Administração Subconjuntival de Vetores de Vírus Adenoassociados em Modelos de Pequenos Animais
16 de março de 2022
Neste manuscrito, a injeção subconjuntival é demonstrada como um método de entrega vetorial válido para tecidos oculares em camundongos usando um sistema de injeção que consiste em uma bomba de seringa de infusão/retirada e uma seringa removível à prova de gás acoplada a agulhas de microinjeção. Este sistema de injeção também é adaptável para outras vias de administração intraocular.
Este protocolo oferece um método de entrega de terapia genética a múltiplos tecidos oculares de forma segura, fácil e eficaz. Também é adaptável para injeções intraestromais e sub-retinianas em pequenos animais. A utilização da via de injeção subconjuntival é minimamente invasiva.
Representa menos riscos e é uma grande promessa para a entrega de AV para tratar múltiplas doenças oculares. Com mais de 1 bilhão de pessoas em todo o mundo sofrendo de deficiência visual, o uso de um método seguro e fácil para a administração de medicamentos oferece ampla aplicabilidade para o tratamento de muitas causas diferentes de cegueira. Os métodos de entrega de genes descritos neste protocolo são de particular interesse para aqueles que estão desenvolvendo potenciais estratégias de intervenção e praticando oftalmologistas, que eventualmente entregarão esses medicamentos aos pacientes.
O maior desafio para alguém que está realizando este protocolo pela primeira vez é provavelmente a inserção da agulha no conceito de espaço conjuntival. Para começar, monte o sistema de injeção colocando um microscópio estéreo e uma bomba de seringa em um gabinete de biossegurança. Em seguida, corte a tubulação de polietileno em um comprimento de aproximadamente 50 centímetros.
Insira a extremidade de uma agulha de calibre 36 em uma extremidade da tubulação. Em seguida, encha uma seringa descartável de 3 mililitros com água estéril e insira-a no lado do tubo oposto à agulha. Lave a tubulação três vezes, alternando entre água estéril e álcool a 70% para desinfetar a tubulação e garantir que não haja vazamentos, entupimentos ou danos em toda a tubulação.
Usando a seringa descartável de 3 mililitros, encha a tubulação com água estéril e deixe a tubulação presa à seringa descartável. Em seguida, coloque um pedaço de paraespuma na superfície do gabinete de biossegurança e adicione uma piscina de água estéril a ele. Submerja a parte da tubulação conectada à agulha na piscina de água estéril.
Em seguida, puxe a seringa descartável para fora da abertura do tubo para evitar que qualquer ar entre no sistema de tubos após a remoção da seringa. Em seguida, encha uma seringa Hamilton de 10 microlitros com água estéril. Em seguida, conecte a agulha da seringa Hamilton à extremidade aberta da tubulação submergindo a ponta da agulha da seringa Hamilton na piscina de água estéril no filme para.
Mantenha pressionado o botão de marcha à ré rápida na tela da bomba para mover os blocos de pressão para o comprimento aproximado da seringa. Em seguida, desenrosque os botões de fixação do suporte para soltar os suportes de retenção no empurrador e os blocos do suporte da seringa. Subsequentemente, carregue a seringa Hamilton no bloco do suporte da seringa e prenda a seringa de acordo com as instruções do fabricante.
Para ajustar os parâmetros na tela de configuração da bomba, pressione o botão Force"e defina o nível de força em 30% Em seguida, aceite as alterações para voltar à tela de configuração. Pressione o botão Início Rápido", selecione Método e, em seguida, selecione a opção "Injetar somente". Para a opção de seringa, selecione Hamilton 1700, clique em "Vidro" e selecione 10 microlitros.
Mais tarde, selecione a velocidade de perfusão e o volume de injeção. Ejete a água da seringa Hamilton enquanto deixa a tubulação e a agulha de injeção cheias de água pressionando o botão "Infuse". Em seguida, retire o vírus colocando a agulha de injeção em uma alíquota do estoque de vírus.
Em seguida, puxe ligeiramente para trás a seringa Hamilton pressionando o botão reverso para introduzir uma pequena bolha de ar na tubulação. Depois de anestesiar o animal, pegue a conjuntiva com fórceps. Em seguida, insira a agulha na conjuntiva até que o bisel esteja totalmente coberto pela membrana conjuntival e coloque a agulha contra o globo.
Simultaneamente, inicie a injeção pressionando o botão Start"" usando o interruptor de pé. Para examinar a distribuição do vetor AAV, os tecidos oculares e circundantes foram corados com hematoxilina e eosina. Os cortes sagitais representativos demonstraram que a dispersão da tinta da Índia ocorreu principalmente adjacente aos músculos extraoculares na superfície externa da esclera nos tecidos conjuntivos peroculares soltos.
Para confirmar a transdução do AAV 8 auto-complementar às oito semanas após a injeção, a abundância de proteína de fluorescência verde nos cortes transversais foi examinada por coloração por imunofluorescência. Os resultados revelaram que os vetores AAV 8 transduziram eficientemente os músculos perioculares posteriores ao olho e à córnea. Para analisar a biodistribuição vetorial, os números de cópias do genoma vetorial e compartimentos oculares distintos em outros órgãos, incluindo fígado e coração, foram examinados por reação quantitativa em cadeia da polimerase usando primers e sondas específicas para o transgene.
A expressão do transgene foi confirmada pela reação em cadeia da polimerase quantitativa de transcrição reversa, que sugeriu que a injeção subconjuntival de AAV 8 resulta em expressão transgênica na pálpebra, conjuntiva, córnea e nervo óptico. A bolha de ar servirá como uma barreira entre a água no tubo e a droga terapêutica. Esta técnica permite que outros pesquisadores explorem o uso da via subconjuntival de administração para soluções oftálmicas e terapias genéticas oculares para múltiplas doenças.
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Visão Geral
Este protocolo oferece um método de entrega de terapia gênica para múltiplos tecidos oculares de maneira segura, fácil e eficaz. A via de injeção subconjuntival é minimamente invasiva e apresenta menores riscos, demonstrando grande potencial para a entrega de vírus adeno-associado (AV) no tratamento de diversas doenças oculares.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Terapia gênica
- Métodos de entrega ocular
- Técnicas minimamente invasivas
Antecedentes
- Mais de 1 bilhão de pessoas em todo o mundo sofrem de deficiência visual.
- Métodos seguros e fáceis de administração de medicamentos são cruciais para o tratamento da cegueira.
- O protocolo é adaptável para injeções intrastromais e subretinianas em animais pequenos.
- O desenvolvimento de estratégias de intervenção para doenças oculares é de grande interesse.
Objetivo do Estudo
- Demonstrar um método válido de entrega de vetores para tecidos oculares.
- Fornecer uma opção minimamente invasiva para terapia gênica.
- Aprimorar a segurança e a eficácia da administração de medicamentos oculares.
Métodos Utilizados
- Injeção subconjuntival utilizando uma bomba de seringa para infusão/retirada.
- Uso de uma seringa hermética removível acoplada a agulhas de microinjeção.
- Adaptação do sistema de injeção para diversas vias de administração intraocular.
- Avaliação de métodos de administração em modelos animais pequenos.
Resultados Principais
- O método de injeção subconjuntival é eficaz para a terapia gênica ocular.
- A mínima invasividade reduz os riscos associados às injeções oculares.
- O método apresenta ampla aplicabilidade no tratamento de múltiplas doenças oculares.
- Potencial para impacto significativo no tratamento da deficiência visual.
Conclusões
- A injeção subconjuntival é um método promissor para a administração de medicamentos oculares.
- Oferece uma abordagem segura e eficaz para a terapia gênica.
- O protocolo pode auxiliar oftalmologistas na administração de tratamentos aos pacientes.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A administração subconjuntival de vetores de vírus adeno-associado (AAV) em modelos animais pequenos soluciona o desafio de uma entrega gênica segura e localizada para doenças oculares. Este método minimamente invasivo permite o direcionamento preciso dos tecidos oculares, apoiando a confiança preditiva em pesquisas de terapia gênica em estágios iniciais. Sua adaptabilidade e reprodutibilidade o posicionam como uma ferramenta valiosa para triagem de portfólios e continuidade translacional no desenvolvimento de fármacos oftálmicos.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Permite a investigação de hipóteses de entrega gênica em tecidos oculares com mínima invasividade.
- Apoia a redução de riscos biológicos ao permitir a transdução direcionada e a análise de expressão específica por tecido.
- Facilita a confiança preditiva na seleção de vetores e na via de administração para programas de terapia gênica ocular.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Prepara modelos validados de pequenos animais para avaliação posterior da expressão gênica e direcionamento tecidual.
- Padroniza parâmetros de injeção para reprodutibilidade e avaliação quantitativa da distribuição do vetor.
- Permite comparação confiável de sorotipos de AAV e vias de administração para prontidão em triagem.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Alinha-se a modelos oculares relevantes para a doença, a fim de avaliar a expressão de biomarcadores traducionais após a administração.
- Apóia a continuidade desde a descoberta até a validação pré-clínica, confirmando a expressão de transgenes específica para o tecido-alvo.
- Fornece dados ajustados ao risco para decisões de avanço nas etapas da terapia gênica ocular.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este método integra-se ao continuum de descoberta a pré-clínico ao permitir testes de hipóteses, otimização de vetores e validação quantitativa em modelos oculares de pequenos animais.
- Biologia da Descoberta: Apoia a clarificação de vias e a redução de riscos biológicos por meio da entrega direcionada de genes e análise de expressão gênica.
- Triagem: Fornece resultados quantitativos e reprodutíveis para comparar o desempenho de vetores e vias de administração.
- Análises: Oferece medições baseadas em imunofluorescência e qPCR para avaliar a expressão do transgene e a biodistribuição em tecidos específicos.
- Pesquisa Translacional: Conecta a fase inicial de descoberta à validação pré-clínica, confirmando a entrega e expressão em tecidos relevantes para a doença.
- Reutilização Empresarial: Oferece uma plataforma padronizada e adaptável para diversos estudos de terapia gênica oftálmica e entrega de fármacos.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva e reduz a ambiguidade mecanicista na pesquisa de terapia gênica ocular.
- Valor Operacional: Aprimora a padronização, reprodutibilidade e escalabilidade dos protocolos de administração ocular.
- Valor Estratégico: Melhora a tomada de decisões de avanço ou interrupção de projetos e a eficiência do capital ao fornecer dados robustos em estágios iniciais.
- Impacto na Carteira: Permite a priorização e o avanço ajustados ao risco de candidatos à terapia gênica ocular.
Considerações sobre a Implementação
- Exige experiência em procedimentos oculares em pequenos animais e técnicas de microinjeção.
- Requer acesso a bombas de seringa programáveis, microscópios cirúrgicos e ferramentas analíticas para validação.
- Exige padronização entre equipes dos parâmetros de injeção e ensaios de validação.
- Adaptável a várias vias de administração intraocular e soluções oftálmicas.
- As limitações práticas incluem os requisitos de habilidade técnica e considerações anatômicas específicas do modelo.
