Adulto, camundongo e rato</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-107-677</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6J Camundongos</td><td>SJA Labs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD11b (Microglia) Grânulos, humanos e camundongos</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-634</td><td></td></tr><tr><td>Soro Fetal Bovino</td><td>BOSTER</td><td>PYG0001</td><td></td></tr><tr><td>FlowJo</td><td>BD Biosciences</td><td>V10</td><td></td></tr><tr><td>MACS MultiStand</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>MiniMACS Separador</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-102</td><td></td></tr><tr><td>Colunas MS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-201</td><td></td></tr><tr><td>Vermelho Neutro</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1013690025</td><td></td></tr><tr><td>NovoCyte Citômetro de Fluxo</td><td>Agilent</td><td></td><td>Um sistema que consiste de várias peças</td></tr><tr><td>NovoExpress</td><td>Agilent</td><td>1.4.1</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>BOSTER</td><td>PYG0021</td><td></td></tr><tr><td>Pentobarbital</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-010</td><td></td></tr><tr><td>Estereomicroscópio</td><td>MshOt</td><td>MZ62</td><td></td></tr></tbody></table>

isolamento da microglia primária do rato por triagem celular ativada por magnético em modelos animais de desmielinização

Isolation of Mouse Primary Microglia by Magnetic-Activated Cell Sorting in Animal Models of Demyelination

Microglia, as células imunes inatas residentes no cérebro, são os respondentes primários para inflamação ou lesão no sistema nervoso central (SNC). A microglia pode ser dividida em estado de repouso e estado ativado e pode mudar rapidamente o estado em resposta ao microambiente do cérebro. A microglia será ativada em diferentes condições patológicas e apresentará diferentes fenótipos. Além disso, existem muitos subgrupos diferentes de microglia ativada e grande heterogeneidade entre diferentes subgrupos. A heterogeneidade depende principalmente da especificidade molecular da microglia. Estudos revelaram que a microglia será ativada e desempenhará um papel importante no processo patológico da desmielinização inflamatória. Para entender melhor as características da microglia em doenças desmielinizantes inflamatórias, como esclerose múltipla e distúrbio do espectro neuromielite optica, propomos um protocolo de triagem microglial primária perilesional. Este protocolo utiliza a triagem celular ativada por colunaar (MACS) para obter microglia primária altamente purificada e preservar as características moleculares da microglia para investigar os efeitos potenciais da microglia em doenças desmielinizantes inflamatórias.

Microglia isolada usando contas CD11b têm alta pureza As células microgliais ao redor das lesões em modelos de camundongos desmielinização foram isoladas usando o protocolo acima mencionado e testadas por citometria de fluxo. As células são rotuladas fluorescentemente com isothiocyanato cd11b-fluoresceína (FITC) e CD45-alophycocyanin (APC) para determinar microglia na citometria de fluxo de acordo com as instruções do fabricante. Existem várias literaturas demonstrando que os anticorpos CD11b e CD45 s...

Aqui, apresentamos um protocolo para isolar e purificar a microglia primária em modelos animais de doenças desmielinizantes, utilizando a triagem celular ativada por colunas magnéticas.

Isolamento da Microglia Primária do Rato por Triagem celular ativada por magnético em modelos animais de desmielinização

Microglia, the resident innate immune cells in the brain, are the primary responders to inflammation or injury in the central nervous system (CNS). ...

Este protocolo ajuda a isolar microglia das lesões de desmielinização microdissectadas do cérebro de camundongos adultos para estudar as características microgliais in vivo. Esta técnica economiza tempo e tem requisitos menores para experimentadores e equipamentos. Este método ajuda a isolar a microglia do cérebro do animal, especialmente aqueles tecidos microdissectados em vários estados da doença.Comece por microdisstar as lesões rotuladas por corante neutro ao redor do caloso corpus sob um estereóscópio. Centrifugar o tecido dissecado a 300 vezes g durante 30 segundos para coletar a amostra na parte inferior do tubo. Enzimeia pré-aqueça uma e enzima misture de 2 a 37 graus Celsius em uma incubadora.Em seguida, adicione 1.950 microliters de enzima pré-aquecido misture de uma a uma amostra, e digerir em uma incubadora a 37 graus Celsius por cinco minutos. Adicione 30 microliters de enzima pré-aquecido misture dois e misture suavemente. Após a digestão, adicione quatro mililitros de PBS frio ao tubo e agite suavemente.Centrifugar as amostras de tecido a 300 vezes g por 10 minutos a quatro graus Celsius, e aspirar o supernante lentamente e completamente. Resuspenque a pelota de célula suavemente com 1.550 microliters de PBS frio. Adicione 450 microliters da solução fria para remoção de detritos e misture-os bem.Use uma pipeta de 1.000 microliteres para sobrepor a mistura muito lentamente, e suavemente com dois mililitros de PBS frio. Centrifugar a mistura e, em seguida, procurar as três camadas. Use uma pipeta de 1.000 microliteres para aspirar completamente as duas camadas superiores e encher o tubo até cinco mililitros com tampão de carregamento a frio.Inverta suavemente o tubo três vezes. Em seguida, após centrifugação e aspiração do supernante, resuspengue a pelota celular com 90 microliters de tampão de carga, e adicione 10 microliters de contas CD11b. Misture bem e incubar por 15 minutos a quatro graus Celsius.Após a incubação, adicione um mililitro do tampão de carga e lave as células, e tubos suavemente o líquido para cima e para baixo com uma pipeta de 1.000 microliter. Centrifugar as células a 300 vezes g por 10 minutos a quatro graus Celsius, e aspirar o supernatante completamente para remover as contas desvinculados. Resuspengue as células em 500 microlitres do tampão de carga, e coloque a coluna MS com seu separador para seleção positiva no campo magnético.Enxágüe a coluna com 500 microlitres do tampão de carga para proteger as células e garantir a eficiência da classificação magnética com base no protocolo do fabricante. Aplique a suspensão da célula na coluna MS e descarte o fluxo contendo as células não rotuladas. Adicione 500 microliters do tampão de carga para lavar a coluna e remova-a do separador.Coloque a coluna em um tubo de centrífuga de 15 mililitros e adicione um mililitro do buffer de carregamento na coluna. Finalmente, empurre o êmbolo para o fundo da coluna para eliminar as células magneticamente rotuladas. Uma representação esquemática da estratégia de gating usada na análise de citometria de fluxo de microglia isolada de lesões de desmielinação de camundongos adultos antes e depois da classificação celular ativada por magnético é mostrada aqui.As imagens gráficas representam a altura de dispersão dianteira e a altura de dispersão lateral para selecionar células, área de dispersão dianteira e altura de dispersão para a frente para a seleção de células únicas, e CD11b-FITC e CD45-APC para selecionar as células mielóides e microglia. A proporção de microglia aumentou significativamente após a triagem celular ativada por magnético. A imagem gráfica representa a estratégia de gating usada na análise de citometria de fluxo para células individuais vivas e mortas após a triagem celular ativada por magnético.Aqui, 7-aminoactinomicina D e altura de dispersão lateral foram usados para selecionar as células vivas. Ao tentar este procedimento, lembre-se precisamente de microdissccionar as lesões desmielinizantes sob um estereóscópio baseado nas marcas vermelhas neutras.

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Neste vídeo, descrevemos um protocolo para isolar células CD11b, incluindo microglia, de cérebros de filhotes de camundongos usando classificação de células ativadas por magnetismo. Os tecidos cerebrais são homogeneizados para obter suspensões unicelulares, que são incubadas com microesferas revestidas com anticorpos anti-CD11b, seguidas por uma separação baseada em coluna magnética para purificar a população de células CD11b+.

Isolamento magnético de microglia de cérebros de filhotes de camundongos

Este vídeo demonstra um método para isolar células oligodendrócitos primárias de uma suspensão de células neurais obtida de um filhote de camundongo usando separação magnética. A técnica emprega esferas magnéticas revestidas com anticorpos específicos para antígenos de oligodendrócitos, permitindo o isolamento seletivo dessas células.

Isolando oligodendrócitos primários murinos usando grânulos imunomagnéticos

Este vídeo demonstra um protocolo para extrair células microgliais de lesões desmielinizantes em cérebros de camundongos usando classificação magnética de células. O protocolo envolve a dissecação do tecido cerebral lesionado contendo células microgliais, o tratamento do tecido com enzimas específicas para obter uma suspensão unicelular e a utilização de esferas magnéticas específicas do receptor microglial para isolar as células microgliais.

Isolando a microglia de lesões desmielinizantes do cérebro de camundongos usando classificação de células ativadas por magnetismo

Aqui, nós apresentamos um protocolo para isolar microglia de crias de rato pós-natais (dia 1) para experimentação in vitro. Este método improvisada de isolamento gera tanto rendimento e pureza elevados, uma vantagem significativa em relação aos métodos alternativos que permite a ampla gama de experimentação para efeitos de elucidação da biologia da microglia.

Isolamento magnético rápido e refinado CD11b da Primária Microglia com pureza e versatilidade

Um protocolo para a isolação de micróglia primária do cérebro murino é apresentado. Esta técnica ajuda a promover o entendimento atual de condições neurológicas. Centrifugação de gradiente de densidade e separação magnética são combinados para produzir rendimento suficiente de uma amostra altamente puro. Além disso, descrevem as etapas para a caracterização da micróglia.

Caracterização e isolamento de Mouse Microglia primária por centrifugação gradiente de densidade

Descrevemos o isolamento de Fima de oligodendrócitos mouse principal, que permite o isolamento das células para cultura em vitro rápido e específico.

Isolamento de Fima rápida e específica de oligodendrócitos primário de Mouse

Nós fornecemos um protocolo para o isolamento da microglia de diferentes regiões dissecadas de um hemisfério cerebral de camundongo adulto, seguido de preparação de biblioteca semi-automatizada para sequenciamento profundo de RNA unicelular de transcrições completas. Este método ajudará a elucidar a heterogeneidade funcional da microglia na saúde e na doença.

Isolamento da Microglia específica da Região de um hemisfério cerebral de camundongo adulto para sequenciamento profundo de RNA unicelular

Culturas primárias de micróglias são comumente usadas para avaliar novas moléculas anti-inflamatórias. O presente protocolo descreve um método reprodutível e relevante para isolar magneticamente a micróglia de filhotes recém-nascidos.

Isolamento Magnético de Células Microgliais de Rato Neonato para Culturas Celulares Primárias

Descrevemos um protocolo para isolar células microgliais do hipotálamo de camundongo (ou pequenas estruturas cerebrais equivalentes) usando classificação de células ativadas magneticamente (MACS), em um tempo relativamente curto. A microglia hipotalâmica classificada por MACS pode ser usada para análise ex vivo e pode ser plaqueada para realizar ensaios in vitro .

Isolamento da microglia hipotalâmica do cérebro de camundongo adulto recém-perfundido por classificação de células ativadas por magnetismo  

Nós estabelecemos modelos do rato de leucomalácia periventricular (LPV), a lesão cerebral predominante em prematuros caracterizada por lesões na substância branca periventricular. Hipóxia / isquemia com / sem infecção sistêmica são as principais causas de LPV. Ligadura da carótida unilateral e exposição a hipóxia com / sem injeção de lipopolissacarídeo cria PVL-como lesões em camundongos P6.

Modelos de mouse de leucomalácia periventricular

Aprenda a isolar microglia primária de lesões de desmielinização em cérebro de rato adulto usando triagem celular ativada por magnético. Este método otimiza tempo e recursos para estudos de neuroinflamação.

Isolamento da Microglia Primária do Rato por Triagem celular ativada por magnético em modelos animais de desmielinização

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