Microdisseção de camada de folhetos de válvulas tricúsplicas para caracterização mecânica biaxial e quantificação microestrutural

Este método pode isolar as contribuições das camadas teciduais para o comportamento geral do tecido, fornecendo uma nova visão sobre a microestrutura tecidual. Nossa estrutura de microdisseção e teste nos permite comparar diretamente as propriedades mecânicas e microestruturais dos folhetos de válvulas cardíacas com suas próprias camadas compostas. A microdisseção pode ser difícil de dominar, portanto, é altamente recomendável praticar o máximo possível antes de iniciar seu estudo.

Primeiro, reúna os materiais necessários, placa de cera, água DI, pipeta, bisturi, micro tesoura, fórceps finos, fórceps curvos, fórceps espessos e pinos. Desmonte o tecido do testador biaxial e meça sua espessura usando o sensor de deslocamento laser. Coloque o tecido na tábua de cera.

Examine o lado ventricular do tecido para inserções de chorda grandes. Tire uma foto para referência. Espalhe o tecido plano na placa de cera com os atrialis voltados para cima.

Para fixar o tecido à placa, coloque um pino inclinado para longe do tecido em cada canto para que ele puxe ligeiramente o tecido esticado. Certifique-se de que os pinos estão fora dos orifícios criados pelas latas ao montar o tecido e o tecido é quadrado e não muda durante a microdisseção da camada. Se necessário, coloque pinos ao longo da lateral do tecido durante a dissecação para esticar mais o tecido.

Remova os marcadores fiduciais de contas de vidro. Coloque água DI na superfície do tecido com uma pipeta para que cubra completamente o tecido de forma semelhante a uma bolha. Para fazer o canto inicial, selecione um canto do espécime fixado, evitando grandes inserções de chorda em áreas frágeis.

Em seguida, corte a camada A/S arrastando levemente o bisturi sobre a superfície do tecido ao longo dos orifícios de montagem para testes mecânicos. As bordas do corte começam a se separar, revelando a camada F/V por baixo. Com fórceps finos e contundentes, esfregue firmemente ao longo do corte para separar ainda mais suas bordas.

Se o corte na camada A/S não começar a se separar, rastreie levemente o mesmo corte novamente com um bisturi. Faça um segundo corte perpendicular ao primeiro corte. Se os dois cortes não estiverem conectados, execute as pinças finas sob a pequena área de tecido que separa os dois cortes.

Em seguida, use cuidadosamente a tesoura para cortar o tecido. Esfregue ao longo dos cortes do canto com um fórceps fino até que o tecido se separe da camada F/V. Assim que um pequeno pedaço de tecido for separado, segure-o com a pinça grande e puxe-o suavemente para separar ainda mais as camadas compostas.

Continue descascando o tecido enquanto o agarra com pinças maiores para evitar rasgos e rasgos indesejados da camada composta A/S, e esfregue a costura até chegar ao final dos dois cortes feitos para o canto. Se a primeira curva tiver grandes problemas com a separação, tente um canto diferente como ponto de partida. Em seguida, para fazer uma segunda curva, estenda os dois cortes feitos para o primeiro canto colocando a ponta do bisturi na parte inferior de cada corte e arrastando-a levemente ao longo da superfície do tecido para que as extensões de corte se conectem aos cortes originais e continuem a seguir os orifícios de tine ou sutura.

Continue estendendo os cortes e descascando a camada superior composta A/S para trás enquanto esfrega a costura até que um lado esteja terminado. Observe que o tecido será totalmente separado ao longo de um corte. Em seguida, crie um segundo canto perpendicular até o final do lado totalmente descascado.

Estenda os cortes restantes, evitando grandes inserções de chorda. Exclua as inserções de chorda da área de separação A/S somente quando essa exclusão permitir um espécime A/S grande o suficiente para caracterizações experimentais. Continue separando as camadas A/S e F/V usando as técnicas de esfregação e puxar empregadas para a primeira curva.

Pare de separar o tecido imediatamente se uma lágrima ou buraco se formar. Para evitar que a pinça seja pega, coloque a tesoura em qualquer orifício que se forme e corte o tecido do centro. Se o defeito se formar ao longo da costura da separação, então comece a separar o tecido ao longo de outra borda.

Procure por conexões entrecamadas que possam aparecer ao separar o tecido e evitar a separação de tecidos. Observe que estes são fios finos, mas fortes, que devem ser cuidadosamente cortados usando uma tesoura. Evite criar um orifício na camada A/S ou cortar para baixo na camada F/V.

Continue este processo até que a maior amostra possível da camada A/S tenha sido separada. Marque a orientação da amostra usando a caneta cirúrgica. Por fim, corte ao longo da costura de separação para a borda restante do tecido com a tesoura.

Coloque a camada composta A/S separada plana no tapete de corte. Se necessário, use o bisturi para endireitar as bordas do tecido e criar uma forma de tecido quadrado adequada para testes mecânicos biaxiais. Coloque a camada A/S em água DI até que esteja pronta para ser testada.

Marque a orientação da camada F/V que permanece na placa de cera. Corte a maior praça possível para fora da área onde a camada A/S foi removida. Em seguida, coloque-o em água DI.

A análise histológica do folheto intacto e das duas camadas dissecadas verificaram se o tecido foi corretamente separado ao longo da borda entre a esponjosa e a fibrosa. Os micrografos de histologia foram usados para determinar a espessura da camada tecidual e frações de massa constituintes usando o software ImageJ. O teste mecânico controlado por deslocamento e pós-processamento produziram tensão de membrana versus dados de estiramento do folheto anterior da válvula tricúspide, folheto posterior da válvula tricúspide e folheto septo da válvula tricúspide, descrevendo o comportamento mecânico não linear do tecido.

Os dados polarizados de imagem de domínio de frequência espacial produziram mapas coloridos da orientação da fibra de colágeno e grau de anisotropia óptica. Especificamente, esses mapas de cores forneceram uma compreensão abrangente da arquitetura da fibra de colágeno em todo o espécime de tecido. É importante notar que a camada composta encolhe uma vez que são separadas do tecido fixado.

Colete a maior amostra possível para garantir que haja tecido suficiente para os testes subsequentes.