Name: Isolamento de Células Linfoides Inatas do Grupo 2 da Mucosa Nasal de Camundongos para Detecção da Expressão de CD226 (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 30 s
Description: Aprenda a isolar células linfoides inatas do grupo 2 da mucosa nasal de camundongos para detectar a expressão de CD226 por citometria de fluxo. Este método auxilia pesquisadores a estudar a função dessas células em doenças nasais.

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R.Z. foi apoiado pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (No. 81871258) e fundos fornecidos pela Quarta Universidade Médica Militar (No.2020rcfczr). Y.Z. foi apoiado pelo Programa de Pesquisa Básica em Ciências Naturais de Shaanxi (No. 2021JM-081).

Todos os experimentos foram realizados de acordo com as Diretrizes de Cuidados e Uso de Animais de Laboratório. Todos os procedimentos e protocolos foram aprovados pelo Comitê de Ética em Pesquisa Científica da Quarta Universidade Militar de Medicina (nº 20211008).
1. Estabelecimento do modelo de RA murino
<ol><li>Camundongos C57BL/6 machos e fêmeas do tipo selvagem (WT) domésticos com idade entre 8-12 semanas sob condições específicas livres de patógenos e fornecem ração e água padrão de laboratório.</li>
	<li>Emulsionar 50 μg de ovalbumina (OVA) em 0,2 mL de PBS estéril contendo 2 mg de hidróxido de alumínio em uma bancada limpa para manter a esterilidade. Nos dias 0, 7 e 14, injetar intraperitonealmente camundongos fêmeas ou machos com 50 μg cada de óvulos emulsionados.</li>
	<li>Nos dias 21, 22, 23, 24 e 25, instilar por via intranasal camundongos com 50 μg de OVA dissolvidos em 30 μL de PBS estéril (15 μL por narina) sob anestesia inalatória (isoflurano a 2-3% com fluxo de oxigênio ou 0,5 L/min).</li>
	<li>Eutanasiar os camundongos 24 h após o último desafio (dia 26).</li>
</ol>2. Isolamento de células mononucleares (CMNs) da mucosa nasal
<ol><li>Eutanásia dos camundongos por deslocamento cervical sob anestesia profunda. Mergulhe a cabeça dos camundongos em etanol 75% por 5 min e evite a entrada de etanol na narina externa. Coloque o abdome para baixo na mesa de cirurgia.</li>
	<li>Corte os dentes anteriores. Na linha média da cabeça, faça uma incisão e corte a pele usando uma tesoura.</li>
	<li>Remova a mandíbula inferior, corte todo o nariz ao longo da extremidade do palato e coloque o tecido em uma placa de Petri de 60 mm contendo 5 mL de PBS gelado. Usando tesouras e pinças, remova a carne e os músculos aderidos aos ossos.</li>
	<li>Transfira o nariz do rato para uma nova placa de Petri de 60 mm contendo 5 ml de PBS gelado. Lave os ossos duas vezes com 5 mL de PBS gelado.</li>
	<li>Transfira o nariz para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.</li>
	<li>Esmagar suficientemente e transferir o nariz para um tubo de 15 mL contendo 2 mL de tampão digestor pré-aquecido (meio RPMI 1640 suplementado com 1 mg/mL de colagenase IV e 10 U/mL de DNase I).</li>
	<li>Aperte a tampa e coloque o tubo verticalmente em um agitador orbital a 37 °C, com agitação contínua a 120-150 rpm por 40 min. NOTA: Pré-aqueça o tampão digestivo a 37 °C para atingir a mais alta atividade enzimática.</li>
	<li>Adicionar 5 mL de meio RPMI 1640 gelado contendo 10% de soro fetal bovino (SFB) para interromper o processo de digestão.</li>
	<li>Filtrar através de um filtro de células de 70 μm para remover fragmentos sólidos.</li>
	<li>Centrifugar a 500 x g durante 5 minutos e, em seguida, eliminar suavemente o sobrenadante.</li>
	<li>Ressuspenda o pellet em meio RPMI 1640 gelado e centrífugo a 500 x g por 5 min. Descarte suavemente o sobrenadante.</li>
	<li>Ressuspender o pellet celular em 4 mL de meio com gradiente de densidade de 40% (160 μL de 10x PBS + 1,44 mL de solução estoque de meio com gradiente de densidade + 2,4 mL de meio RPMI 1640).</li>
	<li>Introduzir suavemente uma pipeta Pasteur no fundo do tubo e adicionar lentamente 2,5 ml de meio com gradiente de densidade de 80% (200 μL de 10x PBS + 1,8 ml de solução de meio de gradiente de densidade + 0,5 ml de meio RPMI 1640).</li>
	<li>Ajuste a velocidade de aceleração e desaceleração da centrífuga inferior à terceira marcha e centrífuga em 400 x g por 15 min à temperatura ambiente (TR).</li>
	<li>Remova a camada superior de impurezas antes de drenar as células na interface para evitar possíveis contaminações. Drenar cuidadosamente a camada de células mononucleares (MNCs) na interface de meio de gradiente de densidade de 40%/80% para um tubo de 15 mL contendo 2 mL de PBS gelado usando uma pipeta. Lave as células com PBS gelado duas vezes.</li>
</ol>3. Coloração superficial para análise de FCM
<ol><li>Colher as células e centrifugar a 500 x g durante 5 min a 4 °C. Ressuspender o pellet celular em tampão corante (PBS suplementado com 2% FBS e 0,1% NaN3) e centrifugar a 500 x g por 5 min a 4 °C. Descarte o sobrenadante. CUIDADO: Seja cauteloso ao preparar o tampão de coloração. O NaN3 é muito tóxico e pode causar danos aos órgãos se ingerido, inalado ou em contato com a pele. Além disso, evite a liberação para o meio ambiente.</li>
	<li>Ressuspender as células em solução de bloqueio de 80 μL (anticorpo anti-CD16/32 (1:100) diluído em tampão de coloração) por tubo. Incubar durante 30 minutos no escuro a 4 °C.</li>
	<li>Sem lavar, adicionar 20 μL da diluição apropriada do coquetel de anticorpos corantes de superfície (Tabela 1).</li>
	<li>Adicionar 1 μL (por teste) do corante de viabilidade fixável 520 (FVD) imediatamente antes de adicionar o cocktail de anticorpos às amostras. Incubar no escuro a 4 °C durante 30 minutos. Defina anticorpos isotípicos correspondentes e fluorescência menos um (FMO) como controles negativos.</li>
	<li>Lavar as células em 500 μL de tampão de coloração centrifugando a 500 x g durante 5 min a 4 °C.</li>
	<li>Ressuspender o pellet de células em 200 μL de tampão corante. Adicionar 50 μL de esferas de contagem absoluta de vórtices às células coradas e agitar. Submetê-los a uma análise de citometria de fluxo (FCM). NOTA: Os dados de FCM foram obtidos usando um analisador de células espectrais e analisados com um software de análise de citometria de fluxo (FCM).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

As ILC2 estão intimamente associadas à inflamação tipo 2 e a distúrbios inflamatórios, como demonstrado por um número crescente de estudos. Tanto os modelos em camundongos quanto a observação humana contribuem para uma melhor compreensão de sua função nas vias aéreas superiores. Na fisiopatologia da asma, as ILC2 são ativadas através da linfopoietina estromal tímica, IL-25 e IL-33, que são produzidas principalmente por células epiteliais. Em seguida, espelhando as células Th2, as ILC2 produzem IL-4, IL-5 e IL-13 para agr...

As células linfoides inatas do grupo 2 (ILC2s) foram descobertas pela primeira vez nos tecidos da cavidade peritoneal de camundongos e, posteriormente, demonstraram estar presentes no sangue e em outros tecidos periféricos, como pulmões, pele e cavidade nasal 1,2,3. Como células residentes no tecido, as ILC2 são principalmente mantidas e proliferam localmente e funcionam como os primeiros guardas respondendo a estímulos nocivos exógenos através da produção de numerosas citocinas do tipo 2 e indução de imunidade do tipo 2 4,5,6. As ILC2 também podem exercer seus efeitos pelo tráfico para os tecidos infectados 7,8.
Semelhante às células T-helper 2 (Th2), as complicadas redes regulatórias das ILC2s garantem seu envolvimento significativo na progressão de várias doenças inflamatórias do tipo 2, incluindo doenças alérgicas das vias aéreas 8,9. Na asma, alarminas derivadas de células epiteliais podem ativar ILC2s, que promovem inflamação pulmonar através da secreção de interleucina (IL)-4, IL-5 e IL-1310. Estudos clínicos também indicaram que os níveis de ILC2 estavam significativamente elevados no escarro e no sangue de pacientes com asma grave, sugerindo uma associação de ILC2s com a gravidade da asma e sua função como preditor da progressão da asma11.
A rinite alérgica (RA) é uma doença inflamatória crônica comum que afeta milhões de pessoas anualmente, e os tratamentos efetivos para essa doença são limitados12,13. As ILC2 desempenham papéis cruciais na fisiopatologia da RA, seja na fase de sensibilização ou na fase de geração de sintomas einflamação14. Em pacientes com RA, os níveis de ILC2 no sangue periférico têm sido relatados como elevados local e sistemicamente15. No entanto, certos efeitos e os mecanismos subjacentes da ILC2s sobre a fisiopatologia e a progressão da RA ainda requerem maior exploração.
CD226 - uma glicoproteína transmembrana que serve como molécula costimulatória - é expressa principalmente em células natural killer (NK), células T e outros monócitos inflamatórios16,17. A interação do CD226 e seus ligantes (CD155 e/ou CD112) ou competidores (TIGIT) permite que ele participe das funções biológicas de várias células imunes18. A ligação dos ligantes nas células apresentadoras de antígenos ao CD226 no linfócito citotóxico (CTL) promove a ativação de ambas as células simultaneamente, enquanto a ativação da CTL pode ser posteriormente suprimida pelo TIGIT (T cell immunoreceptor with Ig and ITIM domains), competidor do CD22619,20. Um estudo humano ex vivo revelou que CD226 e CD155 em células T regulam o equilíbrio entre Th1/Th17 e Th2 através da modulação diferencial dos subgrupos Th21. O CD226 também pode mediar a adesão plaquetária e a atividade de morte do tumor NK22,23. Enquanto isso, o CD226 é bem estudado na patogênese de várias doenças infecciosas, doenças autoimunes e tumores 18,24,25. Atualmente, o CD226 tornou-se um novo ponto brilhante para a imunoterapia. Estudos constataram que vesículas extracelulares podem reverter a expressão de CD226 nas células NK para restabelecer sua atividade citotóxica e intervir na progressão do câncer de pulmão26. Um estudo recente revelou um subgrupo de ILCs do grupo 3 intestinal fetal caracterizado com alta expressão de CD226 por sequenciamento de RNA de célula única27, o que indicou queCD226 pode exercer papéis na imunidade mediada por células linfoides inatas.
Nosso conhecimento sobre ILC2s na inflamação das vias aéreas é baseado principalmente em estudos sobre asma; entretanto, pouco se sabe sobre suas funções na imunidade da mucosa nasal. Assim, foi estabelecido um protocolo para isolar e identificar ILC2s da mucosa nasal. O estudo enfoca a expressão de CD226 em ILC2s em tecidos nasais e sua variação entre camundongos saudáveis e AR. Isso pode fornecer novos insights sobre os mecanismos subjacentes da regulação mediada por ILC2 na imunidade local e servir como base para o desenvolvimento de novas abordagens para o tratamento da RA.

<table><tbody><tr><td>Hidróxido de alumínio</td><td>Meilun biological Technology</td><td>21645-51-2</td><td></td></tr><tr><td>CD11b</td><td>eBioscience</td><td>11-0112-82</td><td>Usado em coquetel de anticorpos</td></tr><tr><td>CD11c</td><td>BioLegend</td><td>117306</td><td>Usado em coquetel de anticorpos</td></tr><tr><td>CD16 / 32</td><td>BioLegend</td><td>101302</td><td>Clone: 93; Diluição 1:100</td></tr><tr><td>CD226</td><td>BioLegend</td><td>128812</td><td>Usado em coquetel de anticorpos</td></tr><tr><td>CD3e</td><td>BioLegend</td><td>100306</td><td>Usado em coquetel de anticorpos</td></tr><tr><td>CD45</td><td>BioLegend</td><td>103128</td><td>Usado em coquetel de anticorpos</td></tr><tr><td>CD45R</td><td>eBioscience</td><td>11-0452-82</td><td>Usado em coquetel de anticorpos</td></tr><tr><td>CD90.2</td><td>BD Pharmingen</td><td>553014</td><td>Usado em anticorpos coctail</td></tr><tr><td>Collagenase IV</td><td>DIYIBio</td><td>DY40128</td><td></td></tr><tr><td>CountBright contas de contagem absoluta</td><td>Invitrogen</td><td>C36950</td><td>contas de contagem absoluta</td></tr><tr><td>Dnase <img alt="Equação 1" src="/files/ftp_upload/63525/63525eq01v2.jpg" style="margin: auto; "></td><td>Beyotime</td><td>D7076</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>gibco</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>Corante de Viabilidade Fixável eFluor 520 (FITC)</td><td>eBioscience</td><td>65-0867-14</td><td>FVD</td></tr><tr><td>HBSS, cálcio, magnésio</td><td>Servicebio</td><td>G4204-500</td><td></td></tr><tr><td>KLRG1</td><td>eBioscience</td><td>17-5893-81</td><td>Usado em coquetel de anticorpos</td></tr><tr><td>NaN3</td><td>SIGMA</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>NovoExpress software</td><td>AgilentTechnologies</td><td>Versão 1.5.0</td><td>análise de citometria de fluxo (FCM)</td></tr><tr><td>OVA</td><td>SIGMA</td><td>9006-59-1</td><td></td></tr><tr><td>PBS, 1x</td><td>Servicebio</td><td>G4202-500</td><td></td></tr><tr><td>PBS, 10x</td><td>Servicebio</td><td>G4207-500</td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>Yeasen</td><td>40501ES60</td><td>densidade meio gradiente</td></tr><tr><td>RPMI 1640 meio de cultura</td><td>Corning</td><td>10-040-CVRV</td><td></td></tr><tr><td>Analisador de células espectrais</td><td>SONY</td><td>SA3800</td><td></td></tr></tbody></table>

isolamento de células linfoides inatas do grupo 2 da mucosa nasal de camundongos para detecção da expressão de cd226

Isolation of Group 2 Innate Lymphoid Cells from Mouse Nasal Mucosa to Detect the Expression of CD226

Com abundantes pesquisas sobre células linfoides inatas do grupo 2 (ILC2s) publicadas ao longo dos anos, as ILC2s são amplamente conhecidas por estarem implicadas na regulação de vários processos patológicos, incluindo imunidade anti-helmíntica, reparo tecidual, termogênese e doenças autoimunes como asma e rinite alérgica (RA). As ILC2s residem permanentemente em tecidos periféricos como pele, intestino, pulmões e cavidade nasal; no entanto, há informações limitadas sobre suas funções exatas na imunidade da mucosa nasal. CD226 é uma molécula costimulatória ativadora, expressa principalmente em células natural killer (NK), células T e monócitos inflamatórios. No entanto, se ILC2s expressam CD226 ou desempenham um papel na patogênese de doenças relacionadas a ILC2s permanece desconhecido. Aqui, estabelecemos um método para isolar e identificar ILC2s da mucosa nasal e detectamos a expressão de CD226 em ILC2s obtidas de camundongos saudáveis e AR. Neste artigo, descrevemos este protocolo para o isolamento e identificação de ILC2s da mucosa nasal de camundongos, o que ajudará a explorar o mecanismo patológico interno de distúrbios imunológicos em doenças da mucosa nasal.

Um modelo murino induzido por VA foi desenvolvido para explorar o papel da ILC2s na RA. A construção do modelo murino de RA foi baseada em estudos prévios com pequenas modificações 28,29,30,31. Um vídeo de 10 min foi capturado para medir a frequência de espirros e coçar o nariz após o último teste de provocação nasal. Os sintomas alérgicos dos camundongos OVA-induzidos-AR foram apresentados na ...

As células linfoides inatas do grupo 2 (ILC2s), implicadas na inflamação do tipo 2, participam principalmente da resposta à infecção por helmintos, doenças alérgicas, homeostase metabólica e reparo tecidual. Neste estudo, é demonstrado um procedimento para isolar ILC2s da mucosa nasal murina e detectar a expressão de CD226.

Isolamento de Células Linfoides Inatas do Grupo 2 da Mucosa Nasal de Camundongos para Detecção da Expressão de CD226

With abundant research on group 2 innate lymphoid cells (ILC2s) published over the years, ILC2s are widely known to be implicated in regulating various ...

Este protocolo é estabelecido para isolar e identificar o grupo duas células linfoides inatas da mucosa nasal murina e explorar os efeitos e mecanismos subjacentes da CIE dois em doenças nasais. Essa técnica permite aos pesquisadores isolar a ILC dois do mesotélio local e expor a expressão do antígeno de superfície por citometria de fluxo. Nossa técnica não inclui operações complicadas.No entanto, uma coisa importante é tentar remover a carne aderida aos ossinhos completamente para evitar o impacto de outros tecidos próximos Antes de iniciar o experimento, abrigar seis camundongos machos e fêmeas machos e fêmeas do tipo selvagem C57 com idades entre 8 e 12 semanas sob condições específicas livres de patógenos fornecidos com ração padrão de laboratório e água. Para estabelecer o modelo de rinite alérgica, emulsionar 50 microgramas de ovalbumina em 0,2 mililitros de PBS estéril contendo dois miligramas de hidróxido de alumínio e injetar intraperitonealmente 50 microgramas de ovalbumina emulsionada em cada camundongo em zero, sete e 14 dias. Nos dias 21, 22, 23, 24 e 25, instilar por via intranasal camundongos com 50 microgramas de ovalbumina dissolvida em 30 microlitros de PBS estéril, seguido de eutanásia 24 horas após o último desafio.Mergulhe a cabeça do camundongo eutanasiado em etanol 75% por cinco minutos e evite a entrada de etanol na narina externa. Coloque o abdome para baixo na mesa de cirurgia. Corte os quatro dentes e na linha média da cabeça faça uma incisão e abra a pele usando tesoura.Em seguida, remova a mandíbula inferior, corte todo o nariz ao longo da extremidade do palato e coloque o tecido em uma placa de Petri de 60 milímetros contendo cinco litros de PBS gelado. Usando tesouras e pinças, remova a carne e os músculos aderidos aos ossos. Em seguida, transfira o nariz do rato para uma nova placa de Petri de 60 milímetros contendo cinco mililitros de PBS gelado e lave os ossos.Após a segunda lavagem, transfira o nariz para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro. Esmague suficientemente o tecido e transfira-o para um tubo de 15 mililitros contendo dois mililitros de tampão de digestão pré-aquecido. Fixe a tampa e coloque o tubo verticalmente em um agitador orbital a 37 graus Celsius e 120 a 150 RPM por 40 minutos.Em seguida, adicione cinco mililitros de meio RPMI 1640 gelado contendo 10% de soro bovino fetal para interromper a digestão. Em seguida, filtre o conteúdo através de um filtro de células de 70 mícrons para remover fragmentos sólidos. Depois de centrifugar o filtrado a 500 G por cinco minutos, descarte suavemente o sobrenadante e ressuspenda o pellet em meio RPMI 1640 gelado.Para repetir a centrifugação como demonstrado anteriormente, ressuspenda o pellet de células em quatro mililitros de meio com gradiente de densidade de 40%. Em seguida, insira suavemente uma pipeta de Pasteur no fundo do tubo para adicionar 2,5 mililitros de meio gradiente de densidade de 80%. Centrifugar o tubo a 400 G durante 15 minutos à temperatura ambiente com a taxa de aceleração e desaceleração regulada inferior à terceira velocidade.Antes de drenar as células na interface, remova a camada superior de impurezas para evitar possíveis contaminações. Em seguida, use uma pipeta para drenar a camada das células mononucleares na interface de meio de gradiente de densidade de 40% por 80% em um tubo de 15 mililitros contendo dois mililitros de gelo gelado. Lave as células com PBS gelado duas vezes.Colha as células e centrifuja-as durante cinco minutos a 500 G a quatro graus Celsius. Ressuspender o pellet de célula em tampão de coloração e centrifugar novamente por cinco minutos a 500 G.Descarte o sobrenadante. Ressuspender e incubar as células em solução de bloqueio de 80 microlitros por 30 minutos a quatro graus Celsius na condição escura.Adicione um microlitro de corante de viabilidade fixável 520 imediatamente antes de adicionar 20 microlitros do coquetel de anticorpos de coloração de superfície da diluição apropriada à amostra. Além disso, defina os anticorpos isotípicos correspondentes e a fluorescência menos um como os controles negativos. Em seguida, lave as células em 500 microlitros de tampão de coloração centrifugando a 500 vezes G por cinco minutos a quatro graus Celsius.Em seguida, ressuspenda o pellet celular em 200 microlitros de tampão corante. Finalmente, adicione 50 microlitros de contas de contagem absoluta de vórtice às células coradas. Agitá-los e submetê-los a uma análise de citometria de fluxo.Um modelo murino induzido por óvulos desenvolvido para explorar o papel das células linfoides inatas do grupo dois mostrou que a frequência de fricção nasal e espirros nos camundongos com rinite alérgica foi significativamente maior do que no grupo controle. Na mucosa nasal de camundongos controles saudáveis, cerca de 2 a 3% das células negativas da linhagem e CD 45 positivas foram identificadas. O número absoluto de células linfoides inatas do grupo dois variou de 2.000 a 4.000.A análise por citometria de fluxo indicou um aumento notável no número total de células linfoides inatas do grupo dois na mucosa nasal da rinite alérgica em comparação com a de camundongos controles saudáveis. Maior expressão de CD 226 foi detectada no grupo duas células linfoides inatas nos camundongos com rinite alérgica do que nos controles. Além disso, a intensidade média de fluorescência do CD 226 foi significativamente aumentada nos camundongos AR.Fique atento aos passos de remoção da carne aderida ao osso nasal, definindo a taxa de aceleração e desaceleração ao centrifugar o meio e drenar as células mononucleares. Os dois ILC identificados podem ser um suporte para a caracterização por citometria de fluxo classificados para cultura celular ou estimulados in vitro, o que ajudaria a explorar o risco específico de dois ILC no tecido nasal. Este procedimento de isolamento e caracterização de linfócitos, particularmente em células linfáticas inatas na mucosa nasal, torna este protocolo uma referência preliminar para pesquisadores que exploram o ambiente imune nasal local.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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