Name: Localização de fator unicelular em Chromatina usando decote de entrada ultra-baixa sob alvos e liberação usando nuclease (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: Aprenda a técnica CUT&RUN para localização de proteínas na cromatina em nível unicelular usando formato manual de 96 poços. Este método de baixa entrada celular permite análise de amostras raras e preciosas em um único dia.

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Agradecemos aos membros do Laboratório Hainer por lerem e comentarem uma versão anterior deste manuscrito. Este projeto utilizou o NextSeq500 disponível no Núcleo de Sequenciamento de Ciências da Saúde da Universidade de Pittsburgh no UPMC Children's Hospital of Pittsburgh para sequenciamento com agradecimentos especiais ao seu diretor, William MacDonald. Esta pesquisa foi apoiada em parte pelo Centro de Computação de Pesquisa da Universidade de Pittsburgh através dos recursos de computador fornecidos. Este trabalho foi apoiado pelo Número de Subvenção dos Institutos Nacionais de Saúde R35GM133732 (para S.J.H.).

Declaração ética: Todos os estudos foram aprovados pelo Escritório de Proteção à Pesquisa da Universidade de Pittsburgh.
1. Prepare contas magnéticas
NOTA: Realize antes da triagem celular e segure no gelo até o uso.
<ol><li>Pipeta 30 μL de microesferas paramagnéticas conjugadas misturam chorume por reação a um tubo fresco de microfuça de 1,5 mL e adicionam 850 μL de Buffer de Ligação, pipetando suavemente para misturar. NOTA: Microesferas paramagnéticas conjugadas pela são contas magnéticas revestidas de lectina que permitem a ligação da membrana lipídica.</li>
	<li>Coloque o tubo em um rack magnético e deixe que as contas magnetizem por 1-2 min. Uma vez que o supernatante tenha limpado, remova e descarte o supernatante sem perturbar as contas.</li>
	<li>Remova o tubo do rack magnético e lave as contas reutilizando em 1 mL de buffer de ligação.</li>
	<li>Repita as etapas 1.2 e 1.3.</li>
	<li>Magnetize as contas por 2 minutos e remova o supernatante para descartar.</li>
	<li>Remova o tubo do rack magnético e resuspense as contas em 30 μL de Buffer de ligação por reação.</li>
	<li>Segure a mistura de contas lavadas no gelo até que as células sejam classificadas.</li>
</ol>2. Células de colheita
NOTA: Esta etapa é escrita para células aderidas e otimizada para células-tronco embrionárias murine E14. A colheita e a colheita das células dependem do tipo celular.
<ol><li>Remova as células da incubadora de 37 °C e examine-as sob um microscópio para garantir a qualidade.</li>
	<li>Aspire a mídia da placa celular e enxágue com 5 mL de PBS 1x.</li>
	<li>Aspirar PBS da placa e colher as células (utilizando métodos tradicionais de colheita celular que diferem por tipo de célula). Obtenha suspensão unicelular, encanar suavemente para cima e para baixo com uma pipeta sorológica contra o prato de cultura, se necessário.</li>
	<li>Transfira a suspensão celular para um tubo cônico de 15 mL e gire a 200 x g por 5 min.</li>
	<li>Aspire fora da mídia para descartar e lavar a pelota celular com 5 mL de PBS + 1% FBS.</li>
	<li>Gire as células a 200 x g por 5 min, descarte o supernascedor e resuspenque a pelota celular em 5 mL de PBS + 1% FBS.</li>
	<li>Conte as células e transfira 1 mL de 1 x 106 células para um tubo de microfuça de 1,5 mL fresco.</li>
	<li>Adicione 5 μL de 7-Amino-Actinomicina D (7-AAD), inverta bem o tubo para misturar e, em seguida, aplique a amostra no classificador celular para classificar células individuais vivas em poços individuais de uma placa de 96 poços. NOTA: O corante 7-AAD é excluído das células vivas e, portanto, pode ser usado na triagem de células vivas.</li>
</ol>3. Classificação celular e lise celular
<ol><li>Prepare uma placa de 96 poços compatível com o classificador celular com 100 μL de buffer de extração nuclear (NE) em cada poço antes da classificação celular.</li>
	<li>Classifique as células em placas de 96 poços seguindo as instruções do fabricante.</li>
	<li>Gire rapidamente a placa (600 x g para 30 s) para garantir que as células estejam no buffer dentro dos poços. NOTA: Vale a pena testar em um experimento preliminar se as células que estão sendo usadas são de forma confiável trazidas para o fundo dos poços.</li>
	<li>Segure as amostras no gelo por 15 minutos.</li>
	<li>Gire as amostras a 600 x g por 5 min a 4 °C e cuidadosamente pipeta para remover o supernaspetivo (deixando para trás 5 μL).</li>
	<li>Resuspenque cada amostra em 55 μL de buffer NE e adicione 30 μL das microesferas paramagnéticas pré-lavadas conjugadas (a partir do passo 1,7; em Buffer de Ligação) a cada reação.</li>
	<li>Incubar em temperatura ambiente por 10 minutos.</li>
</ol>4. Amostras pré-bloco para evitar a digestão precoce por MNase
<ol><li>Coloque a placa em um rack magnético de 96 poços, deixe as contas se amarrarem por um mínimo de 5 minutos e, em seguida, remova e descarte o sobrenatário.</li>
	<li>Adicione 100 μL de Tampão de Bloqueio às contas ligadas ao núcleo e misture com tubulação suave.</li>
	<li>Incubar por 5 minutos em temperatura ambiente.</li>
</ol>5. Adição de anticorpo primário
<ol><li>Coloque a placa em um rack magnético de 96 poços, deixe o supernatante limpar por um mínimo de 5 minutos e, em seguida, remova e descarte o sobrenante sem perturbar as contas.</li>
	<li>Remova a placa do rack magnético e resuspenque as contas em 100 μL de Wash Buffer por reação com tubulação suave.</li>
	<li>Coloque a placa de volta no rack magnético de 96 poços, deixe o supernatante limpar e, em seguida, remova e descarte o supernatante.</li>
	<li>Resuspenda as contas em 25 μL de Wash Buffer por reação com tubulação suave.</li>
	<li>Faça uma mistura principal de mestre de anticorpos: 25 μL de Wash Buffer + 0,5 μL de anticorpo por reação.</li>
	<li>Enquanto suavemente vórtice as contas ligadas aos núcleos, adicione 25 μL da mistura principal de anticorpos mestre a cada amostra que está sendo tratada com um anticorpo visando a proteína de interesse (tipicamente 1:100 diluição final). Adicione 25 μL de Wash Buffer sem anticorpos, se realizar um controle.</li>
	<li>Incubar por 1h à temperatura ambiente.</li>
	<li>Coloque as amostras em um rack magnético de 96 poços, permita que o supernatante se limpe por um mínimo de 5 minutos e, em seguida, remova e descarte o sobrenatário sem perturbar as contas.</li>
	<li>Remova a placa do rack magnético e lave as contas com 100 μL de Tampão de Lavagem, reutilizando por pipetação.</li>
</ol>6. Adição de pA-MNase ou pA/G-MNase
NOTA: A proteína A tem uma alta afinidade com moléculas de IgG de determinadas espécies, como coelhos, mas não é adequada para IgGs de outras espécies, como ratos ou ratos. Alternativamente, a Proteína A/G-MNase pode ser usada. Este híbrido liga IgGs de coelho, rato e rato, evitando a necessidade de anticorpos secundários quando anticorpos primários de rato ou rato são usados.
<ol><li>Coloque a placa de volta em um rack magnético de 96 poços, deixe o supernatante limpar por um mínimo de 5 minutos, e depois remova e descarte o sobrenatário sem perturbar as contas.</li>
	<li>Remova a placa do rack magnético e resuspenque cada amostra em 25 μL de Wash Buffer.</li>
	<li>Faça um mix mestre pA-MNase (25 μL de Wash Buffer + quantidade otimizada de pA-MNase por reação).</li>
	<li>Enquanto suavemente vórtice, adicione 25 μL da mistura mestre pA-MNase a cada amostra, incluindo as amostras de controle. NOTA: A concentração de pA-MNase varia após a preparação, se caseira, e deve ser testada antes de ser usada em cada purificação independente. Para pA/G-MNase, devem ser utilizados 2,5 μL do estoque de 20x.</li>
	<li>Incubar as amostras por 30 minutos em temperatura ambiente.</li>
	<li>Coloque a placa em um rack magnético de 96 poços, deixe o supernatante limpar por um mínimo de 5 minutos e, em seguida, remova e descarte o sobrenante sem perturbar as contas.</li>
	<li>Remova a placa do rack magnético e lave as contas com 100 μL de Tampão de Lavagem, reutilizando-se por tubulação suave.</li>
</ol>7. Digestão de DNA direcionada
<ol><li>Coloque a placa em um rack magnético de 96 poços, deixe o supernatante limpar por um mínimo de 5 minutos e, em seguida, remova e descarte o sobrenatário.</li>
	<li>Remova as amostras do rack magnético e resuspenja as contas em 50 μL de Wash Buffer por tubulação suave.</li>
	<li>Equilibre as amostras para 0 °C em uma mistura de gelo/água por 5 minutos.</li>
	<li>Remova as amostras do banho de gelo/água de 0 °C e adicione 1 μL de 100 mM CaCl2 usando uma pipeta multicanal. Misture bem (3-5 vezes) com tubos suaves usando uma pipeta multicanal de maior volume e, em seguida, devolva as amostras para 0 °C. NOTA: Misturar bem aqui é essencial. CaCl2 é adicionado para ativar a digestão MNase do DNA flanqueando a proteína de interesse.</li>
	<li>Inicie um temporizador de 10 minutos assim que a placa voltar ao banho de gelo/água.</li>
	<li>Pare a reação pipetando 50 μL de buffer 2XRSTOP+ em cada poço, na mesma ordem que o CaCl2 foi adicionado. NOTA: Faça o buffer 2XRSTOP+ antes que a digestão de 10 minutos acabe para evitar a digestão excessiva.</li>
</ol>8. Fracionamento da amostra
<ol><li>Incubar as amostras por 20 min a 37 °C.</li>
	<li>Gire a placa a 16.000 x g por 5 min a 4 °C.</li>
	<li>Coloque a placa em um rack magnético de 96 poços, deixe o supernatante limpar por um mínimo de 5 minutos, e transfira supernantes para uma placa fresca de 96 poços. Descarte as contas.</li>
</ol>9. Extração de DNA
<ol><li>Adicione 1 μL de Sulfato de Dodecyl de Sódio (SDS) e 0,83 μL de 20 mg/mL Proteinase K a cada amostra. ATENÇÃO: O pó SDS é prejudicial se inalado. Os usuários devem usar em espaços bem ventilados usando óculos, luvas e um respirador de grau N95, manuseando com cuidado.</li>
	<li>Misture as amostras por tubulação suave.</li>
	<li>Incubar as amostras por 10 min a 70 °C.</li>
	<li>Volte a placa à temperatura ambiente e adicione 46,6 μL de 5 M NaCl e 90 μL de 50% PEG 4000. Misture por pipetação suave.</li>
	<li>Adicione 33 μL de contas de poliestireno-magnetita a cada amostra e incubar por 10 minutos à temperatura ambiente. NOTA: Certifique-se de levar as contas de poliestireno-magnetita à temperatura ambiente (~30 min) e misturar bem antes de usar.</li>
	<li>Coloque a placa em um rack magnético e deixe o supernatante limpar por ~5 minutos, e depois descarte cuidadosamente o sobrenante sem perturbar as contas.</li>
	<li>Enxágüe 2x com 150 μL de 80% de etanol sem perturbar as contas. ATENÇÃO: O etanol é altamente inflamável e causa irritação na pele, nos olhos e no pulmão. Realize esta etapa com roupas de laboratório adequadas e em um capô ventilado.</li>
	<li>Gire a placa brevemente a 1000 x g para 30 s. Coloque a placa de volta em um rack magnético de 96 poços e remova todos os EtOH residuais sem perturbar as contas.</li>
	<li>Seque as amostras por ~2-5 min. NOTA: Não seque as contas por mais de 5 minutos. Se for diligente em remover o EtOH, 2-3 min de secagem é suficiente.</li>
	<li>Resuspenncie as contas com 37,5 μL de 10 mM Tris-HCl (pH 8) e incubar por 5 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Coloque a placa em um rack magnético e deixe as contas se amarrarem por 5 minutos.</li>
	<li>Transfira 36,5 μL do supernante para uma placa de 96 poços compatível com termocicl. Descarte as contas. NOTA: O experimento pode ser interrompido aqui armazenando amostras a -20 °C ou pode continuar com a construção da biblioteca (etapas 10-15).</li>
</ol>10. Reparação final, fosforilação, adenilação
NOTA: Os reagentes são originados como referenciados na Tabela de Materiais. O protocolo abaixo segue um método semelhante ao kit comercial, como o kit NEBNext Ultra DNA II.
<ol><li>Diluir 5 U/μL de polimerase de DNA T4 1:20 em 1x tampão de ligase de DNA T4.</li>
	<li>Prepare um mix mestre de reparo final/3'A: 2 μL de 10x tampão de ligase de DNA T4, 2,5 μL de 10 mM dNTPs, 1,25 μL de 10 mM ATP, 3,13 μL de 40% PEG 4000, 0,63 μL de 10 U/μL T4 PNK, 0,5 μL de polimerase de DNA T4 diluída, 0,5 μL de polimerase de DNA Taq 5U/μL, com um volume total de 13,5 μl de reação de DNA por. NOTA: Certifique-se de levar 40% PEG 4000 à temperatura ambiente antes de pipetar.</li>
	<li>Adicione 13,5 μL de reparação final/3'A mistura mestre a 36,5 μL de DNA.</li>
	<li>Misture a reação com vórtice rápido e, em seguida, um giro rápido (500 x g para 10 s).</li>
	<li>Incubar usando as seguintes condições de reação em um termociclador pré-resfriado com uma tampa aquecida para temperaturas >20 °C. Use as condições de reação: 12 °C para 15 min, 37 °C para 15 min, 72 °C para 20 min, mantenha em 4 °C.</li>
</ol>11. Ligadura adaptador
NOTA: Mantenha as amostras no gelo enquanto configura a seguinte reação. Deixe que o tampão ligase chegue à temperatura ambiente antes de pipetar. Diluir o Adaptador (ver Tabela de Materiais) em uma solução de 10 mM Tris-HCl contendo 10 mM NaCl (pH 7.5). Devido ao baixo rendimento, não pré-quantifique o DNA enriquecido pela CUT&RUN. Em vez disso, gerar diluições 25 vezes do adaptador, utilizando uma concentração final do adaptador de trabalho de 0,6 μM.
<ol><li>Faça uma mistura mestre de ligadura: 55 μL de tampão de ligase (2x), 5 μL de liga ligase de DNA T4 e 5 μL de Adaptador diluído, com um volume total de 65 μL por reação.</li>
	<li>Adicione 65 μL da mistura de ligadura mestre a 50 μL de DNA a partir da etapa 10.5.</li>
	<li>Misture por vórtice rápido, seguido de giro rápido (500 x g para 10 s).</li>
	<li>Incubar a 20 °C em um termociclador (sem tampa aquecida) por 15 min. NOTA: Proceda imediatamente para a seguinte etapa.</li>
</ol>12. Digestão do USUÁRIO
<ol><li>Adicione 3 μL de enzima US a cada amostra, vórtice e giro (500 x g para 10 s).</li>
	<li>Incubar em ciclofaixa térmica a 37 °C por 15 min (tampa aquecida a 50 °C).</li>
</ol>13. Limpeza de contas de poliestireno-magnetita após reação de ligadura
NOTA: Permitir que as contas de poliestireno-magnetita se equilibrem à temperatura ambiente (~30 min). Vórtice para homogeneizar a solução de contas antes de usar. Realize as seguintes etapas em temperatura ambiente.
<ol><li>Adicione 39 μL (0,33x) de solução de contas de hidrostimo de poliestireno a cada bem que contenha DNA ligado por adaptador.</li>
	<li>Misture bem por pipetar e, em seguida, incubar as amostras à temperatura ambiente por 15 minutos para permitir que o DNA se ligue às contas.</li>
	<li>Coloque as amostras em um rack magnético de 96 poços e incubar por 5 minutos até que o sobrenatante esteja limpo.</li>
	<li>Mantenha a placa no rack magnético e remova cuidadosamente e descarte o sobrenatário sem perturbar as contas.</li>
	<li>Enxágüe as contas com 200 μL de 80% EtOH sem perturbar as contas.</li>
	<li>Incubar por 30 s em um rack magnético de 96 poços para permitir que a solução seja limpa.</li>
	<li>Remova e descarte o supernatante sem perturbar as contas.</li>
	<li>Repita as etapas 13.5-13.7 para um total de duas lavagens.</li>
	<li>Gire a placa brevemente a 500 x g para 10 s, coloque a placa de volta em um rack magnético de 96 poços e remova o EtOH residual sem perturbar as contas.</li>
	<li>Mantenha a placa no rack magnético e seque as amostras por 2 minutos. NOTA: Não seque demais as contas.</li>
	<li>Remova a placa do rack magnético e resuspenque as contas em 28,5 μL de 10 mM Tris-HCl (pH 8). ATENÇÃO: O ácido clorídrico é muito corrosivo. Os usuários devem lidar com isso com cuidado em um capuz de fumaça química usando óculos, luvas e um jaleco.</li>
	<li>Resuspend completamente as contas por pipetação, tomando cuidado para não produzir bolhas.</li>
	<li>Incubar por 5 minutos em temperatura ambiente.</li>
	<li>Coloque a placa em um rack magnético de 96 poços e deixe a solução limpar por 5 minutos.</li>
	<li>Transfira 27,5 μL de supernaspeso para uma nova placa PCR e descarte as contas.</li>
</ol>14. Enriquecimento da biblioteca
NOTA: Os primers são diluídos com a mesma solução do adaptador. Para esta construção da biblioteca, use uma concentração final de primer de trabalho de 0,6 μM.
<ol><li>Adicione 5 μL de primer indexado diluído (ver Tabela de Materiais) a cada amostra. NOTA: Cada amostra precisa de um índice diferente para ser identificado após o sequenciamento.</li>
	<li>Prepare um mix mestre pcr: 10 μL de 5x tampão PCR de alta fidelidade, 1,5 μL de 10 mM dNTPs, 5 μL de primer Universal diluído, 1 μL de 1 U hot start de alta fidelidade polimerase, com um volume total de mix mestre de 17,5 μL por amostra.</li>
	<li>Adicione 17,5 μL pf MISTURA PCR a 32,5 μL de DNA purificado adaptado a adaptador (5 μL de primer indexado está incluído neste volume).</li>
	<li>Misture a solução por pipetação.</li>
	<li>Incubar em um termociclador utilizando as seguintes condições de reação com uma velocidade máxima de 3 °C/s: 98 °C para 45 s, 98 °C para 45 s, 60 °C para 10 s, repita o segundo e terceiro passos 21 vezes, 72 °C para 1 min, mantenha em 4 °C. NOTA: As amostras podem ser mantidas a 4 °C para armazenamento a curto prazo ou -20 °C para armazenamento a longo prazo.</li>
</ol>15. Limpeza de contas de poliestireno-magnetita
<ol><li>Adicione 60 μL (1,2x) de contas de poliestireno-magnetita a cada amostra.</li>
	<li>Resuspenda as contas por pipetação e incubar por 15 minutos à temperatura ambiente.</li>
	<li>Coloque a placa em um rack magnético por 5 minutos até que a solução esteja clara.</li>
	<li>Descarte o supernasce e enxágue as contas com 200 μL de 80% De SI sem perturbar as contas.</li>
	<li>Repita a etapa de lavagem para um total de duas lavagens de 80% etoh.</li>
	<li>Gire a placa a 500 x g para 10 s, coloque a placa em um rack magnético de 96 poços e deixe as contas se amarrarem por 5 minutos.</li>
	<li>Pipeta para remover o excesso de EtOH sem perturbar as contas e permitir que as contas sequem ao ar por 2 minutos. NOTA: Não seque demais as contas.</li>
	<li>Resuspenda as contas em 21 μL de água sem nuclease e incubar por 5 minutos à temperatura ambiente.</li>
	<li>Coloque a placa em um rack magnético e deixe a solução limpar por 5 minutos.</li>
	<li>Transfira 20 μL do supernatante para uma nova placa. NOTA: O experimento pode ser interrompido aqui armazenando a amostra a -20 °C.</li>
	<li>Quantifique as concentrações da biblioteca com um fluorômetro (ver Tabela de Materiais), usando um reagente 1x HS.</li>
	<li>Se a concentração permitir, execute 30 ng de amostra em gel de 1,5% de agarose com uma escada de baixo peso molecular para visualizar. Alternativamente, visualize em um Analisador de Fragmentos ou instrumento relacionado.</li>
	<li>Bibliotecas sequenciadas em uma plataforma de Illumina para obter ~50.000-100.000 leituras exclusivamente mapeadas.</li>
</ol>

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<li>Buenrostro, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+chromatin+accessibility+reveals+principles+of+regulatory+variation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single-cell chromatin accessibility reveals principles of regulatory variation.</a> Nature. 523 (7561), 486-490 (2015).</li>
</ol>

Os autores declaram não haver interesses concorrentes relacionados a este projeto.

CUT&RUN é um protocolo eficaz para determinar a localização de proteínas na cromatina. Tem muitas vantagens em relação a outros protocolos, incluindo: 1) alta relação sinal-ruído, 2) protocolo rápido e 3) baixa cobertura de leitura de sequenciamento necessária, levando, assim, à redução de custos. O uso de Proteína A- ou Proteína A/G-MNase permite que o CUT&RUN seja aplicado com qualquer anticorpo disponível; portanto, tem o potencial de traçar rapidamente e facilmente muitas proteínas. No entanto, a adaptação a célula ú...

Muitas proteínas nucleares funcionam interagindo com a cromatina para promover ou prevenir atividades modeldas por DNA. Para determinar a função dessas proteínas que interagem com a cromatina, é importante identificar os locais genômicos em que essas proteínas estão ligadas. Desde o seu desenvolvimento em 1985, a Imunoprecipitação Chromatina (ChIP) tem sido o padrão-ouro para identificar onde uma proteína se liga à cromatina 1,2. A técnica tradicional de ChIP tem o seguinte fluxo de trabalho básico: as células são colhidas e cruzadas (geralmente com formaldeído), a cromatina é ensaboada (geralmente com métodos de sônica dura, necessitando de crosslinking), a proteína de interesse é imunoprecipitada usando um anticorpo que visa a proteína (ou proteína marcada) seguido por um anticorpo secundário (acoplado a garose ou contas magnéticas), crosslinking é revertido, proteína e RNA são digeridos para purificar o DNA, e este DNA enriquecido chIP é usado como modelo para análise (usando sondas radiolabeled 1,2, qPCR3, microarrays 5,6, ou sequenciamento4). Com o advento das microarrays e do sequenciamento profundo massivamente paralelo, o Chip ChIP 5,6 e o ChIP-seq4 foram mais recentemente desenvolvidos e permitem a identificação em todo o genoma da localização de proteínas na cromatina. Crosslinking ChIP tem sido uma técnica poderosa e confiável desde o seu advento com grandes avanços na resolução por ChIP-exo7 e ChIP-nexus8. Paralelamente ao desenvolvimento de protocolos chip-seq, nativos (não-crosslinking) para ChIP (N-ChIP) foram estabelecidos, que utilizam digestão nuclease (muitas vezes usando nuclease microcócica ou MNase) para fragmentar a cromatina, em oposição à sonicação realizada nas técnicas tradicionais de ChIP transligação9. No entanto, uma grande desvantagem tanto para as tecnologias de ChIP e N-ChIP de crosslinking tem sido a exigência de números de células elevados devido ao baixo rendimento de DNA após a manipulação experimental. Portanto, nos anos mais recentes, muitos esforços têm sido para otimizar as tecnologias chip para baixa entrada celular. Esses esforços resultaram no desenvolvimento de muitas tecnologias poderosas baseadas em ChIP que variam em seus requisitos de aplicabilidade e insumo 10,11,12,13,14,15,16,17,18. No entanto, faltam tecnologias baseadas em ChIP-seq unicelulares, especialmente para proteínas não histonas.
Em 2004, uma tecnologia alternativa foi desenvolvida para determinar a ocupação proteica em chromatina denominada Chromatin Endogenous Cleavage (ChEC) e Chromatin Immunocleavage (ChIC)19. Essas técnicas de locus único utilizam uma fusão de MNase para a proteína de interesse (ChEC) ou para a proteína A (ChIC) para corte direto do DNA adjacente à proteína de interesse. Nos anos mais recentes, tanto o ChEC quanto o ChIC foram otimizados para o perfil de proteína em todo o genoma em cromatina (ChEC-seq e CUT&RUN, respectivamente)20,21. Embora o ChEC-seq seja uma técnica poderosa para determinar a localização de fatores, requer o desenvolvimento de proteínas de fusão de MNase para cada alvo, enquanto o ChIC e sua variação genoma-em todo o genoma, CUT&RUN, dependem de um anticorpo direcionado para a proteína de interesse (como com chip) e proteína recombinante A-MNase, onde a Proteína A pode reconhecer a região constante de IgG do anticorpo. Como alternativa, foi desenvolvida uma proteína de fusão A/Protein G-MNase (pA/G-MNase) que pode reconhecer uma gama mais ampla de regiões constantes de anticorpos22. A CUT&RUN tornou-se rapidamente uma alternativa popular ao ChIP-seq para determinar a localização de proteínas em todo o genoma da cromatina.
A entrada ultra-baixa CUT&RUN (uliCUT&RUN), uma variação da CUT&RUN que permite o uso de entradas de células baixas e unicelulares, foi descrita em 201923. Aqui, a metodologia para um formato manual de 96 poços de aplicação unicelular é descrita. É importante notar que desde o desenvolvimento do uliCUT&RUN, duas alternativas para o perfil de histona, CUT&Tag e iACT-seq foram desenvolvidas, fornecendo perfil robusto e altamente paralelo das proteínas histonas24,25. Além disso, o scCUT&Tag foi otimizado para traçar múltiplos fatores em uma única célula (multiCUT&Tag) e para aplicação a proteínas não histonas26. Juntas, a CUT&RUN oferece uma alternativa atraente para chip-seq de baixa entrada, onde o uliCUT&RUN pode ser realizado em qualquer laboratório de biologia molecular que tenha acesso a um classificador de células e equipamentos padrão.

<table><tbody><tr><td>Tubos de microfuga transparentes de 1,5 mL</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>90410</td><td></td></tr><tr><td>Rack magnético de tubo de 1,5 mL</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga fria compatível com tubo de 1,5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>5404000537</td><td></td></tr><tr><td>placas de cultura de tecidos estéreis de 10 cm</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>150464</td><td></td></tr><tr><td>10X T4 DNA Ligase</td><td>tampão Novo Tubos</td> cônicos de 15 mL da England Biolabs <td>B0202S</td><td></td></tr><tr><td></td><td>VWR</td><td>89039-656</td><td></td></tr><tr><td>1X TE buffer</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12090015</td><td></td></tr><tr><td>200 &micro; L Tubos de PCR</td><td>Eppendorf</td><td>951010022</td><td></td></tr><tr><td>2X tampão de ligase rápida</td><td>New England Biolabs</td><td>M2200</td><td>Tampão de ligase</td></tr><tr><td>5X KAPA Tampão HiFi</td><td>Roche</td><td>7958889001</td><td>5X tampão de PCR de alta fidelidade</td></tr><tr><td>7-Amino-Actinomicina D (7-AAD)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BDB559925</td><td></td></tr><tr><td>Rack magnético de 96 poços</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12027 ou 12331D</td><td></td></tr><tr><td>Placa de 96 poços</td><td>VWR</td><td>82006-636</td><td></td></tr><tr><td>AMPure XP contas</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63881</td><td>contas de poliestireno-magnetita; Devido à potencial variabilidade entre AMPure XP lotes de cordão, é recomendado que seu AMPure solução de bead ser calibrado. Ver fabricante' s instruções</td></tr><tr><td>Anticorpo para proteína de interesse</td><td>varia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>R0441</td><td></td></tr><tr><td>BioMag Plus Concanavalina A grânulos Polysciences</td><td></td><td>86057-10</td><td>Microesferas paramagnéticas conjugadas com</td></tr><tr><td>BSA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de cálcio (CaCl2)</td><td>Fisher Scientific</td><td>AAJ62905AP</td><td></td></tr><tr><td>Classificador de células</td><td>BD FACSAria II Classificador</td><td></td> de células <td>Requer treinamento</td></tr><tr><td>Meios específicos para células para cultura de células</td><td>Varia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Clorofórmio</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>C298-500</td><td>O clorofórmio é irritante e prejudicial para a pele se ingerido; manuseie um exaustor químico usando luvas, jaleco e óculos de proteção</td></tr><tr><td>Computador com processador de 64 bits e acesso a um cluster</td><td></td><td></td> de supercomputação<td>Para análises computacionais de conjuntos de dados de sequenciamento resultantes</td></tr><tr><td>Colunas de rotação de DNA</td><td>Epoch Life Sciences</td><td>1920-250</td><td></td></tr><tr><td>dNTP conjunto</td><td>New England Biolabs</td><td>N0446S</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>O equipamento de eletroforese</td><td>varia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>22032601</td><td>100% vol/vol etanol é altamente inflamável; manuseie em um exaustor químico usando luvas, um jaleco, e óculos de proteção</td></tr><tr><td>Ácido etilenodiaminotetracético (EDTA)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2482100</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F2442</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP229-1</td><td></td></tr><tr><td>Glicogênio</td><td>VWR</td><td>97063-256</td><td></td></tr><tr><td>HEPES Fisher Scientific</td><td>BP310-500</td><td></td><td>Heterólogo</td></tr><tr><td>S. cerevisiae DNA spike-in</td><td>caseiro</td><td></td><td>Preparado a partir de DNA genômico extraído em gel reticulado, digerido por MNase e agarose, purificado de proteína/RNA e diluído a 10 ng/mL. Recomendamos DNA genômico de levedura, mas outros organismos podem ser usados, se necessário.</td></tr><tr><td>Ácido clorídrico&nbsp; (HCl)</td>O ácido clorídrico <td>A144-212</td> da <td>Fisher Scientific</td><td>é muito corrosivo; manuseie um exaustor químico usando luvas, jaleco e óculos de proteção</td></tr><tr><td>Balde de gelo</td><td>varia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plataforma de sequenciamento Illumina (por exemplo, NextSeq500)</td> Incubadora <td>Illumina</td><td></td><td></td></tr><tr><td>com controle de temperatura e atmosfera</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>51030284</td><td></td></tr><tr><td>Polimerase de DNA de alta fidelidade KAPA HotStart com tampão de alta fidelidade KAPA 5X</td><td>Roche</td><td>7958889001</td><td>hotstart polimerase de alta fidelidade</td></tr><tr><td>Capa de fluxo laminar</td><td>Bakery Company</td><td>SG404</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de manganês (MnCl2)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>244589</td><td></td></tr><tr><td>Conjunto de micropipetas</td><td>Rainin</td><td>30386597</td><td></td></tr><tr><td>Minifuge</td><td>Benchmark Scientific</td><td>C1012</td><td></td></tr><tr><td>Adaptador NEB</td><td>New England Biolabs</td><td>E6612AVIAL</td><td>Adaptador</td></tr><tr><td>NEB Primer universal</td><td>New England Biolabs</td><td>E6611AVIAL</td><td>Universal Primer</td></tr><tr><td>NEBNext Multiplex Oligos para kit Illumina</td><td>New England Biolabs</td><td>E7335S/L, E7500S/L, E7710S/L, E7730S/L</td><td>Primers indexados</td></tr><tr><td>Anticorpos anticorpo de controle</td><td>negativo-ABIN101961</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>on-lineÁgua livre de nuclease</td><td>New England Biolabs</td><td>B1500S</td><td></td></tr><tr><td>PCR termociclador</td><td>Eppendorf</td><td>2231000666</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de bloqueio de fase</td><td>Qiagen</td><td>129046</td><td></td></tr><tr><td>Fenol/clorofórmio/álcool isoamílico (PCI)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15593049</td><td>O fenol é prejudicial se ingerido ou em contato com a pele; manuseie um exaustor químico usando luvas, jaleco e óculos de proteção</td></tr><tr><td>Hipoteta de ajuda para solução salina tamponada com fosfato (PBS)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10814010</td><td></td></tr><tr><td>Drummond</td><td>Scientific</td><td># 4-000-100</td><td></td></tr><tr><td>Polietilenoglicol (PEG) 4000</td><td>VWR</td><td>A16151</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de Potássio (KCl)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de Potássio (KOH)</td><td>Fisher Scientific</td><td>P250-1</td><td>CUIDADO KOH é um irritante para os olhos / pele como um sólido e corrosivo em solução. Manuseie um exaustor químico usando luvas, jaleco e óculos de proteção</td></tr><tr><td>Inibidores de protease</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>78430</td><td></td></tr><tr><td>ProteinA/G-MNase</td><td>Epicypher</td><td>15-1016</td><td>pA/G-MNase</td></tr><tr><td>ProteinA-MNase, purificado de pK19pA-MN</td><td>Addgene</td><td>86973</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Kit de ensaio</td><td></td> New England Biolabs P8107S <td></td></tr><tr><td>Qubit 1X dsDNA HS</td><td>Tubos de ensaio ThermoFisher Scientific</td><td>Q33230</td><td></td></tr><tr><td>Qubit</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Q32856</td><td></td></tr><tr><td>Qubit Fluorometer</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Q33238</td><td></td></tr><tr><td>Quick Ligase com 2X Quick Ligase buffer</td><td>New England Biolabs</td><td>M2200S</td><td></td></tr><tr><td>RNase A</td><td>New England Biolabs</td><td>T3010</td><td></td></tr><tr><td>Acetato de Sódio&nbsp; (NaOAc)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>BP333-500</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de Sódio (NaCl)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5150-1L</td><td></td></tr><tr><td>Dodecil sulfato de Sódio (SDS)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>BP166-500</td><td>SDS é venenoso se inalado; manuseie com cuidado em espaços bem ventilados usando luvas, proteção para os olhos e um respirador de grau N95 ao manusear</td></tr><tr><td>Hidróxido de Sódio (NaOH)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S318-1</td><td>O NaOH é um irritante para os olhos / pele como um sólido e corrosivo em solução. Manuseie um exaustor químico usando luvas, jaleco e óculos de proteção</td></tr><tr><td>Espermidina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S2626</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio de luz invertida padrão</td><td>Leica</td><td>11526213</td><td></td></tr><tr><td>Materiais de gel de agarose de laboratório padrão</td><td>Varia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Materiais de laboratório padrão, como pipetas sorológicas e pontas de pipeta</td><td>Varia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase</td><td>Novo Inglaterra Biolabs</td><td>M0202S</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA Polimerase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0203S</td><td></td></tr><tr><td>T4 PNK</td><td>New England Biolabs</td><td>M0201S</td><td></td></tr><tr><td>Vórtice de mesa</td><td>Fisher Scientific</td><td>2215414</td><td></td></tr><tr><td>Taq DNA Polimerase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0273S</td><td></td></tr><tr><td>Thermomixer</td><td>Eppendorf</td><td>5384000020</td><td>Alternativamente, pode usar um banho-maria</td></tr><tr><td>Base Tris</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-5</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>9002-93-1</td><td>Triton X-100 é perigoso; use um jaleco, luvas e óculos de proteção ao manusear</td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT25052</td><td></td></tr><tr><td>Tube rotator</td><td>VWR</td><td>10136084</td><td></td></tr><tr><td>USER enzima</td><td>New England Biolabs</td><td>M5505S</td><td></td></tr></tbody></table>

localização de fator unicelular em chromatina usando decote de entrada ultra-baixa sob alvos e liberação usando nuclease

Single-Cell Factor Localization on Chromatin using Ultra-Low Input Cleavage Under Targets and Release using Nuclease

Determinar os locais de vinculação de uma proteína na cromatina é essencial para entender sua função e potenciais metas regulatórias. A imunoprecipitação de cromatina (ChIP) tem sido o padrão-ouro para determinar a localização da proteína por mais de 30 anos e é definida pelo uso de um anticorpo para retirar a proteína de interesse da cromatina sônica ou enzimática digerida. Mais recentemente, as técnicas de amarração de anticorpos tornaram-se populares para avaliar a localização de proteínas na cromatina devido ao seu aumento da sensibilidade. Cleavage Sob Alvos & Liberação Sob Nuclease (CUT&RUN) é o derivado em todo o genoma do Chromatin Immunocleavage (ChIC) e utiliza proteína recombinante A amarrada à nuclease microcócica (pA-MNase) para identificar a região constante do IgG do anticorpo visando uma proteína de interesse, permitindo, portanto, o decote específico do DNA flanqueando a proteína de interesse. O CUT&RUN pode ser usado para traçar modificações de histona, fatores de transcrição e outras proteínas de ligação de cromatina, como fatores de remodelação nucleossomo. É importante ressaltar que o CUT&RUN pode ser usado para avaliar a localização de proteínas eucromáticas ou heterocromáticas e modificações de histona. Por essas razões, a CUT&RUN é um método poderoso para determinar os perfis de vinculação de uma ampla gama de proteínas. Recentemente, a CUT&RUN foi otimizada para o perfil do fator de transcrição em baixas populações de células e células únicas e o protocolo otimizado tem sido chamado de cut&RUN de entrada ultra-baixa (uliCUT&RUN). Aqui, um protocolo detalhado é apresentado para o perfil de fator unicelular usando uliCUT&RUN em um formato manual de 96 poços.

Aqui, um protocolo detalhado é apresentado para perfil de proteína unicelular em cromatina usando um formato manual de 96 poços uliCUT&amp;RUN. Embora os resultados variem com base na proteína que está sendo perfilada (devido à abundância de proteínas e qualidade de anticorpos), tipo celular e outros fatores contribuintes, os resultados antecipados para esta técnica são discutidos aqui. A qualidade celular (aparência celular e por cento das células viáveis) e a classificação unicelular devem ser avaliadas antes ou no mom...

CUT&RUN e suas variantes podem ser usadas para determinar a ocupação de proteínas na cromatina. Este protocolo descreve como determinar a localização da proteína na cromatina usando uliCUT&RUN unicelular.

Localização de fator unicelular em Chromatina usando decote de entrada ultra-baixa sob alvos e liberação usando nuclease

Determining the binding locations of a protein on chromatin is essential for understanding its function and potential regulatory targets. Chromatin ...

CUT&RUN é uma técnica poderosa para determinar a localização de proteínas na cromatina, e aqui descrevemos uma versão unicelular desta técnica em um formato manual de 96 poços. A maioria das técnicas de localização de proteínas, como o ChIP-seq, requerem alta entrada celular e levam aproximadamente três dias para serem concluídas. A CUT&RUN, devido ao alto sinal e baixo fundo, foi otimizada para aplicação de células baixas e unicelulares, e pode ser concluída em um único dia.Prevemos que essa técnica pode ser aplicada a quase qualquer amostra biológica e pode ser especialmente poderosa para determinar a localização de fatores em amostras raras e de baixa abundância, como amostras preciosas de pacientes. Antes de realizar qualquer experimento unicelular, teste o anticorpo e a técnica em um alto número de células não preciosas. A principal limitação deste experimento é a dependência de um anticorpo robusto.Demonstrando o procedimento está Santana Lardo, especialista em pesquisa experiente do meu laboratório. Depois de classificar células únicas e núcleos de ligação para contas, coloque a placa de 96 poços em um rack magnético de 96 poços e permita que as contas se liguem por um mínimo de cinco minutos. Em seguida, remova e descarte o supernatante.Adicione 100 microliters de tampão de bloqueio às contas ligadas ao núcleo, misture com tubos suaves e incubar por cinco minutos à temperatura ambiente. Coloque a placa em um rack magnético de 96 poços e deixe o supernatante limpar por um mínimo de cinco minutos. Em seguida, remova e descarte o sobrenante sem perturbar as contas.Remova a placa do rack magnético e resuspenja as contas em 100 microliters de tampão de lavagem por reação com tubulação suave. Coloque a placa de volta no rack magnético de 96 poços, deixe o supernatante limpar e, em seguida, remova e descarte o supernatante. Resuspenja as contas em 25 microliters de tampão de lavagem por reação com tubulação suave.Faça uma mistura principal de mestre de anticorpos aliquoting 25 microliters de tampão de lavagem por reação e, em seguida, adicione 0,5 microliters de anticorpos por reação. Adicione 25,5 microliters da mistura de tampão de lavagem de anticorpos, seguido de tubulação suave a cada amostra que está sendo tratada com um anticorpo visando a proteína de interesse. Incubar por uma hora em temperatura ambiente.Em seguida, novamente coloque as amostras de volta no rack magnético de 96 poços. Uma vez que o supernante esteja claro, remova e descarte-o sem perturbar as contas. Depois de remover a placa do rack magnético, lave as contas com 100 microliters de tampão de lavagem e resuspend por pipetação.Depois de colocar a placa de volta em um rack magnético de 96 poços e descartar supernadante como demonstrado anteriormente, resuspenque cada amostra em 25 microliters de tampão de lavagem. Faça uma mistura mestre de proteína A MNase adicionando 25 microliters de tampão de lavagem e uma quantidade otimizada de proteína A MNase por reação. Adicione 25 microliters de proteína A MNase mistura mestre a cada amostra, incluindo as amostras de controle.Incubar as amostras por 30 minutos em temperatura ambiente. Coloque a placa em um rack magnético de 96 poços. Deixe o supernatante limpar por um mínimo de cinco minutos e, em seguida, remover e descartar o supernatante sem perturbar as contas.Depois de remover a placa do rack magnético, lave as contas com 100 microliters de tampão de lavagem e resuspend por tubulação suave. Coloque a placa em um rack magnético de 96 poços e descarte o supernatante como demonstrado anteriormente. Em seguida, remova as amostras do rack magnético e resuspenja as contas em 50 microliters de tampão de lavagem por tubulação suave.Equilibre as amostras a zero graus Celsius em uma mistura de água gelada por cinco minutos e, em seguida, remova as amostras do banho de água gelada. Adicione um microliter de 100 mililitros de cálcio usando uma pipeta multicanal. Misture bem três a cinco vezes com pipetagem suave usando uma pipeta multicanal de grande volume e, em seguida, devolva as amostras a zero graus Celsius.Inicie um temporizador de 10 minutos assim que a placa voltar ao banho de água gelada. Pare a reação pipetando 50 microliters de uma solução contendo o dobro da concentração de RSTOP+e tampão em cada poço na mesma ordem que o cloreto de cálcio foi adicionado. Incubar as amostras por 20 minutos a 37 graus Celsius.Gire a placa a 16.000 vezes G por cinco minutos a quatro graus Celsius. Coloque a placa em um rack magnético de 96 poços. Deixe o supernatante limpar por um mínimo de cinco minutos.Em seguida, transfira supernantes para uma placa fresca de 96 poços e descarte as contas. Para extração de DNA, adicione um microliter de 10% SDS e 0,83 microlitres de 20 miligramas por mililitro proteinase K a cada amostra e misture as amostras por pipetação suave. Incubar as amostras por 10 minutos a 70 graus Celsius.Volte a placa à temperatura ambiente. Adicione 46,6 microliters de cloreto de sódio de cinco molares e 90 microlitres de 50%PEG4000 e misture por tubulação suave. Adicione 33 microliters de contas de magnetita de poliestireno a cada amostra e incubar por 10 minutos à temperatura ambiente.Coloque a placa em um rack magnético e deixe o supernatante limpar por cerca de cinco minutos. Então, descarte cuidadosamente o supernatante sem perturbar as contas. Enxágüe duas vezes com 150 microliters de 80% de etanol sem perturbar as contas.Gire a placa brevemente a 1000 vezes G por 30 segundos. Coloque a placa de volta em um rack magnético de 96 poços e remova todo o etanol residual sem perturbar as contas. A seco as amostras por cerca de dois a cinco minutos.Resuspenque as contas em 37,5 microlitres de 10 mililitros TRIS de pH 8 e incubar por cinco minutos à temperatura ambiente. Coloque a placa de volta em um rack magnético e deixe as contas se amarrarem por cinco minutos. Transfira 36,5 microliters do supernante para uma placa de 96 poços compatível com termociclismo fresco e descarte as contas.Após a realização da avaliação da qualidade celular, a aparência celular e a porcentagem foram examinadas, demonstrando que células-tronco embrionárias de baixa qualidade não devem ser utilizadas. A classificação unicelular foi realizada usando a mancha hoechst 33342, e as células de teste foram contadas para garantir que zero ou uma célula seja encontrada em cada poço. A análise do gel de Agarose revelou uma escada de baixo peso molecular e bibliotecas individuais de uliCUT&RUN de células únicas.Análises de bibliotecas subótias e ideais mostram uma escada de baixo peso molecular, biblioteca subótima devido à digestão de Mnase ineficiente e biblioteca bem sucedida com digestão adequada. A distribuição do analisador de fragmentos mostra que o tamanho esperado de células únicas varia de 150 a 500 pares de base. No entanto, em grandes proteínas, o DNA terá cerca de 270 pares de bases.A ocupação proteica usando o navegador de genoma de locus único representando o alto número de células ou controle negativo e o CTCF uliCUT&RUN de célula única revelou que uma única célula representava picos fortes, semelhantes aos uliCUT&RUN de células altas. Mapas de calor de CTCF de célula única ou controle negativo revelaram um padrão claro de enriquecimento de leitura diretamente sobre locais de ligação CTCF estabelecidos nas células. Mapas de calor unidimensionais mostram uma maior densidade de leitura sobre locais de ligação CTCF estabelecidos em bibliotecas unicelulares em relação às regiões circundantes e controles sem anticorpos, demonstrando enriquecimento específico de anticorpos em locais de ligação estabelecidos.Equilibrar os núcleos ligados a contas no banho de água gelada e não superaquecer a amostra após a adição de cloreto de cálcio é importante para evitar a digestão excessiva da cromatina.

single-cell-factor-localization-on-chromatin-using-ultra-low-input

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Nós descrevemos a clivagem endógena da cromatina, juntamente com a sequenciação de alto rendimento (ChEC-seq), um método ortogonal de imunoprecipitação com cromatina (ChIP) para mapear os locais de ligação de proteínas genômicas com proteínas de fusão de nucleases microcócicas (MNase).

Mapeamento genômico de interações proteína-DNA com ChEC-seq em<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Este protocolo descreve a utilização combinatória de ChIP-seq, seq-4sU, RNA total-seq e Ribossoma profiling para linhas de células e as células primárias. Permite rastreamento de alterações em fator de transcrição vinculativas, novo de transcrição, processamento de RNA, volume de negócios e tradução ao longo do tempo e exibindo o curso geral dos acontecimentos nas células ativadas e/ou rápida mudança.

Análise em tempo real do fator de transcrição, ligação, transcrição, tradução e volume de negócios para exibir eventos globais durante a ativação celular

A identificação das interações físicas entre genes e dos elementos reguladores é um desafio, mas tem sido facilitada pelos métodos de captura de conformação de cromossomo. Esta modificação no protocolo de 4C-seq atenua o viés PCR, minimizando a amplificação excessiva de modelos PCR e maximiza o mappability de leituras, incorporando um passo de digerir adição da enzima de restrição.

Identificação do elevado-throughput de sequências de genes regulatórios utilizando a próxima geração sequenciamento de conformação Circular cromossoma capturar (4C-seq)

Um método altamente paralelo para medir o decote específico do DNA no nível da molécula única é descrito. Este protocolo demonstra a técnica utilizando a restrição endonuclease NdeI. O método pode ser facilmente modificado para estudar qualquer processo que resulte em decote de DNA específico do local.

Ensaio cinético de molécula única de alta produtividade paralela para decote de DNA específico do local

O decote sob metas e tagmentação (CUT&amp;Tag) é uma estratégia eficiente de perfil epigenômico de cromatina eficiente. Este protocolo apresenta uma estratégia refinada da CUT&amp;Tag para o perfil das modificações de histonas nas plantas.

Perfil da modificação H3K4me3 em plantas usando decote sob alvos e tagmentação

O Hi-C 3.0 é um protocolo Hi-C aprimorado que combina reticulantes de formaldeído e glutarato de disuccinimidil com um coquetel de enzimas de restrição DpnII e DdeI para aumentar a relação sinal-ruído e a resolução da detecção da interação cromatina.

Capturando a Conformação Cromossômica Através de Escalas de Comprimento

Um protocolo para mapeamento da organização tridimensional do genoma com resolução de nucleossomos usando o método de captura de conformação cromossômica Micro-C-XL é apresentado aqui.

Mapeando interações do genoma 3D de mamíferos com Micro-C-XL

Apresenta-se aqui um eficiente protocolo para o isolamento de células satélites de músculo de membros de camundongos (FACS) adaptado ao estudo da regulação da transcrição em fibras musculares por clivagem sob alvos e liberação utilizando nuclease (CUT&amp;RUN).

Um Protocolo Eficiente para Análise CUT&amp;RUN de Células Satélites de Camundongos Isoladas por FACS

A expressão gênica é regulada por interações de promotores gênicos com elementos regulatórios distais. Aqui, descrevemos como a baixa entrada de Capture Hi-C (liCHi-C) permite a identificação dessas interações em tipos celulares raros, que antes eram imensuráveis.

Um fluxo de trabalho integrado para estudar a arquitetura do genoma espaço-temporal centrada no promotor em populações celulares escassas

Este protocolo orienta os iniciantes em bioinformática através de um pipeline introdutório de análise CUT&amp;RUN que permite aos usuários concluir uma análise inicial e validação dos dados de sequenciamento CUT&amp;RUN. A conclusão das etapas de análise descritas aqui, combinadas com a anotação de pico a jusante, permitirá que os usuários obtenham insights mecanicistas sobre a regulação da cromatina.

Análise Introdutória e Validação de Dados de Sequenciação CUT&#38;RUN

Um protocolo otimizado de Clivagem Sob Alvos e Liberação Usando Nuclease seguida de sequenciamento de próxima geração (CUT&amp;RUN-seq) é descrito para linhas celulares de câncer de pulmão de pequenas células neuroendócrinas. Ele permite o mapeamento genômico de várias modificações de histonas e locais de ligação do fator de transcrição (por exemplo, E2F7) para investigar a desregulação epigenética e transcricional na patobiologia do SCLC.

Mapeamento genômico amplo de modificações histonas e sítios de ligação de fatores de transcrição em linhas celulares neuroendócrinas de câncer de pulmão de pequenas células usando CUT&amp;RUN

Aprenda a técnica CUT&RUN para localização de proteínas na cromatina em nível unicelular usando formato manual de 96 poços. Este método de baixa entrada celular permite análise de amostras raras e preciosas em um único dia.

Localização de fator unicelular em Chromatina usando decote de entrada ultra-baixa sob alvos e liberação usando nuclease

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