Name: Inativação de Patógenos via Fotólise de Luz Visível de Riboflavina-5′-Fosfato (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-06T13:40:00.000+00:00
Duration: 8 min 25 s
Description: Aprenda a inativar patógenos usando fotólise de luz violeta visível de FMN. Este método gera radicais livres que inibem Staphylococcus aureus e E.coli, sendo seguro para terapia de pele lesionada e saneamento na indústria alimentícia.

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Os autores são gratos ao Dr. Tak-Wah Wong e ao Sr. Zong-Jhe Hsieh por seu apoio com experimentos.

1. Configuração do sistema de fotólise
<ol><li>Montar seis diodos emissores de luz (LED) (DC 12 V) no interior de um copo plástico opaco (8 cm x 7 cm), como mostra a Figura 1 , para estabelecer um sistema de fotólise31.</li>
	<li>Adicionar reagentes (ver abaixo) aos tubos de ensaio de vidro (13 mm de diâmetro e 100 mm de altura) e fixar os tubos na parte superior do copo, como mostra a figura 1. Colocar a instalação experimental numa sala com uma temperatura constante de 25 ± 3 °C.</li>
	<li>Monitorar e registrar a temperatura das unidades de teste ao longo das reações fotolíticas por um termômetro infravermelho. NOTA: A Figura 2 mostra os espectros de emissão para as luzes azul, verde, vermelha e violeta, conforme registrado usando um espectrômetro óptico UV-Vis calibrado. Os comprimentos de onda correspondentes ao máximo de absorvância para as luzes LED azul, verde, vermelha e violeta utilizadas no estudo são 465, 529, 632 e 405 nm, respectivamente. Os chips LED podem aquecer o aparelho durante experimentos de irradiação. Todo o sistema fotorreativo em cada experimento foi, portanto, colocado em uma sala onde a temperatura foi mantida constante a 25 ± 3 °C.</li>
</ol>2. O efeito do comprimento de onda da luz na fotólise da FMN (Figura 3)
<ol><li>Preparar uma solução de FMN 0,1 mM em tampão fosfato de potássio (PB) de 100 mM (pH 7,8). Expor amostras de FMN (3 mL cada) à luz azul, verde, vermelha ou violeta a uma intensidade de 10 W/m2 por 5 min. Manter 3 ml de solução de FMN no escuro como controlo.</li>
	<li>Registar a absorvância de amostras de FMN irradiadas na gama de 250-750 nm utilizando um espectrofotómetro UV/visível.</li>
</ol>3. Método de redução do tetrazólio azul nitro (NBT) para detecção <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63531/63531eq01.jpg" style="font-size: 14px; margin: auto;"> (Figura 4).
NOTA: O método de redução de NBT aqui utilizado foi ligeiramente modificado a partir do ensaio para fotorreação de riboflavina. O método de redução do NBT é utilizado para avaliar o nível de geração da <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63531/63531eq01.jpg" style="margin: auto;"> fotólise da FMN. O FMN fotoquimicamente excitado é primeiro reduzido pela L-metionina em uma semiquinona, que então doa um elétron ao oxigênio, dando origem a <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63531/63531eq01.jpg" style="margin: auto;">31. O as-generated <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63531/63531eq01.jpg" style="margin: auto;"> reduz o NBT a formazan, que tem uma absorvância característica a 560 nm32.
<ol><li>Adicionar 109,3 mg de L-metionina a 73,3 mL de PB (100 mM; pH 7,8). Vórtice a solução para dissolver a L-metionina.</li>
	<li>Após a L-metionina estar totalmente dissolvida, adicionar 10 mg de NBT em pó e 1,53 ml de 0,117 mM FMN à solução. Para cada 1 mL da solução de reação (ou seja, uma mistura de FMN, L-metionina e NBT) aplicada, as concentrações finais de FMN, metionina e NBT são 2,4 x 10-6 M, 1,0 x 10-2 M e 1,6 x 10-4 M, respectivamente.</li>
	<li>Expor a solução de reação (1 mL) à irradiação de luz LED azul ou violeta a 10 W/m2 por 1-5 min.</li>
	<li>Detectar a espécie (a partir da absorbância a <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63531/63531eq01.jpg" style="margin: auto;"> 560 nm) produzida pela reação fotoquímica, que reduz o NBT e produz formazan.</li>
</ol>4. Viabilidade de S. aureus após fotólise de FMN (Figura 5)
<ol><li>Transmitir uma colônia de S. aureus (BCRC 10451) de uma placa cultivada em 10 mL de caldo de lisogenia tomado em um tubo de ensaio com tampa de rosca de 15 mL. Cultura em agitador a 37 °C durante 16 h.</li>
	<li>Transfira 0,5 mL da cultura para um tubo de centrífuga de 1,5 mL. Adicionar água esterilizada no tubo de centrífuga para diluir a cultura a uma densidade óptica de 0,5 a 600 nm (OD600) (~6 x 107 UFC/mL).</li>
	<li>Transferir 0,5 mL da cultura para um tubo de centrífuga de 1,5 mL, centrifugar a 14.000 x g por 10 min e decantar o sobrenadante para obter um pellet celular.</li>
	<li>Adicionar 1 mL de solução tamponada com FMN (30, 60 e 120 μM de FMN em PB) aos pellets celulares obtidos como na etapa 4.3 e vórtice. Para controle irradiado, adicione 1 mL de PB sozinho.</li>
	<li>Transferir 1 mL de cada uma das soluções viáveis de células bacterianas contendo 30 μM FMN e PB isoladamente para tubos de vidro e irradiá-las com luz violeta a 10 W/m2 por 30 min.</li>
	<li>Transfira 1 mL de cada uma das soluções viáveis de células bacterianas contendo 30, 60 e 120 μM FMN e PB isoladamente para tubos de vidro e irradie-as com luz azul a 20 W/m2 por 120 min. Coloque outro tubo de vidro com 1 mL de solução de células bacterianas viáveis contendo 120 μM de FMN e irradie-o com luz azul a 20 W/m2 por 60 min.</li>
	<li>Configure os tubos de ensaio conforme descrito nas etapas 4.5 e 4.6 e cubra-os com folhas grossas de alumínio. Esses tubos servem como controles escuros.</li>
	<li>Mantenha a câmara de irradiação (bem como os controles escuros) em uma câmara fria a 9 ± 1 °C durante o período de irradiação de 30-120 minutos. NOTA: O calor liberado pelas luzes LED não pode ser ignorado, pois os chips LED colocados dentro do copo podem aquecer o sistema de fotorreação durante os experimentos de irradiação. Os experimentos foram, portanto, conduzidos em câmara fria mantida a 9 ± 1 °C.</li>
	<li>Após irradiação, transfira 0,2 mL de cada uma das soluções de reação para uma placa de ágar Luria (LA). Espalhe as bactérias sobre a placa por uma haste de vidro em forma de L e incube durante a noite a 37 °C.</li>
	<li>Calcular a contagem de placas viáveis e as taxas de inativação de S. aureus após o crescimento noturno. NOTA: A taxa de inativação de S. aureus é calculada como a porcentagem de redução, que é igual a [1 -I / D] ×100%, onde I e D denotam, respectivamente, o número de UFCs na amostra irradiada e o controle escuro. A redução percentual é definida como um valor negativo da taxa de inativação.</li>
</ol>5. Detecção de <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63531/63531eq01.jpg" style="font-size: 14px; margin: auto;"> em S. aureus (Figura 6)
<ol><li>Prepare as amostras de S. aureus conforme descrito na etapa 4.</li>
	<li>Diluir a densidade bacteriana das amostras com água esterilizada para uma densidade óptica de 0,5 a 600 nm (OD600, ~6 x 106 UFC/mL). Transfira 0,5 mL da cultura para um tubo de centrífuga de 1,5 mL. Centrifugar a 14.000 x g durante 10 min e decantar o sobrenadante para obter um pellet celular.</li>
	<li>Adicione 0,1093 g de L-metionina, 0,1 g de NBT e 25 mL de FMN (400, 240 ou 120 μM) a 75 mL de PB. Para cada 1 mL do reagente aplicado, as concentrações finais de FMN, metionina e NBT são 100 (60 ou 30) x 10-6 M, 7,3 x 10-3 M e 1,2 x 10-3 M, respectivamente.</li>
	<li>Adicionar 1 ml de cada solução reagente (isto é, com concentrações variáveis de FMN) aos pellets celulares obtidos como na etapa 5.2. Irradiar as soluções por luz violeta a 10 W/m2 durante 10 min.</li>
	<li>Centrifugar a mistura a 14.000 x g durante 10 min e decantar o sobrenadante. Ressuscite o pellet em 1 mL de dimetilsulfóxido (DMSO) para extrair o NBT reduzido. Detectar as espécies produzidas <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63531/63531eq01.jpg" style="margin: auto;"> a partir da absorbância a 560 nm.</li>
</ol>6. Análise estatística
<ol><li>Expresse os dados como média ± desvio padrão (DP) de três testes independentes.</li>
	<li>Aplicar um teste t homocedástico de duas amostras para avaliar se duas medidas são diferentes. Valores de p &lt; 0,05 são considerados estatisticamente significativos.</li>
</ol>

Os autores declaram não haver conflitos de interesse.

Um fotossensibilizador aumenta a reação fotoquímica de compostos químicos para gerar EROs. Microrganismos patogênicos podem ser inativados por irradiação de luz na presença de fotossensibilizadores. Este estudo determina a aPDI de S. aureus devido a EROs geradas pela irradiação de luz violeta de um fotossensibilizador exógeno, o FMN.
Como mostrado na Figura 3, para FMN, a absorbância a 444 nm é reduzida significativamente após 5 min de irradiação usando l...

A riboflavina-5′-fosfato (FMN) é formada por fosforilação na posição 5′ da riboflavina 5′ da cadeia lateral do ribitil e é necessária por todas as flavoproteínas para numerosos processos celulares para gerar energia. Também desempenha o papel de vitamina para algumas funções no corpo humano1. A FMN é aproximadamente 200 vezes mais solúvel em água do que a riboflavina2.
A inativação fotodinâmica antibacteriana (aPDI) de bactérias é uma forma eficiente de controlar a resistência às bactérias 3,4, pois não depende do modo de resistência bacteriana. Clinicamente, a aPDI é utilizada no tratamento de infecções de tecidos moles, a fim de diminuir a infecção da pele nosocomial devido a bactérias multirresistentes 5,6,7,8,9. O aPDI também produz morte celular através da geração de espécies reativas de oxigênio (ROS). EROs, como radicais superóxidos (), oxigênio singlete, radicais hidroxila (<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63531/63531eq01.jpg" style="margin: auto;">•OH) e radicais peroxila, são radicais livres ou moléculas que contêm oxigênio reativo 10,11,12 e são normalmente reativas 13. Semelhante ao dano ao DNA causado pelas EROs, a peroxidação da membrana e a destruição das células endoteliais também são reações bioquímicas adversas que são atribuídas às ERO nas células12.
O uso de aPDI para bactérias patogênicas envolve uma fonte de luz visível ou UV para inativar microrganismos na presença de compostos químicos, como cloreto de metiltionina 14, conjugado PEI-c e6 15, porfirina16, dióxido de titânio17, azul de toluidina O 18 e nanopartículas de óxido de zinco 19. O azul de toluidina O e o azul de metileno são corantes fenotiazinium e o azul de metileno tem propriedades tóxicas. As nanopartículas de óxido de zinco e a irradiação UV estão ligadas a efeitos adversos à saúde e ao meio ambiente. Como tal, a exploração de um fotossensibilizador confiável, seguro e simples via fotólise sob irradiação visível merece um estudo mais aprofundado.
O micronutriente, riboflavina ou FMN, não é tóxico e é de fato usado para fabricação de alimentos ou alimentação20. Tanto a NMF quanto a riboflavina são altamente sensíveis à irradiação luminosa2. Sob irradiação UV 1,2,21,22,23 e luz azul 10,24, estes dois compostos atingem um estado excitado. A riboflavina ativada ou FMN que é produzida pela fotólise é promovida ao seu estado tripleto e as EROs são geradas simultaneamente 2,25. Kumar et al. relataram que a riboflavina ativada pela luz UV causa seletivamente aumento da lesão da porção guanina do DNA em microrganismos patogênicos26. Sob irradiação por luz UV, a riboflavina fotodinamicamente ativada é demonstrada para promover a geração de 8-OH-dG, que é um biomarcador para estresse oxidativo, no DNA de fita dupla27. Relata-se que S. aureus e E. coli são desativados por ERO durante a fotólise de riboflavina ou FMN 10,24,28. Um estudo prévio dos autores mostrou que as reações fotolíticas envolvendo riboflavina e FMN reduzem o violeta cristal, um corante triarilmetano e um agente antibacteriano que gera <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63531/63531eq01.jpg" style="margin: auto;">, e eliminam a maior parte da capacidade antimicrobiana do violeta cristal28. Quando o dinucleotídeo de flavina adenina ou FMN é irradiado por luz azul, as EROs resultantes produzem apoptose em células HeLa para seu envenenamento in vitro29. Utilizando tratamento fotoquímico na presença de riboflavina, Cui et al. inativaram linfócitos inibindo sua proliferação e produção de citocinas30.
A fotólise da riboflavina é utilizada para a inativação do patógeno sanguíneo por UV 10,24, mas os componentes sanguíneos podem ser prejudicados sob irradiação de luz UV30. Também é relatado que as plaquetas expostas aos raios UV melhoram progressivamente o desempenho dos marcadores de ativação P-selectina e LIMP-CD63 em suas membranas. A citotoxicidade dos raios UV e da irradiação de alta intensidade precisa ser investigada e um fotossensibilizador que seja descomplicado e seguro durante uma fotorreação FMN envolvendo luz visível seria de grande utilidade.
A luz de comprimentos de onda mais curtos tem mais energia e é muito mais provável que cause danos graves às células. No entanto, na presença de um fotossensibilizador adequado, a irradiação com luz violeta de baixa intensidade pode inibir microrganismos patogênicos. A fotossensibilização e a geração de FMN quando irradiadas com luz violeta são, portanto, importantes para estudar, a fim de determinar a via pela qual as EROs da fotólise da FMN aumentam a inativação de <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63531/63531eq01.jpg" style="margin: auto;"> bactérias.
O controle antimicrobiano é um problema comum e o desenvolvimento de novos antibióticos frequentemente leva décadas. Após a irradiação com luz violeta, a fotoinativação que é intermediada pelo FMN pode aniquilar bactérias patogênicas ambientais. Este estudo apresenta um protocolo antimicrobiano eficaz in vitro utilizando luz violeta para conduzir a fotólise da FMN e, assim, gerar <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63531/63531eq01.jpg" style="margin: auto;"> para aPDI. A viabilidade microbiana de S. aureus é usada para determinar a viabilidade da aPDI induzida por FMN.

<table><tbody><tr><td>Luzes LED azuis, verdes e vermelhas</td><td>Vita LED Technologies Co., Tainan, Taiwan</td><td></td><td>DC 12 V 5050</td></tr><tr><td>Dimethyl Sulfoxide</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>190186</td><td></td></tr><tr><td>Termômetro infravermelho</td><td>Raytek Co. Santa Cruz, CA</td><td>MT4</td><td></td></tr><tr><td>LB broth</td><td>Difco Co., NJ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-Metionina</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>1.05707</td><td></td></tr><tr><td>NBT</td><td>Bio Basic, Inc. Markham, Ontário, Canadá</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fonte de alimentação</td><td>China tech Co., New Taipei City, Taiwan</td><td>YP30-3-2</td><td></td></tr><tr><td>Riboflavina 5&prime;-fosfato</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>R7774</td><td></td></tr><tr><td>RNase</td><td>New England BioLabs, Inc. Ipswich, MA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Medidor de energia solar</td><td>Tenmars Electronics Co., Taipei, Taiwan</td><td>TM-207</td><td></td>Centro de</tr><tr><td>Pesquisa e Coleta de Biorecursos (BCRC)</td> de<td>Staphylococcus aureus subsp. aureus</td>, Hsinchu, Taiwan <td>10451</td><td></td></tr><tr><td>Espectrômetro óptico UV-Vis</td><td>Ocean Optics, Dunedin, FL</td><td>USB4000</td><td></td></tr><tr><td>Espectrofotômetro UV-Vis</td><td>Hitachi High-Tech Science Corporation, Tóquio, Japão</td><td>U-2900</td><td></td></tr><tr><td>Violet LED</td><td>Long-hui Electronic Co., LTD, Dongguan, China</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

inativação de patógenos via fotólise de luz visível de riboflavina-5′-fosfato

Inactivation of Pathogens via Visible-Light Photolysis of Riboflavin-5&#8242;-Phosphate

Riboflavina-5'-fosfato (ou mononucleotídeo de flavina; FMN) é sensível à luz visível. Vários compostos, incluindo espécies reativas de oxigênio (ROS), podem ser gerados a partir da fotólise FMN após irradiação com luz visível. As EROs geradas a partir da fotólise da FMN são prejudiciais aos microrganismos, incluindo bactérias patogênicas como Staphylococcus aureus (S. aureus). Este artigo apresenta um protocolo para a desativação de S. aureus, como exemplo, via reações fotoquímicas envolvendo FMN sob irradiação de luz visível. O ânion radical superóxido () gerado durante a fotólise da FMN é avaliado através da redução do tetrazólio azul nitro (<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63531/63531eq01v3.png" style="margin: auto;">NBT). A viabilidade microbiana de S. aureus que é atribuída a espécies reativas <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63531/63531eq01v3.png" style="margin: auto;"> foi utilizada para determinar a efetividade do processo. A taxa de inativação bacteriana é proporcional à concentração de FMN. A luz violeta é mais eficiente na inativação de S. aureus do que a irradiação de luz azul, enquanto a luz vermelha ou verde não impulsiona a fotólise FMN. O presente artigo demonstra a fotólise da NMF como um método simples e seguro para processos sanitários.

Efeito do comprimento de onda da luz no FMN Os espectros de absorbância de 0,1 mM FMN que são irradiados usando LEDs azuis, verdes, vermelhos e violetas são mostrados na Figura 3. Existem dois picos para FMN (372 nm e 444 nm) para o controle escuro. A luz verde e vermelha não tem efeito porque as mudanças nos espectros são insignificantes. Por outro lado, a respectiva absorvância da FMN a 444 nm é reduzida em cerca de 19% e 34%, respectivamente, após irradiação de luz azu...

Aqui, apresentamos um protocolo para inativar bactérias patogênicas com espécies reativas de oxigênio produzidas durante a fotólise do mononucleotídeo de flavina (FMN) sob irradiação de luz azul e violeta de baixa intensidade. A fotólise FMN demonstra ser um método simples e seguro para processos sanitários.

Inativação de Patógenos via Fotólise de Luz Visível de Riboflavina-5′-Fosfato

Riboflavin-5&#39;-phosphate (or flavin mononucleotide; FMN) is sensitive to visible light. Various compounds, including reactive oxygen species (ROS), can ...

Este protocolo usa irradiação de luz violeta visível para induzir fotólise mononucleotídica de flavina. Isso produz uma grande quantidade de radicais livres, que inibem bactérias patogênicas, como Staphylococcus aureus e E.coli. Testamos o mononucleotídeo de flavina como um fotossensibilizador apropriado.Neste protocolo, usamos luz violeta visível, que é segura e não requer equipamentos caros. Este método pode ser usado para a terapia de pele lesada ou tecidos subcutâneos infectados, inserindo uma fibra óptica para iluminação. Também pode ser aplicado à prática de saneamento na indústria de alimentos.Demonstrando o procedimento estará Tang-Yu Chen, um estudante de pós-graduação do meu laboratório Para começar, montar seis diodos emissores de luz de 12 volts cada um no interior de um copo plástico opaco. Pegue um tubo de ensaio de vidro com um diâmetro de 13 milímetros e uma altura de 100 milímetros e adicione os reagentes ao tubo. Prenda os tubos na parte superior do copo e coloque esta configuração a uma temperatura constante de 25 três graus Celsius.Monitorar e registrar a temperatura das unidades de teste ao longo das reações fotolíticas por um termômetro infravermelho. Em seguida, prepare uma solução de FMN 0,1 milimolar em tampão fosfato de potássio 100 milimolares em pH 7,8. Exponha três mililitros de amostras de FMN cada uma à luz azul, verde, vermelha ou violeta por cinco minutos.Em paralelo, mantenha três mililitros de solução de FMN no escuro como controle. Coloque a amostra em um espectrofotômetro UV-visível e registre a absorvância de amostras irradiadas na faixa de 250 a 750 nanômetros. Para se preparar para a detecção de radicais superóxidos, primeiro adicione 109,3 miligramas de L-metionina a 73,3 mililitros de tampão fosfato de 100 milimolares a pH 7,8.Na solução, adicione 10 miligramas de pó de NBT e 1,5 mililitros de FMN 0,117 milimolar. Exponha um mililitro da solução de reação à luz LED azul ou violeta por um a cinco minutos. Registre a absorvância de 516 nanômetros para detectar formazan, que é produzida pela reação fotoquímica do NBT.Inocular uma colônia de Staphylococcus aureus em 10 mililitros de caldo de lisogenia em um tubo de ensaio com tampa de parafuso de 15 mililitros. Cultive a cultura a 37 graus Celsius por 16 horas em um shaker. Transfira 0,5 mililitros da cultura para um tubo de centrífuga de 1,5 mililitro.Diluir a cultura para uma densidade óptica de 0,5 a 600 nanômetros adicionando água esterilizada. Em seguida, transfira 0,5 mililitros da cultura para um tubo de centrífuga de 1,5 mililitro. Centrifugar a 14.000 G durante 10 minutos e decantar o sobrenadante.Adicione um mililitro de solução tamponada de FMN ao pellet celular e ao vórtice. Para controle irradiado, adicione um mililitro de tampão fosfato. Transfira um mililitro de solução de células bacterianas contendo 30 micromolares FMN e tampão fosfato para tubos de vidro.Coloque-os para uma radiação sob luz violeta a 10 watts por metro quadrado por 30 minutos. Em seguida, transfira um mililitro de solução de células bacterianas contendo FMN 30-60-e 120-micromolar e tampão fosfato em tubos de vidro. Irradiar com luz azul por 120 minutos a 20 watts por metro quadrado.Além disso, irradie um tubo contendo um mililitro de FMN 120-micromolar por 60 minutos. Após irradiação, adicionar 0,2 mililitros da solução de reação a uma placa de ágar luria. Espalhe a solução usando uma haste de vidro em forma de L e incube durante a noite a 37 graus Celsius.No dia seguinte, calcule a contagem de placas viáveis e a taxa de inativação de Staphylococcus aureus. Prepare as amostras de Staphylococcus aureus conforme descrito anteriormente para obter um pellet celular. Para 75 mililitros de tampão fosfato adicionar 0,1093 gramas de L-metionina, 0,1 grama de NBT, e 25 mililitros de solução de FMN.Adicionar um mililitro de cada solução reagente com concentrações variáveis de FMN aos pellets celulares e ao vórtice. Irradiar as soluções sob luz violeta a 10 watts por metro quadrado durante 10 minutos. Centrifugar a mistura a 14 000 G durante 10 minutos e decantar o sobrenadante.Ressuscite o pellet em um mililitro de dimetilsulfóxido para extrair o NBT reduzido. Registre a absorbância a 560 nanômetros. A irradiação de FMN com luz verde e vermelha não mostrou efeito sobre os picos em 372 e 444 nanômetros em comparação com o controle escuro, enquanto a redução na absorvância de FMN em 444 nanômetros foi observada sob luz azul e violeta, indicando aumento da fotólise.A detecção de radicais superóxidos formados durante a fotólise FMN sob luz azul ou violeta foi feita usando redução de NBT. O efeito fotoquímico da FMN foi dependente do tempo de irradiação. A fotólise FMN usando irradiação de luz azul ou violeta resultou em inativação significativa de Staphylococcus aureus.A inativação dose-dependente foi observada para irradiação de luz azul, com 97% de inativação alcançada para NMF de 120 micromolares. Sob luz violeta, uma taxa de inativação de 96% foi alcançada para o staphylococcus aureus, com FMN 30-micromolar mostrando maior eficácia para a inativação bacteriana. A redução do NBT mostrou que o efeito fotolítico da FMN sob luz violeta em Staphylococcus aureus foi proporcional à concentração de FMN.Em condições não tratadas, uma menor abundância de radicais superóxidos foi indicada por baixa absorvância a 560 nanômetros, enquanto maiores valores de absorvância no tratamento com FMN mostraram produção abundante de radicais superóxidos, resultando em aumento do efeito fotoquímico. É fundamental ter uma boa fonte de luz LED. A largura espectral do regime de luz violeta deve ser estreita para evitar qualquer sobreposição com a absorção UV, uma vez que a radiação UV pode ser perigosa.Após o procedimento, outros compostos químicos, como tetraciclina, doxiciclina, catequina e podem ser testados para fotólise semelhante à FMN.

inactivation-pathogens-via-visible-light-photolysis-riboflavin-5

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

Mostra-se que um dispositivo biomédicas desenvolvida que envolve o tratamento a laser visível contínua ou pulsada que é combinado com o tratamento com antibióticos (gentamicina), resulta num efeito sinérgico significativo estatisticamente levando a uma redução da viabilidade...

O efeito sinérgico da luz visível e no Gentamicina<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Microorganismos

Fonte: Cheng, C., et al. Inativação de patógenos via fotólise de luz visível de riboflavina-5'-fosfato. J. Vis. Exp. (2022)Este vídeo demonstra um método para avaliar os efeitos fototóxicos do mononucleotídeo de flavina (FMN) em bactérias patogênicas. As culturas bacterianas são expostas a concentrações crescentes de FMN e iluminadas com luz visível para gerar espécies reativas de oxigênio (ROS) que danificam os componentes celulares. As bactérias sobreviventes são então quantificadas para...

Inativação de bactérias usando mononucleotídeo de flavina ativado por luz

Fonte: Cheng, C., et al. Inativação de patógenos via fotólise de luz visível de riboflavina-5'-fosfato. J. Vis. Exp. (2022).Neste vídeo, uma mistura de reação tamponada contendo L-metionina, nitro azul de tetrazólio (NBT) e mononucleotídeo de flavina (FMN) é irradiada com luz violeta para induzir a produção de espécies reativas de oxigênio (ROS). Isso leva à inativação bacteriana e à formação de formazan detectável espectrometricamente.

Quantificação da inativação bacteriana induzida por luz através da geração de espécies reativas de oxigênio

Fonte: Zhao, K., et al. Um modelo In Vitro para Estudar o Efeito da Terapia Fotodinâmica Mediada por Ácido 5-Aminolevulínico no Biofilme de Staphylococcus aureus . J. Vis. Exp. (2018)O vídeo demonstra um protocolo de terapia fotodinâmica para avaliar os efeitos antibacterianos em biofilmes bacterianos Gram-positivos. Os biofilmes são divididos em quatro grupos: dois recebem um precursor fotosensimizador e dois recebem um tampão. Todos são incubados no escuro, seguidos por exposição à luz...

Tratamento ativado pela luz de biofilmes bacterianos usando um precursor fotosensimizador

Este vídeo demonstra o processo de redução de patógenos à base de riboflavina e luz UV contra a contaminação bacteriana de alto título em produtos plaquetários humanos. Esse processo pode ajudar a diminuir o risco de eventos adversos graves de transfusão associados à contaminação bacteriana.

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As condições de armazenamento dos produtos plaquetários criam um ambiente ideal para que os contaminantes bacterianos se multipliquem a níveis perigosos.  O objetivo deste estudo foi usar um ensaio de formação de colônias para avaliar um processo de redução de patógenos à base de riboflavina contra contaminação bacteriana de alto título em produtos plaquetários humanos.

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As infecções causadas por cepas bacterianas multirresistentes (MDR) surgiram como uma séria ameaça à saúde pública, necessitando do desenvolvimento de terapias alternativas. Apresentamos um protocolo para avaliar a eficácia da terapia antimicrobiana com luz azul (aBL) para infecções por Acinetobacter baumannii MDR em queimaduras de camundongos usando imagens de bioluminescência.

In Vivo Investigation of Antimicrobial Therapy luz azul para-multirresistente Acinetobacter baumannii queimadura Infecções Usando bioluminescência Imagiologia

A crescente incidência de albicanos candida resistentes a medicamentos é um sério problema de saúde em todo o mundo. A terapia fotodinâmica antimicrobiana (aPDT) pode oferecer uma estratégia para combater infecções fúngicas resistentes a medicamentos. O presente protocolo descreve a eficácia da APDT mediada por Rose bengala em uma cepa c. albicans resistente a multidrogas in vitro.

Terapia fotodinâmica mediada por Rose Bengala para inibir a candida albicans

O presente protocolo descreve modificações do microscópio eletrônico de transmissão (MET) com um sistema de iluminação de luz, a fabricação de células líquidas e observações in situ de TEM de interações induzidas pela luz entre células bacterianas e um fotossensibilizador. Os métodos de preparação da amostra, os danos causados pelo feixe de elétrons e as imagens também são discutidos.

Microscopia Eletrônica de Transmissão In Situ Induzida pela Luz para Observação da Interação Matéria-Líquido Mole

Este protocolo descreve um método simples e econômico para avaliar a eficácia de potenciais fotossensibilizadores na inativação fotodinâmica antibacteriana (aPDI), usando um formato de placa de 96 poços combinado com uma fonte de luz de painel de LED. Essa abordagem permite o teste simultâneo de várias condições experimentais, incluindo diferentes concentrações, compostos e cepas bacterianas.

Triagem in vitro baseada em LED para avaliação de moléculas fotoativáveis na inativação fotodinâmica bacteriana

Um dispositivo LED de luz azul de 405 nm demonstra eficácia antimicrobiana contra uma ampla gama de patógenos de feridas quando avaliado em um modelo de pele sintética à base de colágeno. Essa abordagem simplificada in vitro oferece uma alternativa reprodutível e eticamente viável para avaliação em fases iniciais de terapias antimicrobianas baseadas em luz.

Investigação de um dispositivo LED de luz azul para suprimir patógenos de feridas usando um modelo de pele sintética à base de colágeno

Aprenda a inativar patógenos usando fotólise de luz violeta visível de FMN. Este método gera radicais livres que inibem Staphylococcus aureus e E.coli, sendo seguro para terapia de pele lesionada e saneamento na indústria alimentícia.

Inativação de Patógenos via Fotólise de Luz Visível de Riboflavina-5′-Fosfato

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