Amplificação de Escherichia coli em um chip microfluídico de PCR em fluxo contínuo e sua detecção com um sistema de eletroforese capilar

Este protocolo descreve como construir um sistema de cadeia polimerase de fluxo contínuo baseado no chip microfluídico e como construir um sistema de eletroforese capilar em laboratório. Apresenta uma forma simples para a análise de ácidos nucléicos em laboratório. A reação em cadeia da polimerase é um método tradicional empregado para a amplificação do gene alvo.

No entanto, a PCR tradicional é muito demorada devido à eficiência de variação de baixa temperatura. Este trabalho propõe um sistema de PCR em fluxo contínuo baseado no chip microfluídico. O tempo de amplificação pode ser bastante reduzido executando a solução de PCR em um microcanal colocado em aquecedores ajustados a diferentes temperaturas.

Como o CE tem muitas vantagens, como alta resolução, alta velocidade e excelente reprodutibilidade, tornou-se uma ferramenta popular no laboratório para a análise de ácidos nucléicos e proteínas. No entanto, a maioria dos laboratórios, especialmente os laboratórios no mundo em desenvolvimento, não pode pagar esta tecnologia devido ao alto preço do instrumento CE. Aqui, descrevemos protocolos de como fabricar o chip microfluídico CF-PCR e como construir um sistema CE versátil no laboratório.

Demonstramos também o processo de amplificação de Escherichia coli pelo sistema CF-PCR, e a detecção dos produtos de PCR pelo sistema CE. Seguindo os procedimentos descritos neste protocolo, os usuários devem ser capazes de fabricar chips microfluídicos, preparar solução de PCR, construir um sistema de CF-PCR para amplificação de ácidos nucleicos e configurar um sistema CE simples, mesmo com recursos limitados, para separar fragmentos de DNA. Aqueça o wafer de silicone a 200 graus centígrados por 25 minutos para remover a umidade.

Dispense um mililitro de fotorresiste SU-8 2075 por polegada do wafer. Gire no wafer de silício usando um revestidor de giro a 500 rpm por 5 a 10 segundos com uma aceleração de 100 rpm por segundo, e depois a 2.000 rpm por 30 segundos com uma aceleração de 500 rpm por segundo. Leve ao forno a 65 graus centígrados por três minutos e 95 graus centígrados por 15 minutos.

Defina 150 a 215 milijoules por centímetro quadrado como energia de exposição para a máquina de fotolitografia e grave o padrão projetado no fotorresiste com uma máscara de fotolitografia. Coloque o wafer de silicone e a máscara prontos para exposição. Após a exposição, asse a bolacha a 65 graus centígrados por dois minutos e 95 graus centígrados por sete minutos.

Mergulhe o wafer de silício na solução reveladora para remover o excesso de fotorresistência e retire-o quando os microcanais puderem ser vistos. Em seguida, use isopropanol para enxaguar a solução reveladora residual. Misturar o pré-polímero de polidimetilsiloxano e o agente de cura numa proporção de 10 para 1.

Despeje a solução PDMS mista no molde da réplica e solidifique-a a 80 graus centígrados por 60 minutos. Cole o chip microfluídico PDMS em uma lâmina após a ativação usando um limpador de plasma e solidifique-os a 80 graus centígrados por 30 minutos o mais rápido possível. Use um misturador de vórtices e centrífuga para garantir que os reagentes estejam bem misturados.

Prepare um tubo de centrífuga. Primeiro adicione água ao tubo da centrífuga. Em seguida, adicione o modelo de DNA, primer, tampão, mistura de dNTP, Tween 20, PVP e, finalmente, adicione a DNA polimerase.

Por fim, misture a solução por vórtice. Prepare dois aquecedores cerâmicos PTC, dois relés de estado sólido, dois controladores de temperatura, dois sensores de temperatura e um cabo de alimentação. Conecte o aquecedor ao relé de estado sólido.

Conecte o relé de estado sólido ao controlador de temperatura PID. Em seguida, conecte a sonda do sensor de temperatura à parte inferior dos dois aquecedores e conecte o terminal ao controlador de temperatura PID. Finalmente, conecte dois relés de estado sólido em série e conecte o cabo de alimentação.

Imprima em 3D um slot para os dois aquecedores e mantenha os aquecedores no mesmo plano. Coloque o chip microfluídico nos dois aquecedores. Prepare uma bomba de seringa e uma seringa e, em seguida, fixe a seringa na bomba de seringa.

Conecte uma tubulação de silicone com uma seringa e conecte uma agulha de aço à parte superior da tubulação de silicone. Insira a agulha de aço na entrada do chip microfluídico. Coloque uma ponta de pipeta na saída do chip para coletar os produtos de PCR.

Use uma fonte de alimentação de alta tensão para gerar um campo elétrico de campo pulsado. Olha, essa é uma fonte de alimentação de alta tensão. São eletrodos positivos e negativos.

Use uma lâmpada de mercúrio como fonte de luz e filtre o comprimento de onda de excitação da lâmpada de mercúrio através de um filtro. Coloque o capilar no estágio do microscópio. Coletar a emissão de fluorescência com a objetiva e, em seguida, detectá-la por um tubo fotomultiplicador.

Este é o nosso microscópio e este é o nosso capilar. Agora acendemos a luz em condições de sala escura. A luz de excitação é coletada pelo objetivo.

Use o software LABVIEW desenvolvido por conta própria para controlar a fonte de alimentação e concluir a aquisição de dados. Predefina a temperatura dos aquecedores do sistema CF-PCR em 65 graus centígrados e 95 graus centígrados. Coloque o chip microfluídico nos dois blocos de aquecimento.

Insira a ponta do tubo de silicone em um tubo de centrífuga contendo 50 microlitros da solução de PCR. Puxe o êmbolo da seringa para retirar lentamente a solução. Fixe a seringa numa bomba de seringa.

Insira a agulha de aço na entrada do chip microfluídico. Ajuste a taxa de fluxo da bomba para 10 microlitros por minuto e pressione o botão de partida para pressionar a solução no microcanal na entrada do microchip. Recolha os produtos de PCR na saída do chip microfluídico.

Prepare um capilar com 8 centímetros de comprimento total e 6 centímetros de comprimento efetivo. Prepare o tampão de separação misturando 100 microlitros de 1%HEC, dois microlitros de 100x SYBR Green e 98 microlitros de água ultrapura para obter 0,5%HEC contendo 1x SYBR Green.

Insira a tensão de injeção e o tempo de injeção na interface do software, clique no botão Iniciar e aguarde até que os produtos de PCR sejam introduzidos eletrodinamicamente no capilar. Insira a tensão DC na interface do software, clique no botão Iniciar e execute a eletroforese a 100 volts por centímetro de intensidade do campo elétrico. Clique no botão parar depois que todos os fragmentos de DNA forem separados no capilar.

Lave o capilar com água esterilizada por um minuto após cada corrida. Esta imagem representa o eletroferograma de produtos de PCR e marcadores de DNA. Primeiro, amplificamos o gene alvo de Escherichia coli no sistema CF-PCR, e a solução de PCR levou cerca de 10 minutos e 30 segundos desde a entrada até a saída do chip.

O tamanho do amplicon alvo de Escherichia coli foi de 544 pb. Em seguida, analisamos os produtos amplificados da PCR no sistema de eletroforese capilar. Além disso, também foi realizada a eletroforese capilar de escada de DNA de 100 pb nas mesmas condições experimentais.

O tamanho do produto da PCR pode ser avaliado de acordo com o eletroferograma da escada de DNA. Cada experimento foi realizado três vezes para reprodutibilidade. Os dados desta foto mostram que o pico correspondente aos produtos de PCR de Escherichia coli foi observado após a separação, e o tempo de migração dos produtos de PCR no chip microfluídico foi consistente com o de um termociclador.

Tanto a PCR quanto a CE são duas biotecnologias populares na análise de ácidos nucléicos. Este trabalho descreve a amplificação de Escherichia coli e a detecção dos produtos de PCR usando os sistemas CF-PCR e CE, ambos construídos internamente. O gene alvo de Escherichia coli foi amplificado com sucesso em 10 minutos, e os fragmentos de DNA menores que 1.500 pb foram separados em oito minutos.

Além disso, o sistema CF-PCR baseado no chip microfluídico e o sistema CE introduzidos neste trabalho são fáceis de fabricar, e podem oferecer uma maneira simples para a análise de ácidos nucléicos em laboratório. Ele pode amplificar e detectar apenas uma amostra por vez, o que limita sua ampla aplicação. Portanto, o desenvolvimento de um arranjo integrado de chips microfluídicos CF-PCR e CE para detecção de patógenos de alto rendimento ainda está a caminho.