Coleta rotineira de conjuntos de dados crio-EM de alta resolução usando microscópio eletrônico de transmissão de 200 KV
16 de março de 2022
Mapas crio-EM de alta resolução de macromoléculas também podem ser alcançados usando microscópios TEM de 200 kV. Este protocolo mostra as melhores práticas para definir alinhamentos ópticos precisos, esquemas de aquisição de dados e seleção de áreas de imagem que são essenciais para a coleta bem-sucedida de conjuntos de dados de alta resolução usando um TEM de 200 kV.
O Crio-EM tornou-se uma técnica padrão para a determinação da estrutura de proteínas e seus complexos. Este protocolo descreve as melhores práticas de como obter conjuntos de dados Cryo-EM de alta resolução a partir dos microscópios TEM de 200 kV de gama média. O Crio-EM pode determinar a estrutura proteica em condições quase nativas em solução para vários estados conformacionais e estados funcionais simultaneamente, o que é evasivo para outras técnicas estruturais.
Informações estruturais obtidas podem ser utilizadas para a elucidação de mecanismos moleculares da função proteica, bem como para o desenho de medicamentos baseados em estruturas. Por exemplo, uma publicação recente na estrutura de fibrilas amiloides revelou vários locais de ligação de um ligante vital. No entanto, neste protocolo, usamos as amostras padrão de apoferritina e proteasome para demonstrar os passos críticos na obtenção de dados Cryo-EM de alta resolução.
A operação de um Crio-TEM tornou-se mais fácil nos últimos anos, especialmente devido à introdução de recursos avançados de automação. No entanto, para a primeira sessão, aconselhamos que você tenha um treinamento com usuários mais experientes. A partir daí, a progressão na técnica é relativamente rápida.
Demonstrando o procedimento estará Adrian Koh, que é cientista sênior de aplicação da Thermo Fisher Scientific. Insira grades automáticas no do carregador automático em condições de nitrogênio líquido. Insira o com grades automáticas em uma cápsula de transferência de nitrogênio líquido resfriado.
Insira ainda a cápsula no microscópio e clique no botão Dock na interface do microscópio UI para carregar o da cápsula no carregador automático do microscópio. Clique no botão Inventário para verificar a presença de grades automáticas no carregado. Em seguida, clique nos botões Carregar e Descarregar para inserir as grades automáticas na coluna para imagens TEM.
Selecione a guia Atlas e clique no botão Nova Sessão para abrir uma nova sessão. Preencha detalhes como nome da sessão e localização de armazenamento de dados e clique no botão Aplicar. Selecione as grades de interesse selecionando uma caixa de seleção ao lado do número de grade correspondente.
Clique no botão Iniciar para iniciar uma coleção totalmente automatizada de atlas de todas as grades selecionadas. Quando a coleção for concluída, clique em etiquetas de grade para revisar os atlases adquiridos. Selecione a guia EPU e vá para Nova Sessão para criar uma nova sessão no painel esquerdo.
Selecione a opção Nova sessão para usar as predefinições ópticas do conjunto atual. Preencha o nome da sessão. Selecione o tipo manual da sessão para ter controle sobre a seleção de furos individuais e quadrados de grade selecionados para coleta de dados posteriormente no protocolo.
Selecione o modo de aquisição mais rápido para usar a mudança de imagem livre de aberração para coleta de dados. Em seguida, digite o local para salvar os metadados. Clique no botão Aplicar para criar uma nova sessão.
Selecione a tarefa de seleção quadrada no painel esquerdo para mostrar o atlas coletado da grade. Identifique os quadrados da grade com papel alumínio de suporte intacto sem danos, gelo fino e buracos de papel alumínio, contaminação de gelo cristalino insignificante no quadrado da grade e gradiente de brilho mínimo em toda a grade quadrada e dentro de buracos de folha individuais. Selecione os quadrados de grade para coleta de dados, seja no atlas completo ou em imagens de ladrilhos de alta qualidade.
Clique com o botão direito do mouse em um quadrado de grade de interesse e escolha toda a tarefa de seleção. Clique no botão Auto Eucentric para mover-se automaticamente para o primeiro quadrado de grade selecionado. Ajuste a altura eucêntrica e adquira uma imagem quadrada da grade para encontrar furos de papel alumínio.
Clique no botão Encontrar buracos para encontrar furos de papel alumínio na imagem. Clique no botão Remover buracos para fechar o botão da barra de grade para desmarcar orifícios perto das barras de grade. Ajuste os limites no histograma de brilho do filtro de gelo para remover todos os orifícios com gelo muito grosso e todos os orifícios vazios.
Clique com o botão direito do mouse em um buraco na imagem quadrada da grade e selecione mover o estágio para o local mover o palco aqui. Selecione a tarefa de definição de modelo no painel esquerdo. Clique no botão Adquirir para adquirir uma imagem inteira.
Defina os valores para atraso após a mudança de imagem para 0,5 segundos e atraso após o turno para cinco segundos. Clique no botão Encontrar e Centralizar para centralizar um buraco na imagem. Selecione o botão Adicionar área de aquisição e clique na imagem para selecionar o local no buraco centrado onde será feita a aquisição de imagens de alta ampliação.
Selecione o botão Adicionar área de foco automático e clique na imagem para selecionar o local na folha de suporte ao lado do orifício centralado onde o foco automático da imagem será realizado. Clique na área de aquisição verde para definir uma sequência de valores de desfocado na lista de desfocus na seção superior da janela de software. Depois de definir as configurações específicas do foco automático, escolha a opção Depois de centralizar para focar automaticamente no início de cada cluster AFIS.
Escolha a opção Lente Objetiva para foco automático mais rápido e redução de fase de deriva. Clique no botão Preparar todos os quadrados na tarefa de seleção de furos para definir automaticamente a coleta de dados e todos os outros quadrados de grade selecionados de acordo com as configurações usadas neste primeiro quadrado de grade. Selecione a tarefa de definição de modelo, adquira uma nova imagem, mova o palco para uma área limpa na folha de carbono pelo clique com o botão direito do mouse e selecione a opção de menu mover o estágio aqui.
Selecione a guia Funções automáticas. Depois de definir o desfoco e iterado desejados, mude para a predefinição de foco automático e clique no botão iniciar para executar a função de foco automático. Selecione a tarefa Autostigmate, mude para a predefinição do anel de Thon e pressione o botão Iniciar.
Selecione a tarefa Autocoma e pressione o botão Iniciar. Mova o palco para uma área com uma grade quebrada quadrada. Confirme a transparência da área tirando uma única imagem de foco automático.
Abra a interface do usuário Sherpa e selecione o aplicativo Filtro de Energia. Clique no botão Centro e na opção de perda zero para centralizar a fenda do filtro de energia de perda zero. Clique no botão Sintonizar na opção isochromaticity.
Clique na opção Ampliação de sintonia e distorções de sintonia nas distorções geométricas e cromáticas. Vá para a guia EPU, selecione a tarefa Aquisição Automatizada e clique no botão Iniciar Execução para iniciar a coleta de dados totalmente automatizada. A figura mostra grades Cryo-EM exibindo um gradiente de espessura de gelo sobre a superfície da grade.
As grades excluídas da investigação são grade ruim com gelo espesso e uma grade dobrada com gelo ruim e contaminação, enquanto grades aceitáveis são aquelas com bom gradiente de gelo e uma grade típica com gelo fino bom e pequeno gradiente de gelo. A figura mostra a renderização 3D final do mapa Cryo-EM de apoferritina reconstruída. A alta estabilidade e simetria fazem dela uma amostra de referência ideal para imagens e processamento de imagens Cryo-EM de alta resolução.
O polimento bayesiano, o refinamento ctf e a correção da esfera de Ewald resultaram em um mapa de resolução de 1,63 angstrom. A figura mostra uma visão detalhada do mapa crio-EM de apoferritina reconstruída no nível da cadeia lateral do aminoácido individual. A densidade das cadeias laterais de aminoácidos é bem resolvida e o modelo atômico pode ser inequivocamente construído dentro do mapa.
A imagem aqui mostra dois conjuntos de dados diferentes em diferentes valores de desfoco coletados da mesma grade Cryo-EM com quadrados de grade semelhantes com uma fenda totalmente aberta e uma fenda de 10 elétrons volts que indica que a fenda de 10 elétrons volts melhora significativamente o contraste da imagem. A figura aqui mostra uma visão geral do mapa Cryo-EM proteasome 20S com subunidades segmentadas usadas como amostra Cryo-EM padrão. E sua visão ampliada com um modelo atômico equipado representa o núcleo catalítico estável do complexo proteasome com a simetria D7.
O protocolo contém duas etapas críticas. Primeiro, procurando áreas com gelo fino e vítreo contendo partículas homogêneas. E segundo, configurando iluminação paralela para aquisição de dados.
Com reconstruções de alta resolução de proteínas alcançando dois a três angstroms em resolução, você é mais capaz de entender os mecanismos moleculares da doença e melhorar os condutores de drogas. Anteriormente, a cristalização era necessária se você quisesse estudar a base estrutural dos fenômenos biológicos. Hoje com o Cryo-EM, isso não é mais necessário.
E assim, com o Cryo-EM, permitimos que os cientistas estudem uma gama mais ampla de fenômenos biológicos em um nível estrutural.
Visão Geral
Este protocolo descreve as melhores práticas para obter conjuntos de dados de crio-ME de alta resolução usando microscópios TEM de 200 kV. Ele enfatiza alinhamentos óticos precisos, esquemas de aquisição de dados e seleção de área de imagem.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Microscopia de Crio-Eletrões
- Biologia Estrutural
Fundamento
- A crio-ME é uma técnica padrão para determinação de estruturas de proteínas.
- Permite o estudo de proteínas em condições quase nativas.
- Este método pode capturar múltiplos estados conformacionais e funcionais simultaneamente.
- Avanços recentes tornaram a operação de Crio-TEMs mais fácil.
Propósito do Estudo
- Demonstrar os passos críticos na obtenção de dados de crio-ME de alta resolução.
- Fornecer um protocolo para o uso de amostras padrão como apoferritina e proteassoma.
- Facilitar o design de medicamentos baseado em estrutura através de informações estruturais detalhadas.
Métodos Usados
- Uso de grades automáticas e condições de nitrogênio líquido para preparação da amostra.
- Coleta automatizada de atlas de grades selecionadas.
- Seleção manual de quadrados de grade para coleta de dados.
- Utilização de recursos avançados de automação para aquisição eficiente de dados.
Principais Resultados
- Aquisição bem-sucedida de conjuntos de dados de alta resolução de microscópios TEM de 200 kV.
- Identificação de quadrados de grade ideais para a imagem.
- Demonstração de técnicas de coleta de dados automatizadas e manuais.
- Estabelecimento de um protocolo confiável para estudos futuros.
Conclusões
- O protocolo fornece um guia abrangente para a obtenção de dados de crio-ME de alta resolução.
- Treinamento com usuários experientes é recomendado para iniciantes.
- Avanços na automação melhoram a eficiência das operações de crio-ME.
Perguntas Frequentes
Executive Industry Relevance
High-resolution cryo-EM using 200 kV TEM systems enables routine atomic-level protein structure determination, expanding access beyond specialized 300 kV platforms. Automation and real-time quality assessment streamline data acquisition, supporting rapid, reproducible generation of structural insights for early-stage drug discovery. This capability strengthens predictive confidence at the target validation and lead identification inflection points across biopharma portfolios.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables elucidation of molecular mechanisms underlying protein function and disease relevance.
- Supports structure-based drug design by providing atomic-resolution maps for target interrogation.
- Facilitates functional target validation through direct visualization of conformational and binding states.
- Reduces reliance on crystallization, broadening the range of tractable targets.
Screening & Assay Development
- Delivers validated structural templates for downstream screening and assay development workflows.
- Standardizes imaging parameters and data quality, ensuring reproducibility across experiments.
- Enables quantitative assessment of ligand binding and conformational changes.
- Supports scalable, automated data collection for high-throughput structural screening.
Translational & Preclinical Research
- Aligns structural outputs with disease-relevant models for translational biomarker development.
- Provides continuity from discovery through preclinical validation by enabling mechanistic de-risking.
- Improves risk-adjusted advancement decisions by clarifying structure-function relationships.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol positions 200 kV cryo-EM as a core capability from early discovery through preclinical research, bridging target validation, lead identification, and mechanistic de-risking.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by resolving protein structures in near-native states.
- Screening: Provides reproducible, quantitative structural data for compound evaluation and assay readiness.
- Analytics: Enables high-resolution measurements and statistical comparison of structural conditions and ligand interactions.
- Translational Research: Connects atomic-level insights to disease models and biomarker strategies.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized, automated workflow adaptable across diverse protein targets and research programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and throughput via automation and real-time quality control.
- Strategic Value: Enables more informed go/no-go decisions and capital-efficient portfolio management.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of structurally validated targets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cryo-EM operation and data interpretation, with initial training recommended.
- Needs access to 200 kV TEM systems equipped with energy filters and direct electron detectors.
- Demands robust data management and quality assessment infrastructure for high-throughput workflows.
- Standardization of imaging parameters and automation protocols is critical for cross-team reproducibility.
- Adaptation to specific protein targets may require optimization of sample preparation and imaging conditions.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
1:27
Grid Loading, Mapping, and Selection of Best Cryo-EM Grids for Data Collection
2:36
Setting up a Data Collection Session in the Single Particle Analysis Software
5:44
Final Microscope Alignments Before Starting Data Collection
7:15
Results: Gallery of Grids, Cryo-EM Reconstruction of Apo-Ferritin, and Effect of Energy Filtering on Cryo-EM Images
8:56
Conclusion
