Detecção e Captura em Tempo Real de Subpopulações celulares invasoras de co-culturas

Descrevemos uma abordagem para detectar e capturar subpopulações celulares invasivas em tempo real. O projeto experimental utiliza a Análise Celular em Tempo Real monitorando mudanças na impedância elétrica das células. Podem ser capturados câncer invasivo, células endoteliais ou estromais em tecidos complexos, e o impacto das co-culturas pode ser avaliado.

Esta técnica permite a identificação das células com diferentes capacidades invasivas sob a influência de fatores secretados a partir de células estromas co-cultivadas. A técnica avalia o impacto de fatores secretados de células estromais ou imunes co-cultivadas na invasão celular. Também permite a recuperação e análise de subpopulações celulares invasivas presentes em misturas de células heterogêneas.

A técnica pode determinar quais tumores abrigam subpopulações celulares invasoras que levam à metástase. A captura e análise de células cancerígenas invasivas pode informar as decisões terapêuticas. Para começar a cultura celular, lave as culturas celulares de adesão com aproximadamente 70% de confluência com soro fisiológico tamponado 1X.

Em seguida, adicione 0,05% de trippsina e solução EDTA para decolar das células. Neutralizar a solução de trippsina com meios de cultura celular contendo soro e contar as células usando uma alíquota da suspensão celular. Coloque as três câmaras estéreis na capa da cultura tecidual.

Localize o botão no lado curto da câmara inferior e oriente a câmara inferior para que o botão esteja voltado para o experimentador. Adicione 30.000 a 50.000 células em 90 microliters de mídia para cada poço da câmara inferior sem formar bolhas. Use 5% da mídia bovina bovina suplementada em duas câmaras inferiores como controle positivo para motilidade celular, e use mídia suplementada 0%soro como controle negativo.

Gire a câmara inferior a 90 graus depois de deixá-la se contentar por 10 a 15 minutos no capô. Em seguida, coloque a câmara do meio em cima para que o botão na câmara inferior deslize para o entalhe na câmara do meio. Empurre a câmara verticalmente para baixo até que um clique seja ouvido de cada um dos lados longos da montagem.

Adicione 160 microliters de mídia sem soro a todos os poços da câmara do meio. Certifique-se de que um menisco em forma de cúpula seja visível depois que os poços forem preenchidos e coloque a câmara superior com eletrodos voltados para a câmara do meio para alinhar os pontos azuis nas câmaras média e superior. Empurre a câmara verticalmente para baixo até que um som de clique seja ouvido de cada um dos lados longos da montagem.

Adicione 20 a 50 microliters de mídia sem soro à câmara superior. Monte o conjunto no analisador de células de dupla finalidade na incubadora de cultura tecidual e espere 30 minutos antes de medir o fundo. Abra o software do analisador de células e selecione o berço a ser usado, seguido de um clique na guia da mensagem e certifique-se de que diz conexões bem"para garantir que a matriz esteja bem colocada no berço e os eletrodos estejam bem alinhados com os sensores.

Clique na guia de notas do experimento e preencha todas as informações possíveis sobre o experimento. Em seguida, clique na guia layout e preencha a descrição do layout do array. Em seguida, clique na guia de programação e adicione dois passos do menu passos, um passo de fundo com uma varredura e uma etapa de teste com 100 varreduras.

Uma vez que a matriz tenha estado na incubadora de analisadores de células de uso duplo por 30 minutos, clique no botão de reprodução para iniciar a medição de fundo. Depois que a medição de fundo for feita, remova a matriz do berço e coloque-a de volta na capa de cultura celular. Em seguida, adicione 30.000 a 50.000 células em 100 microliters de mídia livre de soro para cada poço da câmara superior.

Estas são as células que o eletrodo detectará assim que migrarem com sucesso através da membrana. Deixe a montagem ficar no capô por 30 minutos antes de montar no analisador de células de dupla finalidade para medição de impedância. Coloque a matriz de volta no analisador de células de uso duplo e verifique a guia de mensagens para a mensagem Conexões ok".

Clique no botão reproduzir para iniciar a medição de impedância e, em seguida, clique na guia plot para monitorar o progresso do sinal. Se o ponto final for atingido antes de 25 horas, clique na etapa de abortagem do menu suspenso executar. Para exportar dados, clique com o botão direito do mouse no gráfico, escolha copiar no formato da lista e, em seguida, cole os dados em uma planilha.

Monitore a taxa de migração em tempo real no analisador de células de dupla finalidade para determinar o ponto de parada de juros. Uma vez alcançado, desmonte o conjunto do analisador celular de dupla finalidade e coloque-o na capa da cultura tecidual. Prepare um número apropriado de 1,5 mililitros de tubos de microcentrífuga para coletar as células dos poços de interesse.

Coloque o conjunto em uma antena de 10 centímetros para conter líquidos quando as câmaras se soltarem. Empurre as extremidades flexíveis de estalo no lado longo da câmara média para dentro até que um som de clique seja ouvido, seguido por desmontar a câmara superior e inverti-la em um novo prato de 10 centímetros. Use um levantador de células com uma lâmina de 13 milímetros para coletar as células de todos os poços que abrigam a mesma condição experimental.

Enxágüe ou mergulhe a lâmina em salina tamponada de fosfato 1X para coletar as células em tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitro. Em seguida, gire as células a 500 vezes G por cinco minutos e propague essas células coletadas ou realize análises de ponto final, como sequenciamento de RNA unicelular. A avaliação da invasão das células na presença ou ausência de células estromais mostrou que a invasão celular MDA-MB-231 foi reforçada quando os fibroblastos Irracões Suíço-3T3 J2 estavam sentados na câmara inferior para a troca de fatores entre as duas linhas celulares.

Curiosamente, a invasão MDA-MB-231 aumentou quando as células 3T3 J2 foram dobradas em número. Por outro lado, a taxa de invasão de um clone invasivo de células MCFDCIS, DCIS-Delta Four, parece ser inibida pelo crosstalk com células 3T3 J2, sugerindo a aplicação valiosa da matriz de três câmaras para medir efeitos variados do estroma. Neste caso, fibroblastos na invasão celular.

As células endoteliais da veia umbilical humana foram mais invasivas em resposta a fatores secretados pelas células MDA-MB-231, ao contrário daquelas secretadas pelas células DCIS, o que é consistente com a capacidade de tumores invasivos de recrutar células endoteliais para formação de vasos sanguíneos e posterior disseminação na circulação. A invasão de células de xenoenxerto derivada do paciente da câmara superior aumentou em resposta às células imunes da medula óssea humana co-cultivadas. Curiosamente, a presença de 2% de soro na câmara inferior com as células imunes da medula óssea humana foi essencial para a invasão de xenoenxertos derivados pelo paciente.

Poços podem ser revestidos com uma matriz extracelular para imitar a barreira da membrana do porão. Agentes terapêuticos podem ser adicionados à mídia nos poços para monitorar seu efeito na invasão.