Name: Ablação laser direcionada no embrião de Saccharina latissima (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 30 s
Description: Aprenda a técnica de ablação a laser direcionada em embriões de Saccharina latissima para investigar destino celular e interações durante a embriogênese em algas pardas.

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A bolsa de doutorado da S.B. é financiada pela Region Bretagne (Número de Subvenção ARED COH20020) e pela Sorbonne Université. I.T.is bolsa de doutorado é financiada pela Região Bretagne (Número de Subvenção ARED COH18020) e pela Universidade Norvegiana NMBU. Este projeto recebeu apoio financeiro do CNRS por meio dos programas interdisciplinares do MITI. MRic é membro da infraestrutura nacional France-BioImaging apoiada pela Agência Nacional de Pesquisa francesa (ANR-10-INBS-04).

1. Produção de Gametofitos de Saccharina latissima
<ol><li>Coletar esporofitos maduros de S. latissima da natureza como descrito anteriormente20,21. Certifique-se de que os esporofitas selecionados são desprovidos de epífitas (pequenos organismos visíveis na superfície da lâmina) ou parasitas internos (encontrados nas áreas branqueadas ou manchas na lâmina). 
</li>
	<li>Usando um bisturi, corte a parte mais escura no centro da lâmina (tecido fértil produtor de esporos22) em 1-5 pedaços quadrados (1 cm²), evitando quaisquer manchas branqueadas, se presentes.</li>
	<li>Remova todas as epífitas restantes limpando suavemente os pedaços cortados com a parte de trás de um bisturi e algum papel absorvente.</li>
	<li>Coloque as peças limpas em um prato de vidro recheado com água do mar natural estéril (ver Tabela de Materiais) por 45 minutos para liberar esporos após o relatório publicado anteriormente22.</li>
	<li>Remova os pedaços da lâmina e filtre a água do mar através de um filtro de células de 40 μm para remover detritos ou organismos indesejados.</li>
	<li>Diluir os esporos no filtrado a uma concentração de 20-40 esporos/mL em placas de Petri de plástico22.</li>
	<li>Coloque a solução de esporos em um armário de cultura (ver Tabela de Materiais) configurado com as condições de cultura ideais (13 °C, 24 μE.m-2.s-1, fotoperíodo 16:8 L:D).</li>
	<li>Permita que os esporos germinem e se desenvolvam em gametofitas. NOTA: A germinação do esporo é visível após 2 dias no gabinete, e a primeira divisão celular das células gametofísticas geralmente ocorre dentro das seguintes 48 horas.</li>
	<li>Substitua o meio de crescimento após 5 dias por água do mar natural microfilmada enriquecida com uma solução 0,5x Provasoli (NSW1/2) (ver Tabela de Materiais). NOTA: Para evitar repetir essas etapas, gametofitas específicas masculinas e femininas podem ser selecionadas e propagadas vegetativamente por vários meses. Os gametofittes permanecem vegetativos quando cultivados sob a luz vermelha (4 μE.m-2.s-1 com um comprimento de onda de pelo menos 580 nm)23 nas mesmas condições de cultura descritas acima (passo 1.7).</li>
</ol>2. Fragmentação e indução da oogênese
<ol><li>Colher gametofittes com um raspador de células.</li>
	<li>Usando um pequeno pilão plástico, esmague os gametofittes coletados em um tubo de 1,5 mL em pedaços de 4-5 células.</li>
	<li>Encha o tubo com 1 mL NSW1/2 (etapa 1.9).</li>
	<li>Adicione 2,5 μL da solução gametofito esmagada em 3 mL de água do mar natural enriquecida com solução 1xoli Provas (NSW) e coloque-as em uma placa de Petri. NOTA: Recomenda-se uma placa de Petri com fundo de vidro de 25 mm para facilitar o manuseio.</li>
	<li>Coloque os pratos preparados em um armário de cultura e induza gametogênese a 13 °C sob luz branca com uma intensidade de 24 μE.m-2.s-1 (luz fraca, fotoperóuodo 16:8 L:D). NOTA: A primeira gametangia (oogonia feminina e arquegônia masculina) pode ser observada após 5 dias. O macho é hiper-ramificado com pequenas células, e a fêmea é composta de células maiores formando filamentos longos15,22. Os primeiros ovos são observados ~10 dias depois, e a primeira divisão de zigotos geralmente ocorre nos próximos 2 dias.</li>
	<li>Seis dias após observar os primeiros ovos, transfira os pratos para condições mais brilhantes de luz branca: 50 μE.m-2.s-1, fotoperíodo 16:8 L:D, ainda a 13 °C.</li>
</ol>3. Aquisição de imagens para seleção de embriões para ablação e monitoramento do crescimento subsequente
<ol><li>Imagem toda a placa de Petri para (re)localizar os embriões selecionados durante a etapa de ablação (não há necessidade de retornar a placa ao microscópio ocular) e monitorar o desenvolvimento subsequente dos embriões selecionados. NOTA: Use um microscópio confocal de escaneamento a laser invertido (ver Tabela de Materiais) para imagem (Figura 1), e a ablação a laser é descrita na etapa 5.</li>
	<li>Coloque a placa de Petri no palco e oriente-a com uma marca visual (por exemplo, desenhe uma linha com um marcador permanente).</li>
	<li>Use o objetivo 10x/0.45 para focar em um embrião. Regissua a posição dos quatro pontos cardeais da placa de Petri.</li>
	<li>Inicie a varredura de ladrilhos. Adquira imagens transmitidas/fluorescentes de toda a placa de Petri em baixa resolução: 256 x 256 pixels, um tempo de 1,54 μs com digitalização bidirecional e um zoom digital de 0,6x usando um laser de 561 nm a 1,2% de transmissão. NOTA: O tempo de varredura para uma placa petri inteira de 2,5 cm é de ~6 min para 225 telhas (Figura 2). Aqui, o laser de 561 nm foi usado para transmissão e fluorescência. O sinal de fluorescência foi coletado entre 580-720 nm nos fotomultipliers confocal (PMT) e a luz transmitida foi coletada no PMT transmitido. O laser de 561 nm também pode monitorar clorofila nesta etapa, mas é desnecessário porque só ajuda a distinguir o ruído do sinal e os organismos corretamente.</li>
	<li>Salve a imagem de varredura de ladrilhos e mantenha-a aberta na janela do software de aquisição de imagens (ver Tabela de Materiais).</li>
	<li>Mude o objetivo, não remova a placa de Petri. NOTA: O objetivo da água 40x/1.2 foi movido para o lado do palco para que o meio de imersão (água) pudesse ser adicionado ao objetivo sem mover a placa de Petri de sua posição inicial.</li>
	<li>Navegue pela imagem de varredura de ladrilhos adquirida anteriormente para selecionar o embrião apropriado. Uma vez identificado um embrião nesta imagem, mova o palco para a posição exata do embrião e adquira imagens transmitidas/fluorescentes desse embrião em alta resolução. NOTA: Configurações de alta resolução: 512 x 512 pixels, 0,130 μm/pixel, 0,208 μs pixel com digitalização monodirecional e zoom digital de 2x usando um laser de 561 nm a 0,9% de transmissão.</li>
	<li>Anote a imagem de varredura de ladrilhos para cada candidato a ablação a laser (Figura 2B) e prossiga para o passo de ablação a laser.</li>
</ol>4. Calibração a laser
<ol><li>Calibrar o laser e sincronizar o software de aquisição de imagens com o software laser-driver no "Modo Clique & Fogo" e um laser pulsado de 355 nm. NOTA: Esta etapa é crucial para garantir a perfeita sincronização entre a posição do cursor do mouse no software laser-driver (ver Tabela de Materiais) com a posição na imagem ao vivo do software de aquisição.</li>
	<li>Abra o pacote de software de driver a laser e clique em Live no pacote de software de aquisição de imagens.</li>
	<li>Sincronize ambos os pacotes de software clicando na aquisição do Start no pacote de software laser-driver. A imagem ao vivo agora também é registrada no software UV laser-driver.</li>
	<li>Defina uma área de interesse (AOI) clicando no botão Escolher AOI e clicando nas bordas da imagem (direita, esquerda, superior e inferior) no pacote de software UV laser-driver. NOTA: Após esta etapa de calibração, as configurações para tamanho de pixel, formato de imagem e zoom no pacote de software de aquisição devem permanecer constantes.</li>
	<li>Selecione uma área vazia no prato e baixe o nível do palco para 20 μm abaixo do plano focal da amostra para se concentrar no fundo do vidro.</li>
	<li>Defina as trajetórias de laser de ablação e imagem a laser clicando em Iniciar a calibração e escolha calibração manual.</li>
	<li>Selecione um poder laser alto o suficiente para ver um ponto negro no centro da imagem ao vivo correspondente ao orifício na tampa de vidro (todas as persianas devem estar abertas).</li>
	<li>Clique neste ponto preto central com o cursor do mouse e clique em 18 pontos adicionais propostos pelo software para concluir o procedimento de alinhamento.</li>
	<li>Verifique a calibração no "Modo Clique & Fogo" no mesmo deslizamento de tampas. NOTA: A calibração do laser depende dos parâmetros de imagem. Uma vez calibrado o laser, certifique-se de que os parâmetros de imagem (ou seja, 512 x 512 pixels, 0,130 μm/pixel, 0,208 μs pixel com digitalização monodirecional e zoom digital 2x) não foram alterados.</li>
</ol>5. Ablação a laser
<ol><li>Selecione um embrião de interesse. Inicie uma gravação de lapso de tempo no software de aquisição de imagens.</li>
	<li>Adquira imagens de transmissão/fluorescência com um objetivo de 40x/1,2 W em alta resolução (ou seja, 512 x 512 pixels, 0,130 μm/pixel, 1,54 μs pixel com digitalização monodirecional e zoom digital de 2x usando um laser de 561 nm a 0,9% de transmissão). Adquira a gravação de lapso de tempo na velocidade máxima.</li>
	<li>Desaceção para fora da área no início da gravação de lapso de tempo. Aproxime-se da AOI.</li>
	<li>Use a função "Click & Fire" do software laser-driver para aplicar a irradiação prejudicial na célula de interesse no embrião. Utilize os seguintes parâmetros: transmissão a laser de 45% (correspondente a um máximo de 40 μW) e 1 ms de duração do tempo de pulso (etapa 4). NOTA: Recomenda-se a gravação de vídeo durante o disparo a laser.</li>
	<li>Abaixo de 688 nm, monitore a ejeção de cloroplastos autofluorescentes do citoplasma.</li>
	<li>Se o conteúdo da célula permanecer na célula, use a função "Clique & Fogo" mais uma vez para aumentar o tamanho da brecha na célula. Repito, mantendo o número de fotos ao mínimo até que a maioria dos conteúdos do celular tenham sido liberados.</li>
	<li>Pare a gravação do lapso de tempo após a estabilização do embrião (ou seja, nenhum movimento intracelular adicional pode ser detectado (~1-5 min).</li>
	<li>Atualize a anotação na imagem de varredura de ladrilhos, se necessário.</li>
</ol>6. Monitorando o crescimento de embriões irradiados
NOTA: O monitoramento é realizado ao longo de vários dias.
<ol><li>Determine a taxa de sobrevivência monitorando o número de embriões que se desenvolvem após a ablação a laser e compare-os com aqueles que morrem. NOTA: Alguns embriões morrem imediatamente após a ablação por várias razões. Uma alta e rápida taxa de mortalidade é geralmente um sinal de parâmetros de laser inadequados ou maior/maior exposição ao estresse durante o experimento ou transporte subsequente.</li>
	<li>Determine o atraso de crescimento medindo o comprimento dos embriões a laser todos os dias e comparando-o com embriões intactos. NOTA: A taxa de crescimento de organismos a laser é geralmente mais lenta do que a de organismos não tratados. No entanto, algumas configurações (inadequadas) de laser podem inibir o crescimento por mais de uma semana, com o crescimento retomando depois disso.</li>
	<li>Descubra o dano adjacente monitorando a reação das células adjacentes às células abladas. Em alguns casos, a despressurização pós-explosão pode causar o estouro de células vizinhas.</li>
	<li>Verifique se há contaminações de micróbios. Monitore o crescimento de microalgas e bactérias no meio. Se um nível incomum de micróbios estiver presente no prato, então descarte-o e repita o protocolo da etapa 2 ou passo 3. NOTA: Após a ablação a laser, embriões de S. latissima danificados já estão altamente estressados, e estresse externo adicional pode causar aumento da mortalidade. Surtos bacterianos ou virais são possíveis porque os embriões tratados não podem crescer em condições axeônicas.</li>
	<li>Verifique o desenvolvimento global dos organismos de tiro, estudando o fenótipo e entendendo o papel no desenvolvimento da região alvo.</li>
</ol>

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</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

A ablação a laser celular local permite a ablação temporal e espacial com um alto nível de precisão. No entanto, sua eficiência pode ser dificultada pela não acessibilidade das células-alvo; por exemplo, todas as células são de um embrião tridimensional. Este protocolo foi desenvolvido no embrião da alga Saccharina latissima, que desenvolve uma lâmina monocamada na qual todas as células podem ser facilmente distinguidas e destruídas individualmente com um raio laser.
Poder las...

A ablação a laser tem sido usada há décadas para estudar o desenvolvimento de embriões. Irradiar células embrionárias com um raio laser torna possível monitorar o potencial regenerativo e a modificação da linhagem celular durante a embriogênese e investigar o impacto da ablação direcionada na divisão celular e no destino celular. Os organismos modelo utilizados em métodos de ablação a laser são tipicamente animais, como insetos 1,2, nematoides 3,4, vertebrados 5,6 e, ocasionalmente, plantas 7,8. Além disso, uma abordagem de micro-ablação a laser foi usada na alga marrom Fucus em 1994 e 1998 para demonstrar o papel da parede celular na fotopolarização do embrião inicial 9,10.
Algas marrons pertencem ao grupo Stramenopiles, divergiram na raiz da árvore eucariótica há 1,6 bilhões de anos. Como resultado, são filogeneticamente independentes de outros organismos multicelulares, como animais e plantas11. Saccharina latissima pertence à ordem Laminariales, mais comumente conhecida como algas, e estão entre os maiores organismos da Terra, atingindo tamanhos de mais de 30 m. Saccharina sp. é uma grande alga marinha usada para muitas aplicações, como alimentos e ração, e seus polissacarídeos são extraídos para uso nas indústrias agrícola, farmacológica e cosmética em todo o mundo12, 13 anos. Seu cultivo, principalmente na Ásia e mais recentemente na Europa, requer a preparação de embriões em incubatórios antes de liberar jovens em mar aberto. Como todas as algas, ela tem um ciclo de vida bifásico composto por uma fase gametofitica microscópica, durante a qual um gametofito de haploide cresce e produz gametas para fertilização, e uma fase esporofítica macroscópica diploide, onde uma grande lâmina planar se desenvolve a partir de seu protetor de retenção ligado ao fundo do mar ou rochas. O sporófito libera esporos haploides na maturidade, completando assim o ciclo de vida 14,15,16.
S. latissima apresenta algumas características morfológicas interessantes17. Seu embrião desenvolve-se como uma folha de planar monocamadas 15,18,19 antes de adquirir uma estrutura multicamadas coincidindo com o surgimento de diferentes tipos de tecidos. Além disso, laminariales é um dos únicos taxas de algas marrons cujos embriões permanecem ligados ao seu tecido gametofistico materno (Desmarestiales e Sporochnales também15). Essa característica oferece a oportunidade de estudar o papel do tecido materno nesse processo de desenvolvimento e comparar mecanismos de controle materno em algas marrons com os de animais e plantas.
Este artigo apresenta o primeiro protocolo completo para ablação a laser em um embrião de algas primitiva. Este protocolo envolvendo a técnica UV ns-pulsed resulta na destruição específica de células embrionárias individuais para estudar seus respectivos papéis durante a embriogênese. O procedimento oferece uma abordagem confiável para investigar interações celulares e destino celular durante a embriogênese em Laminariales.

<table><tbody><tr><td>Placa de Petri com fundo de vidro de 25 mm</td><td>NEST</td><td>801001</td><td></td></tr><tr><td>Água do mar autoclavada</td> <td>-</td><td></td> <td>Coletada no mar perto da bóia Astan (48&deg; 44.934 N 003&deg; 57.702 W) perto de Roscoff, França, a uma profundidade de 20 m.</td></tr><tr><td>Raspador de células</td><td>MED 2</td><td>83.3951</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de células 40 &micro; m</td><td>Corning / Falcon</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>Armários de Cultura</td><td>Snijders Scientific Plant Growth Cabinet ECD01</td><td></td><td>Qualquer outra marca é adequada, desde que a intensidade da luz, o fotoperíodo e a temperatura possam ser controlados.</td></tr><tr><td>LSM 880 Microscópio confocal Zeiss</td><td>Microscopia Carl Zeiss, Jena, Alemanha</td><td></td><td>A ablação e a imagem foram realizadas usando uma objetiva de água 40x/1,2</td></tr><tr><td>Pilões de pellets</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z359947</td><td>Polipropileno azul (autoclavável)</td></tr><tr><td>Suplemento Provasoli-A</td><td></td><td></td> <td>receita está disponível aqui: http://www.sb-roscoff.fr/sites/www.sb-roscoff.fr/files/documents/station-biologique-roscoff-preparation-du-provasoli-2040.pdf</td></tr><tr><td>Laser pulsado 355 (UGA-42 Caliburn 355/25)</td><td>Rapp OptoElectronic, Wedel, Alemanha</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bisturi</td><td>Paramount</td><td>PDSS 11</td><td></td></tr><tr><td>SysCon software</td><td>Rapp OptoElectronic, Wedel, Alemanha</td><td></td><td>Software de driver de laser</td></tr><tr><td>ZEN</td><td>Microscopia Carl Zeiss, Jena, Alemanha</td><td></td><td>Software de imagem, usado em conjunto com o software SysCon; Versão Black 2.3</td></tr></tbody></table>

ablação laser direcionada no embrião de saccharina latissima

Targeted Laser Ablation in the Embryo of Saccharina latissima

Em Saccharina latissima, o embrião desenvolve-se como uma folha celular monocamada chamada lamina ou a lâmina. Cada célula embrionária é fácil de observar, prontamente distinguível de seus vizinhos, e pode ser alvo individual. Por décadas, a ablação a laser tem sido usada para estudar o desenvolvimento de embriões. Aqui, um protocolo para ablação a laser específica para células foi desenvolvido para embriões iniciais da alga marrom S. latissima. O trabalho apresentado inclui: (1) a preparação de embriões de Sacarina , com descrição dos parâmetros críticos, incluindo condições culturais, (2) as configurações de ablação a laser e (3) o monitoramento do crescimento subsequente do embrião irradiado utilizando microscopia de lapso de tempo. Além disso, são fornecidos detalhes sobre as condições ideais para o transporte dos embriões da plataforma de imagem de volta ao laboratório, o que pode afetar profundamente o desenvolvimento subsequente de embriões. Algas pertencentes à ordem Laminariales exibem padrões de embriogênese semelhantes à Sacarina; este protocolo pode, assim, ser facilmente transferido para outras espécies neste taxon.

Gametofitas de S. latissima foram cultivadas , e gametogênese foi induzida a produzir zigotes e embriões. Doze dias após a indução da gametogênese, os embriões foram submetidos à ablação a laser. Aqui, o experimento teve como objetivo avaliar o papel de células específicas no desenvolvimento global de embriões de S. latissima . A célula mais apical, a célula mais basal, e as células medianas foram alvo. Após a varredura de telhas, toda a placa de Petri (Figura 2A), um embri...

A destruição de células específicas no embrião é uma ferramenta poderosa para estudar as interações celulares envolvidas no destino celular. O presente protocolo descreve técnicas para a ablação a laser de células-alvo no embrião inicial da alga marrom Saccharina latissima.

Ablação laser direcionada no embrião de Saccharina latissima

In Saccharina latissima, the embryo&#160;develops as a monolayered cell sheet called the lamina or the blade. Each embryo cell is easy to observe, readily ...

Este protocolo é o primeiro protocolo completo de ablação a laser no embrião de algas precoces. O procedimento oferece uma abordagem confiável na investigação do destino celular e interação durante a embriogênese em algas marrons. A ablação a laser celular local permite a ablação temporal e especial com um alto nível de precisão e tecido nas células.Esta abordagem é um método promissor para estudar destinos celulares e interação no embrião inicial de algas marrons. Pode ser aplicado a outros sistemas de algas com poucas alterações. Comece por imagens de toda a placa de Petri para localizar os embriões para seleção durante a etapa de ablação e monitorar o desenvolvimento subsequente dos embriões selecionados.Inicie a varredura de ladrilhos. Regissua a posição dos quatro pontos cardeais da placa de Petri. Digite os parâmetros conforme definido no manuscrito do texto e adquira imagens transmitidas ou fluorescentes de toda a placa de Petri em baixa resolução.Salve a imagem de varredura de ladrilhos e mantenha-a aberta na janela do software de aquisição de imagens. Mude o objetivo sem remover a placa de Petri. Encontre embriões de interesse na varredura.Para calibrar o laser, abra o dri

targeted-laser-ablation-in-the-embryo-of-saccharina-latissima

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

Um método é descrito para photoactivate células individuais contendo uma proteína fluorescente enjaulado usando absorção de dois fótons de uma Ti: Sapphire oscilador laser de femtossegundos. Para mapear o destino da célula fotoativados, imuno-histoquímica é usada. Esta técnica pode ser aplicada a qualquer tipo de célula.

Mapeamento Destino única célula em Zebrafish

O método aqui apresentado compreende a lesão precisa de embriões vivos zebrafish com pulsos de laser de alta potência e a subsequente análise das lesões e sua recuperação com o tempo. Também mostramos como geneticamente marcado individual ou grupos de células do músculo esquelético pode ser monitorado durante e após o laser danos leves induzido.

Laser-infligido Lesão de Zebrafish muscular esquelético embrionário

Source: Morsch, M.,  et. al., Triggering Cell Stress and Death Using UV Laser Confocal Microscopia Convencional. J. Vis. Exp. (2017) Neste vídeo, exploramos a técnica de ablação a laser UV de alta intensidade para direcionar e estudar com precisão neurônios individuais em peixes-zebra transgênicos. Demonstramos como preparar, imobilizar e visualizar respostas neuronais, destacando a dinâmica celular da lesão e recuperação.

Ablação seletiva a laser de neurônio único em uma larva de peixe-zebra usando um microscópio confocal

Source: &lt;a style='text-decoration:none;' href='https://app.jove.com/v/57485/ ablação-neuronal-população-usando-dois-fótons-laser-sua-avaliação'&gt;Muto, A., et al. Ablação de uma população neuronal usando um laser de dois fótons e sua avaliação usando imagens de cálcio e registro comportamental em larvas de peixe-zebra. J. Vis. exp. (2018) Neste vídeo, é demonstrado um procedimento de ablação a laser de dois fótons, permitindo a destruição seletiva de neurônios fluorescentes em larvas de...

Ablação neuronal direcionada usando microscopia de dois fótons em uma larava de peixe-zebra

O hawaiensis anfípode Parhyale é um organismo modelo promissor para estudos de embriologia e desenvolvimento crustáceo artrópodes comparativa e evolução. Este protocolo descreve um método para a remoção manual dos blastómeros individuais a partir de embriões de fase de clivagem precoces de Parhyale.

Ablação de uma única célula de oito células de embriões de Crustáceo anfípodes<em&gt; Parhyale hawaiensis</em

Este protocolo mostra como realizar microinjeção citoplasmática em zigotos de animais de fazenda. Essa técnica pode ser usada para fornecer qualquer solução ao embrião de uma célula, como ferramentas de edição de genoma para gerar animais nocauteados.

Citoplasmática microinjeção no gado zigotos assistida laser

A ablação a laser é uma tecnologia amplamente aplicável para estudar a regeneração em sistemas biológicos. O protocolo apresentado descreve o uso de um microscópio confocal padrão de varredura a laser para ablação a laser e imagens subsequentes de lapso de tempo de células interneuromast regeneradoras na linha lateral do zebrafish.

Ablação e Regeneração a laser baseada em microscópio confocal em células interneuromast baseadas em zebrafish

O desenvolvimento embrionário requer coordenação em larga escala do movimento celular. A ablação a laser mediada por dois fótons permite a ablação espacialmente controlada em três dimensões de grandes grupos de células profundas. Além disso, essa técnica pode sondar a reação de células migratórias coletivamente in vivo a perturbações em seu ambiente mecânico.

Ablações de volume profunda e espacialmente controladas usando um microscópio de dois fótons no Gás de Peixe-Zebra

O presente protocolo descreve um método para induzir lesões específicas de tecido e altamente reprodutíveis em larvas de zebrafish usando um sistema de lesão a laser combinado com uma plataforma microfluida automatizada para o manuseio de larvas.

Lesões semi-automatizadas semi-automatizadas controladas por laser para estudar a regeneração da medula espinhal em larvas de zebrafish

Este protocolo demonstra a ablação de células a laser de neurônios individuais em larvas intactas de Drosophila . O método permite o estudo do efeito da redução da competição entre neurônios no sistema nervoso em desenvolvimento.

Ablação de células a laser em larvas intactas de Drosophila revela competição sináptica

Este protocolo descreve uma abordagem de ablação a laser de dois fótons realizada em larvas de peixe-zebra, que serve como modelo para estudar a regeneração óssea e os efeitos da resposta imune à ablação.

Ablação mediada por laser de dois fótons de osteoblastos em larvas de peixe-zebra em desenvolvimento

Aprenda a técnica de ablação a laser direcionada em embriões de Saccharina latissima para investigar destino celular e interações durante a embriogênese em algas pardas.

Ablação laser direcionada no embrião de Saccharina latissima

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