Name: Bioreator guiado por imagem para geração de tecido das vias aéreas bioengenharia (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-06T13:50:00.000+00:00
Duration: 11 min 1 s
Description: Aprenda a construir um biorreator com imagem guiada para remoção seletiva do epitélio endógeno da traqueia de rato e distribuição homogênea de células exógenas. Este método permite visualização microscópica direta e cultura in vitro de longo prazo para engenharia de tecidos das vias aéreas.

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Esta pesquisa foi apoiada em parte pelo American Toacic Society Foundation Research Program, pela New Jersey Health Foundation e pela National Science Foundation (CAREER Award 2143620) para J.K.; e os Institutos Nacionais de Saúde (P41 EB027062) para G.V.N.

O protocolo de tecido animal abaixo foi aprovado pela diretriz de bem-estar animal e regulamentos do Comitê de Uso e Cuidado animal (IACUC) do Instituto de Tecnologia Stevens, e cumpre as diretrizes dos Institutos Nacionais de Saúde (NIH) para o uso de animais experimentais.
1. Projeto e construção de bioreator de traqueia de rato guiado por imagem
<ol><li>Projeto e fabricação de bioreator de traqueia de rato<ol>
<li>Crie um modelo de projeto (CAD) auxiliado por computador da câmara bioreatorial com design relevante, como entradas, tomadas e câmara de cultura de tecidos, usando software gerador CAD. Para este estudo, utilize a geometria e as dimensões apresentadas na Figura 1A-C. O tutorial do software do gerador CAD pode ser encontrado em16,17.</li>
		<li>Exporte o modelo CAD gerado para um software controlador de controle numérico de computador (CNC) e corte o plástico politetrafluoroetileno (PTFE) usando uma máquina CNC para criar a câmara bioreatorial. O tutorial do software controlador CNC pode ser encontrado em18. NOTA: Além do PTFE, outros materiais plásticos, como polietileno de peso molecular ultra-alto (UHMWPE) e polieterimida podem ser usados para fabricar a câmara de cultura.</li>
		<li>Esterilize todos os componentes bioreatores, como adaptadores e parafusos Luer, para evitar a contaminação dos tecidos e células cultivadas no dispositivo. Monte todos os componentes bioreatores para a câmara principal de cultura tecidual em um ambiente limpo (Figura 1A).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Construção de dispositivo de imagem baseado em lentes baseada em índice de gradiente (GRIN)<ol>
<li>Para criar o dispositivo de imagem in situ , insira uma lente de tubo em um tubo de lente empilhável e fixe-a usando um anel de retenção. Monte o conjunto do tubo de lente em uma câmera CMOS científica através de um adaptador de montagem C.</li>
		<li>Use software, como o Micro-Manager, para operar a câmera e adquirir fotos e vídeos. Aime um objeto localizado a uma longa distância (por exemplo, 10 m da câmera) e ajuste a distância entre a lente do tubo e o sensor de imagem da câmera até que uma imagem focada do objeto seja formada na tela do computador pelo software de imagem que está sendo usado.</li>
		<li>Monte uma lente de filtro em um espelho dirímico de dupla resolução de super resolução e um laser para o dispositivo usando componentes do sistema de gaiola óptica, incluindo haste de montagem, placa de gaiola roscada e cubo de gaiola.</li>
		<li>Conecte a lente objetiva (20x) ao dispositivo. Monte uma lente GRIN (diâmetro = 500 μm) na extremidade distal do tubo da lente através do tradutor XY. Ajuste a distância entre a lente GRIN e a lente objetiva para formar imagens microscópicas focadas (Figura 2A,B).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Isolamento da traqueia de rato
<ol><li>Higienize a área cirúrgica e esterilize os instrumentos cirúrgicos utilizando uma autoclave a 121 °C por 30 minutos antes da cirurgia.</li>
	<li>Coloque um rato na câmara de indução e entregue 2,5% de isoflurane por 15 minutos usando um pequeno vaporizador para anestesiar o animal. Avalie a profundidade da anestesia pelo reflexo do pedal. Para isso, belisque firmemente o dedo do pé e confirme que o animal não responde ao aperto do dedo do pé.</li>
	<li>Após a anestesia, remova o isoflurane da câmara e administre 1 mL de heparina de 1.000 unidades/mL através da veia traseira lateral para evitar a coagulação sanguínea na vasculatura pulmonar.</li>
	<li>Para eutanásia do animal, exponha o animal a 5% de isoflurano por mais 15-20 min. Retire o animal da câmara de indução e coloque-o na placa cirúrgica em uma posição supina face-up.</li>
	<li>Fixar o rato na placa cirúrgica imobilizando as pernas e a cauda usando fita adesiva. Em seguida, esterilize as regiões do pescoço e do peito do rato usando 70% de álcool isopropílico (IPA). Abra a cavidade abdominal fazendo uma incisão de 3-4 cm usando uma tesoura na pele. NOTA: Tenha cuidado para não cortar profundamente a pele apontando as pontas da tesoura para cima.</li>
	<li>Transecte a veia cava inferior (IVC) usando a tesoura e confirme a eutanásia por exsanguinação.</li>
	<li>Realize a traqueotomia fazendo uma incisão usando uma tesoura na linha média do pescoço e expondo a traqueia. Realize a toracotomia média fazendo uma incisão na parede do peito e cortando entre as costelas para alcançar a extremidade da traqueia conectada ao pulmão. Em seguida, use um bíceps e uma tesoura para cortar as duas extremidades da traqueia e isolar a traqueia.</li>
	<li>Após o isolamento, enxágue a traqueia usando 20 mL de soro fisiológico tamponado de fosfato de 1x (1x PBS). Transfira a traqueia para o bioreator usando bíceps esterilizados. Fixar as duas extremidades da traqueia no conector Luer usando uma rosca de sutura 4-0.</li>
	<li>Entregue 5 mL de cultura média à câmara bioreatorial utilizando a bomba de seringa programável através da tubulação conectada à câmara bioreatorial a uma vazão de 5 mL/min. NOTA: O meio de cultura é composto pelo meio modificado da Águia (DMEM) modificado de Dulbecco, fgf-básico humano recombinante (0,1 ng/mL), soro bovino fetal (FBS, 10%) e antibiótico-antimícotico (1%).</li>
	<li>Feche bem a tampa do bioreator com a tampa de plástico acrílico e parafusos. Feche as conexões de tubos de câmara bioreatorial com os plugues Luer masculino/feminino para evitar o fluxo do meio de cultura na tubulação.</li>
</ol>3. Remoção guiada por imagem do epitélio traqueia
<ol><li>Para visualizar o lúmen traqueia em campo brilhante ou fluorescente, coloque o bioreator no estágio de imagem (Figura 3A).</li>
	<li>Prepare a solução de ér de carboxyfluorescein succinimidyl (CFSE) (concentração: 100 μM) no kit de rotulagem celular CFSE diluindo a solução CFSE com 1x PBS. NOTA: A concentração da solução CFSE original é de 10 mM (em sulfóxido de dimetil (DMSO).</li>
	<li>Infundir 500 μL da solução CFSE através da traqueia através da bomba de seringa através da tubulação conectada à cânula da traqueia a uma vazão de 5 mL/min. Pare a bomba quando a solução CFSE encher a traqueia. Aguarde 10 min, e depois lave o lúmen traqueia por infusão de 10 mL de 1x PBS usando a bomba de seringa para remover o reagente CFSE não incorporado residual.</li>
	<li>Insira a extremidade de imagem distal da lente GRIN na traqueia através do conector Luer preso a uma extremidade da traqueia. Em seguida, mova suavemente a lente GRIN dentro da traqueia até que a superfície da traqueia esteja focada e tire fotos e vídeos em campo brilhante ou fluorescência em ampliação de 20x.</li>
	<li>Para capturar imagens de campo brilhante no software Micro-Manager, siga os passos abaixo.<ol>
<li>Introduza a luz branca através do cubo da gaiola para iluminar o lúmen traqueia. Clique no ícone Live para mostrar a superfície luminal da traqueia em tempo real. Use a configuração de imagem > Exposição (ms) para alterar o tempo de exposição ao valor desejado. Neste estudo, o tempo de exposição utilizado foi na faixa de 10 ms e 50 ms.</li>
		<li>Para ajustar o contraste e o brilho das imagens, use a janela de dimensionamento histograma e intensidade para mover setas pretas e brancas no ponto final do display de histograma interativo. Alternativamente, use a opção Auto Stretch que permite ao software ajustar o brilho e o contraste automaticamente para níveis ideais.</li>
		<li>Clique no ícone 'Encaixar ' para congelar a imagem. Em seguida, use Configuração > Exportar Imagens como Deslocadas para salvar as imagens no formato desejado. Alternativamente, use Configuração > ImageJ para exportar diretamente a imagem para o software ImageJ e salvá-la.</li>
	</ol></li>
	<li>Para obter fotos e vídeos no modo fluorescente, ilumine o lumen da traqueia com luz laser específica cfse (CFSE: comprimento de onda de excitação: 488 nm, comprimento de onda de emissão: 515 nm) através do cubo da gaiola. Siga os passos 3.5.2-3.5.3 para adquirir as imagens. Depois de tirar fotos e vídeos, remova suavemente a lente GRIN da traqueia.</li>
	<li>Realize a desetelialização conforme descrito abaixo.<ol>
<li>Prepare 2% de sulfato de dodecyl de sódio (SDS) solução de descelularização em água destilada (DI). Incutir 50 μL de SDS através da traqueia a uma vazão de 6,3 mL/min, usando a bomba de seringa através da cânula da traqueia para gerar um filme fino da solução detergente no lúmen traqueia.</li>
		<li>Feche as conexões de tubo do bioreator usando plugues Luer masculino/feminino e transfira o bioreator para uma incubadora. Deixe o SDS habitar dentro da traqueia por 10 min a 37 °C. Incutir mais 50 μL de solução SDS através da traqueia e incubar por 10 min.</li>
		<li>Remova o epitélio e o SDS irrigando o lúmen traquea com 500 μL de 1x PBS via bomba de seringa a uma vazão de 10 mL/min por 3x. Coloque o bioreator em um agitador e vibre mecanicamente o bioreator a 20 Hz de frequência e amplitude de deslocamento de aproximadamente 0,3 mm para promover fisicamente o descolamento das células epiteliais tratadas com SDS do lúmen traqueia. NOTA: Neste estudo, o shaker foi feito sob medida pela montagem de um alto-falante subwoofer, um amplificador de placa de subwoofer e um acelerômetro. Uma forma de onda sinusoidal foi gerada por um computador e alimentada no agitador através do amplificador, enquanto a resposta do agitador foi monitorada através do acelerômetro (Figura 3B). Além disso, shakers convencionais, como shakers eletromagnéticos e inércias, podem ser usados para promover o descolamento das células. Para isso, defina a frequência e aceleração do agitador para 20 Hz e 0,5 g, respectivamente (equivalente a amplitude de deslocamento de 0,3 mm).</li>
		<li>Incutir 500 μL de 1x PBS duas vezes através do lúmen traqueia para remover SDS residuais e detritos celulares enquanto a traqueia é mecanicamente vibrada. Seguindo o procedimento de remoção do epitélio, avalie a liberação da camada epitelial medindo a intensidade do CFSE utilizando o dispositivo de imagem da lente GRIN como na etapa 3.6 (Figura 3C).</li>
	</ol></li>
</ol>4. Preparação do tecido traqueia para novas análises
<ol><li>Para confirmar a remoção do epitélio, realize novas análises teciduais, como a coloração de hematoxilina e eosina (H&E), tricromo, pentachrome e imunostaining. Para isso, remova a traqueia do bioreator e fixe-a em 30 mL de solução de paraformaldeído tamponado de 4% em 1x PBS (pH = 7,4) a 4 °C durante a noite.</li>
	<li>Desidrate e incorpore o tecido fixo da traqueia seguindo os passos abaixo.<ol>
<li>Após a fixação, lave o tecido traqueia com 10 mL de 1x PBS, transfira a traqueia para 30 mL de 70% de álcool e mantenha-a a 4 °C durante a noite. Corte a traqueia em pequenas seções cilíndricas (~5 mm) usando uma lâmina afiada e insira as seções teciduais no tecido incorporando fitas (comprimento x largura x altura: 4 cm x 2,5 cm x 0,5 cm). Mantenha duas seções de traqueia em cada.</li>
		<li>Desidratar as seções em uma série de soluções de álcool isopropílico (IPA) - 85%, 90%, 95%, 100% - por 1 h em 30 mL de cada solução. Remova a solução anterior antes de adicionar a próxima solução.</li>
		<li>Após a conclusão, submergir as fitas em 30 mL de agente de compensação (por exemplo, xileno) por 2h para deslocar a solução IPA das seções teciduais completamente. Realize esta etapa em um capô de fumaça com ventilação adequada.</li>
		<li>Submerque as fitas em parafina por 2h, e depois incorpore-as em parafina a 4 °C durante a noite. Em seguida, corte os tecidos embutidos na parafina em seções finas (5-8 μm) usando um dispositivo de microtome para h&E, tricromo, pentatro e imunostaining.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Para preparar os tecidos para a análise de microscopia eletrônica de varredura (SEM), fixe a traqueia em 30 mL de solução de glutaraldeído de 2,5% em 1x PBS (pH = 7,4) a 4 °C durante a noite. Em seguida, desidrate o tecido de traqueia fixa para SEM seguindo as etapas abaixo.<ol>
<li>Após a fixação, enxágue o tecido traqueia com 10 mL de 1x PBS. Corte o tecido traqueia longitudinalmente em pequenas seções de semi-cilindro (comprimento: ~5 mm) usando uma tesoura e insira as seções teciduais nas fitas.</li>
		<li>Desidratar as seções em uma série de soluções de IPA - 35%, 50%, 70%, 85%, 95% e 100% - por 10 min em 30 mL de cada solução. Remova a solução anterior antes de adicionar a próxima solução.</li>
		<li>Realizar o método de secagem baseado em hexaametila (HMDS) submergindo os tecidos nas seguintes soluções: 100% IPA: HMDS (2:1; v/v) por 10 min, seguido por 100% IPA: HMDS (1:2; v/v) por 10 min, e finalmente 100% HMDS para durante a noite. NOTA: O HMDS é tóxico. Trabalhe sob um capô de fumaça durante todos os passos de secagem.</li>
		<li>Remova os tecidos da solução HMDS e deixe-os secar sob a capa de fumaça por 1h. Monte a seção em pinos de alumínio usando uma fita condutora de carbono de dois lados ou pasta condutora de prata para imagens SEM.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Distribuição homogênea de células exógenas no lúmen traqueal desnudado
<ol><li>Prepare uma traqueia de rato desetelializada usando o protocolo na etapa 3. Descongele células-tronco mesenquimais congeladas (MSCs) para 30 s em um banho de água de 37 °C. NOTA: Neste estudo, usamos células-tronco mesenquimais (MSCs) como célula modelo para mostrar a distribuição de células exógenas na traqueia des epitelializada. Idealmente, células epiteliais das vias aéreas primárias, células basais ou células pluripotentes induzidas (iPSCs) podem ser usadas para fins de regeneração de epitélio.</li>
	<li>Conte as células com um hemótmetro e prepare uma solução celular com uma concentração de 5 x 106 células/mL. Rotule as células fluorescente incubando as células com 2 mL de solução CFSE (concentração: 100 μM) à temperatura ambiente por 15 minutos. Enxágüe as células com 5 mL de 1x PBS por 3x e resuspenque as células em meio de cultura fresca em uma concentração final de 3 x 107 células/mL.</li>
	<li>Prepare a solução de pré-gel de hidrogel como um veículo para entrega de células. Para este estudo, use o colágeno I como veículo de entrega para células MSCs e siga as instruções do fabricante para preparar o pré-gel. Por exemplo, para obter 3,6 mg/mL de pré-gel de colágeno, misture uma parte da solução de neutralização resfriada com nove partes do colágeno da cauda de rato em um tubo estéril de 1,5 mL. Em seguida, encobre suavemente a mistura para cima e para baixo para uma mistura adequada. NOTA: Outros hidrogéis biocompatíveis podem ser usados em vez de colágeno I de acordo com o estudo e as necessidades do usuário.</li>
	<li>Uma vez que a solução de hidrogel esteja preparada, adicione as células rapidamente à solução com concentração desejada (por exemplo, 5 x 106 células/mL). Para obter uma mistura uniforme de hidrogel celular, misture as células e a solução de gel, tubos suavemente com uma micropipette.</li>
	<li>Conecte uma extremidade da traqueia dentro do bioreator a uma bomba de seringa programável através de um conector Luer. Entregue 5 mL de cultura fresca a 37 °C na câmara bioreatorial para cobrir a superfície externa da traqueia usando a bomba de seringa a uma taxa de fluxo de 5 mL/min.</li>
	<li>Administre um bolus de 10 μL da mistura de hidrogel celular na traqueia desetelializada dentro do bioreator usando a bomba de seringa a uma vazão de 5 mL/min para gerar uma camada de hidrogel celular no lúmen traqueia (Figura 4).</li>
	<li>Após a injeção celular, coloque o bioreator em uma incubadora de cultura celular estéril a 37 °C e 5% de CO2 para gelação. Para o colágeno I, a gelação ocorre em 30 minutos.</li>
	<li>Para visualizar a distribuição das células implantadas, esterilize a lente GRIN limpando com 70% de IPA ou etanol e coloque o bioreator no estágio de imagem. Tire fotos e vídeos nos modos de campo brilhante e fluorescente, conforme necessário.</li>
	<li>Após 30 minutos de semeadura celular, infunda 1 mL de meio de cultura no lúmen da traqueia usando uma bomba de seringa a uma taxa de fluxo de 1 mL/min.</li>
	<li>Cultura a traqueia semeada por células dentro do bioreator em uma incubadora a 37 °C para o tempo desejado. Para a cultura de longo prazo, refresque o meio cultural no lúmen traqueia e na câmara bioreator a cada 24 horas. Durante a cultura celular, mantenha a mídia dentro do lúmen estático e mude-a a cada 24 horas, enquanto a mídia fora da traqueia é continuamente perfundida através de um fluxo unidirecional a 5 mL/min.</li>
	<li>Após a cultura das células por um determinado período de tempo (por exemplo, 1 e 4 dias neste estudo), remova a traqueia do bioreator. Use a tesoura para cortar a traqueia longitudinalmente em duas seções semi-cilindros (ou seja, seções superiores e inferiores) nos dias 1 e 4 da cultura in vitro para expor as superfícies internas para monitorar o crescimento celular e calcular a densidade celular. Use um microscópio fluorescente convencional para visualizar as células nas superfícies internas.</li>
	<li>Para adquirir as imagens usando o software Micro-Manager, siga as etapas 3.5 e 3.6. Use um filtro de isothiocianato de fluoresceína (FITC) para visualizar as células rotuladas por CFSE no modo fluorescência. Analise as imagens tiradas pelo microscópio fluorescente e calcule as densidades celulares em seções superiores e inferiores usando o software ImageJ. Para calcular o número de células e a densidade celular, siga os passos abaixo.<ol>
<li>Abra uma imagem no software ImageJ e converta a imagem em uma imagem binária (16 bits) usando > de imagem Tipo > 16 bits. Defina a escala de imagem com a barra de escala usando Analisar > Escala definida.</li>
		<li>Ajuste o limiar da imagem para destacar as estruturas das células para contar. Use > de imagem Ajuste > limiar. Use Analisar > Analisar partículas para contar o número das células. Calcule a densidade das células dividindo o número de células pela área superficial da imagem.</li>
	</ol></li>
	<li>Para avaliar a viabilidade após a semeadura celular, use um kit de viabilidade celular. Para este estudo, incubar o tecido traqueia e as células do bioreator a 37 °C por 6h e manchar as células com 4 mM de calcein-AM e 2 mM de ethidium homodimer-1 em 1 mL de 1x PBS à temperatura ambiente por 15 min.</li>
	<li>Depois de enxaguar com 1x PBS, visualize as células usando um microscópio fluorescente. Conte as células vivas e mortas usando os passos descritos na etapa 5.12. Calcular a viabilidade celular como a porcentagem de células vivas (manchadas com calceíno-AM) por células totais (células vivas e mortas).</li>
</ol>

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</ol>

Os autores não declaram interesses financeiros concorrentes.

Neste trabalho, criamos um bioreator guiado por imagem que pode permitir (i) o monitoramento do lúmen traqueia in situ após a remoção celular e a entrega de células exógenas e (ii) cultura in vitro de longo prazo do tecido traqueia semeado por células. Usando este bioreator personalizado, demonstramos (i) remoção seletiva das células epiteliais endógenas do lúmen traqueia usando detergente e lavagem de vias aéreas assistidas por vibração e (ii) distribuição uniforme de células exógenas na superfície lum...

A superfície luminal do trato respiratório é forrada por uma camada de epitélio que consiste principalmente de células-tronco multi-ciliadas, club, cálice e basal 1,2. A camada epitelial serve como um mecanismo de defesa primária do pulmão, agindo como uma barreira biofísica que protege o tecido subjacente das vias aéreas contra patógenos inalados, partículas ou gases químicos. Protege o tecido das vias aéreas através de múltiplos mecanismos, incluindo formação de junção apertada intercelular, liberação mucociliaria e secreção antimicrobiana e antioxidante 3,4. O epitélio das vias aéreas defeituosas está associado a doenças respiratórias devastadoras, como doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC)5, diskinesia ciliar primária (PCD)6 e fibrose cística (CF)7.
Os avanços na tecnologia lung-on-chip (LOC) representam uma oportunidade para estudar o desenvolvimento pulmonar humano, modelar várias doenças pulmonares e desenvolver novos materiais terapêuticos em ambientes in vitro fortemente regulados. Por exemplo, o epitélio das vias aéreas e o endotélio podem ser cultivados em lados opostos de uma membrana fina e porosa para imitar o gás trocando tecido pulmonar, permitindo modelagem fiel de doenças e testes medicamentosos8. Da mesma forma, modelos de doenças in vitro foram criados para modelar doenças das vias aéreas in vitro, como DPOC9 e fibrose cística10. No entanto, um grande desafio dos dispositivos LOC é recapitular a complexa arquitetura tridimensional (3D) do tecido pulmonar e interações dinâmicas de matriz celular-tecido in vitro11.
Recentemente, foram desenvolvidas metodologias inovadoras de engenharia de tecidos que permitem a manipulação de tecidos pulmonares ex vivo 12. Utilizando essas metodologias, enxertos de tecido alergênico ou xenogênico desnudado podem ser preparados removendo as células endógenas do tecido pulmonar através de tratamentos químicos, físicos e mecânicos13. Além disso, a matriz extracelular de tecido nativo preservada (ECM) nos andaimes pulmonares descelularizados fornecem as pistas estruturais, bioquímicas e biomecânicas para as células implantadas anexarem, proliferarem e diferenciarem14,15.
Aqui, um sistema bioreator guiado por imagem criado pela combinação de tecnologias de engenharia de tecidos e LOC para permitir a manipulação in vitro de tecidos e cultura de tecidos traqueais de ratos explantados é relatado. Utilizando este bioreator de tecido das vias aéreas, o protocolo demonstra a remoção seletiva das células epiteliais endógenas sem interromper os componentes celulares e bioquímicos subjacentes do tecido das vias aéreas. Em seguida, mostramos a distribuição homogênea e a deposição instantânea das células exógenas recém-semeadas, como células-tronco mesenquimais (MSCs), no lúmen das vias aéreas desnudadas, instilando a solução de colágeno i pré-gel carregada por células. Além disso, utilizando o dispositivo de imagem micro-óptica integrado ao bioreator, a visualização do lúmen traqueia durante a remoção do epitélio e a entrega de células endógenas também é feita. Além disso, mostra-se que a traqueia e as células recém-implantadas podem ser cultivadas no bioreator sem morte celular perceptível e degradação tecidual por 4 dias. Prevemos que a plataforma bioreatorial habilitada para imagem, a fina técnica de desetelialização baseada em filmes e o método de entrega de células utilizado neste estudo podem ser úteis para a geração de tecidos das vias aéreas para modelagem de doenças in vitro e triagem de medicamentos.
O bioreator inclui uma câmara retangular conectada a uma bomba de seringa programável, bomba de perfusão e ventilador para cultivar traqueia de rato isolada. O bioreator apresenta entradas e tomadas conectadas à traqueia ou à câmara de cultura tecidual para fornecer separadamente reagentes (por exemplo, mídia cultural) aos espaços internos e externos da traqueia (Figura 1). Um sistema de imagem personalizado pode ser usado para visualizar o interior da traqueia de rato in vitro cultivada no nível celular (Figura 2). O epitélio endógeno da traqueia é removido através da instilação de uma solução de descelularização baseada em detergente, seguida pela lavagem das vias aéreas assistidas por vibração (Figura 3). A solução de hidrogel, como o colágeno tipo I, é usada como veículo de entrega para semear células exógenas uniformemente e instantaneamente através do lúmen traqueia desnudado (Figura 4). Todos os materiais utilizados para a construção do bioreator e a realização dos experimentos são fornecidos na Tabela de Materiais.

<table><tbody><tr><td>1 e vezes; PBS</td><td>Gibco, Thermo Fisher Scientific</td><td>10-010-031</td><td></td></tr><tr><td>Conector de 3 portas</td><td>World Precision Instruments</td><td>14048-20</td><td></td></tr><tr><td>Conector de 4 portas</td><td>World Precision Instruments</td><td>14047-10</td><td></td></tr><tr><td>Acelerômetro</td><td>STMicroelectronics</td><td>IIS3DWBTR</td><td></td></tr><tr><td>Gibão acromático</td><td>Thorlabs</td><td>AC254-150-A-ML</td><td></td></tr><tr><td>Alumínio ponta de pino</td><td>TED PELLA</td><td>16111</td><td></td></tr><tr><td>Antibiótico-antimicótico</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15240062</td><td></td></tr><tr><td>Haste de montagem</td><td>Thorlabs</td><td>ER1</td><td></td></tr><tr><td>Parafusos de cabeça de botão</td><td>McMaster-Carr</td><td>91255A274</td><td></td></tr><tr><td>Cubo de gaiola</td><td>Thorlabs</td><td>C4W</td><td></td></tr><tr><td>Fita condutora de dupla face de carbono</td><td>TED PELLA</td><td>16073</td><td></td></tr><tr><td>Kit de rotulagem CFSE</td><td>Abcam</td><td>ab113853</td><td></td></tr><tr><td>Citrisolv (agente de limpeza)</td> <td>Decon</td><td>1061</td><td></td></tr><tr><td>Adaptador de montagem C</td><td>Thorlabs</td><td>SM1A9</td><td></td></tr><tr><td>Colágeno I</td><td>Advanced BioMatrix</td><td>5153</td><td></td></tr><tr><td>Tinta condutora de prata líquida</td><td>TED PELLA</td><td>16034</td><td></td></tr><tr><td>Espelho dicróico</td><td>Semrock</td><td>DI03-R488</td><td>Comprimentos de onda do laser refletidos:&nbsp; 473.0 +- 2 nm 488.0 +3/-2 nm</td></tr><tr><td>Eagle modificado de Dulbecco' s medium</td><td>Gibco, Thermo Fisher Scientific</td><td>11965118</td><td></td></tr><tr><td>Adaptador de anteparo luer fêmea para mangueira</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-45501-30</td><td></td></tr><tr><td>Luer fêmea para barb de tubulação</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-45508-03</td><td></td></tr><tr><td>Conector luer fêmea para macho</td><td>Cole-Parmer</td><td>ZY-45508-80</td><td></td></tr><tr><td>Soro bovino fetal</td><td>Gibco, Thermo Fisher Scientific</td><td>10082147</td><td></td></tr><tr><td>Lente de filtro</td><td>Chroma Technology Corp</td><td>ET535/50m</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio fluorescente</td><td>Nikon</td><td>Eclipse E1000 - D</td><td></td></tr><tr><td>Fusion 360</td><td>Autodesk</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Porca sextavada</td><td>McMaster-Carr</td><td>91813A160</td><td></td></tr><tr><td>Hexametildisilazane (HMDS)</td><td>Fisher Scientifc</td><td>AC120585000</td><td></td></tr><tr><td>Fibra de imagem</td><td>SELFOC, NSG grupo</td><td>Lente</td><td></td>GRIN</tr><tr><td>Laser</td><td>Opto Engine</td><td>MDL-D-488-150mW</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de lente</td><td>Thorlabs</td><td>SM1L40</td><td></td></tr><tr><td>Kit de viabilidade/citotoxicidade LIVE/DEAD (Invitrogen)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>L3224</td><td></td></tr><tr><td>MACH 3 Software de controle CNC</td><td>Newfangled Solutions</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lente objetiva</td><td>Olympus</td><td>UCPLFLN20X</td><td></td></tr><tr><td>Bomba peristáltica</td><td>Cole Parmer</td><td>L/S sistema</td><td></td>de bomba digital padrão</tr><tr><td>Anel de retenção humano recombinante FGF-basic</td><td>PeproTech</td><td>100-18B</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Thorlabs</td><td>SM1RR</td><td></td></tr><tr><td>Câmera CMOS</td> científica <td>PCO Panda</td><td>PCO Panda 4.2</td><td></td></tr><tr><td>Dodecil sulfato de sódio</td><td>VWR</td><td>97064-472</td><td></td></tr><tr><td>Solidworks ( 2019)</td><td>Dassault Syst&egrave; mes</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubo de lente empilhável</td><td>Thorlabs</td><td>SM1L10</td><td></td></tr><tr><td>Amplificador de placa de subwoofer</td><td>Dayton Audio</td><td>SPA250DSP</td><td></td></tr><tr><td>Alto-falante subwoofer</td><td>Dayton Audio</td><td>RSS21OHO-4 Diâmetro do</td><td>diafragma: 21 cm</td></tr><tr><td>Bomba de seringa</td><td>World Precision Instruments</td><td>AL-4000</td><td></td></tr><tr><td>Placa de gaiola roscada</td><td>Thorlabs</td><td>CP33</td><td></td></tr><tr><td>Adaptador luer rosqueado</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-45513-81</td><td></td></tr><tr><td>Lente de tubo</td><td>Thorlabs</td><td>AC254-150-A-ML</td><td></td></tr><tr><td>Tubulação Tygon</td><td>Cole-Parmer</td><td>13-200-110</td><td></td></tr><tr><td>XY Tradutor</td><td>Thorlabs</td><td>CXY1</td><td></td></tr></tbody></table>

bioreator guiado por imagem para geração de tecido das vias aéreas bioengenharia

Imaging-Guided Bioreactor for Generating Bioengineered Airway Tissue

Lesões repetidas no tecido das vias aéreas podem prejudicar a função pulmonar e causar doenças pulmonares crônicas, como doença pulmonar obstrutiva crônica. Os avanços na medicina regenerativa e nas tecnologias bioreaatores oferecem oportunidades para produzir construções de tecidos e órgãos funcionais cultivados em laboratório que podem ser usados para triagem de drogas, doenças modelo e substituição de tecidos de engenheiros. Aqui, um bioreator miniaturizado aliado a uma modalidade de imagem que permite a visualização in situ do lúmen interno da traqueia de rato explantada durante a manipulação e cultura in vitro de tecidos. Utilizando este bioreator, o protocolo demonstra a remoção seletiva guiada por imagens de componentes celulares endógenos, preservando as características bioquímicas intrínsecas e a ultraestrutura da matriz tecidual das vias aéreas. Além disso, a entrega, distribuição uniforme e subsequente cultura prolongada de células exógenas nos lúmen descelularizados das vias aéreas com monitoramento óptico in situ são mostrados. Os resultados destacam que o bioreator guiado por imagem pode potencialmente ser usado para facilitar a geração de tecidos funcionais in vitro das vias aéreas.

A modalidade de imagem in situ baseada em lentes GRIN pode permitir a visualização do lúmen interno traqueal in situ (Figura 5A). Utilizando este método de imagem, podem ser obtidas imagens de campo brilhante e fluorescentes das traqueias nativas e deselegelializadas (Figura 5B,C). Não foi observado sinal fluorescente da traqueia nativa antes da rotulagem CFSE (Figura 5Bii). No entanto, quando o ep...

O protocolo descreve um bioreator habilitado para imagem que permite a remoção seletiva do epitélio endógeno da traqueia de rato e distribuição homogênea de células exógenas na superfície do lúmen, seguida pela cultura in vitro de longo prazo da construção do tecido celular.

Bioreator guiado por imagem para geração de tecido das vias aéreas bioengenharia

Repeated injury to airway tissue can impair lung function and cause chronic lung disease, such as chronic obstructive pulmonary disease. Advances in ...

Este protocolo permite o cultivo in vitro e a visualização microscópica direta dos tecidos isolados das vias aéreas durante diferentes procedimentos de manipulação tecidual, como deselitelite e regeneração tecidual das vias aéreas. A imagem in situ proposta neste estudo permite o monitoramento rápido e não destrutivo do lúmen traqueal durante a remoção controlada guiada por imagens do epitélio endógeno e a entrega das células exógenas. A plataforma bioreativa guiada por imagem e os protocolos de manipulação de tecidos podem ser usados para gerar tecido bioengenheiro das vias aéreas para modelagem de doenças e rastreamento de medicamentos.A construção e o uso do bioreator de tecido das vias aéreas habilitado para imagem serão demonstrados por dois estudantes de doutorado do nosso grupo de pesquisa, Mohammad Mir, e Jiawen Chen. Para começar a criar um dispositivo de imagem in situ, insira uma lente de tubo em um tubo de lente empilhável e fixe-a usando um anel de retenção. Em seguida, monte o conjunto da mesa da lente em uma câmera CMOS científica através de um adaptador de montagem C.Use o software Micromanager para operar a câmera e adquirir fotos e vídeos. Ao mirar em um objeto localizado a 10 metros da câmera, ajuste a distância entre a lente do tubo e o sensor de imagem da câmera até que uma imagem focalizada do objeto seja formada na tela do computador. Em seguida, use componentes do sistema de gaiola óptica, como haste de montagem, placa de gaiola roscada e cubo de gaiola para montar uma lente de filtro em um espelho de borda dupla, super resolução, retrodicromica e um laser para o dispositivo.Conecte uma lente objetiva de 20X ao dispositivo. Em seguida, monte uma lente verde com um diâmetro de 500 micrômetros na extremidade distal do tubo da lente através do tradutor X-Y. Ajuste a distância entre as lentes verdes e objetivas para formar as imagens microscópicas focadas.Para visualizar o lúmen de traqueia de rato isolado em campo brilhante ou fluorescente, coloque o bioreator no estágio de imagem. Em seguida, infundir 500 microliters da carboxyfluoresceina recém-preparada éster succinimidyl, ou solução CFSE, a uma taxa de fluxo de cinco mililitros por minuto através da traqueia através da bomba de seringa conectada ao tubo da cânula traqueia. Uma vez que a solução CFSE encha a traqueia, pare a bomba.Após 10 minutos, lave o lúmen de traqueia infundindo 10 mililitros de PBS usando a bomba de seringa para remover os reagentes CFSE não incorporados residuais. Após a lavagem, insira a extremidade de imagem distal da lente verde na traqueia através do conector luer ligado a uma extremidade da traqueia. Em seguida, mova suavemente a lente verde dentro da traqueia até que a superfície da traqueia esteja focada.Para capturar as imagens de campo brilhante no software de microgerente, ilumine o lúmen traqueia com luz branca através do cubo da gaiola. Em seguida, clique no ícone Live para mostrar a superfície lúmenal da traqueia em tempo real. Use a configuração de imagem e as guias Exposição para alterar o tempo de exposição ao valor desejado.Para ajustar o contraste e o brilho das imagens, use o histograma e a janela de escala de intensidade para mover setas pretas e brancas no ponto final do display de histograma interativo. Clique em Parar ao vivo para ativar o ícone 'Snap' e clique no ícone 'Snap' para congelar a imagem. Em seguida, use a configuração Exportar e então Imagens como guias deslocadas para salvar as imagens no formato desejado.Para obter fotos e vídeos em um modo fluorescente, ilumine o lúmen da traqueia com luz laser específica cfse através do cubo da gaiola e adquira as imagens em tempo real movendo a sonda de imagem para frente e para trás. Uma vez que as fotos e vídeos são obtidos, remova suavemente a lente verde da traqueia. Para a desepilação da traqueia, incutir 50 microlitradores do sulfato de dodecil de 2%de sódio recém-preparado através da cânula da traqueia para gerar um filme fino da solução detergente sobre o lúmen traqueia.Após a instilação, feche as conexões de tubo do bioreator usando plugues de luer masculino ou feminino e transfira o bioreator para uma incubadora de 37 graus Celsius por 10 minutos para permitir que o SDS habite dentro da traqueia. Repita a instilação uma vez. Após a segunda instilação, remova o epitélio e a SDS irrigando o lúmen traqueia três vezes com 500 microliters de PBS através de bomba de seringa a uma taxa de fluxo de 10 mililitros por minuto.Em seguida, coloque o bioreator em um agitador para vibrar mecanicamente em uma frequência de 20 Hertz e uma amplitude de deslocamento de 0,3 milímetros para promover fisicamente o descolamento das células epiteliais tratadas com SDS do lúmen traqueia. Enquanto a traqueia é mecanicamente vibrada, instila 500 microliters de PBS duas vezes através do lúmen traqueia para remover o SDS residual e detritos celulares. Após a remoção do epitélio, avalie a liberação da camada epitelial medindo a intensidade do CFSE usando o dispositivo de imagem da lente verde.Depois de preparar uma traqueia de rato des epitelializada, descongele células-tronco mesenquimais congeladas, ou MSCs, por 30 segundos em um banho de água de 37 graus Celsius. Em seguida, conte as células com um hemótmetro, seguido pela preparação de uma solução celular com uma concentração de cinco vezes 10 para as seis células por mililitro. Em seguida, rotule as células fluorescentes incubando-as com dois mililitros de solução CFSE de 100 micromolar a temperatura ambiente.Após 15 minutos, enxágue as células com cinco mililitros de PBS três vezes antes de resumá-las em um meio de cultura DMEM fresco em uma concentração final de três vezes 10 às sete células por mililitro. Imediatamente após a preparação do hidrogel de colágeno I, como descrito no manuscrito, adicione as células à solução de hidrogel com a concentração desejada. Em seguida, misture as células e a solução de gel com uma micropipette para obter uma mistura uniforme de hidrogel celular.Em seguida, conecte uma extremidade da traqueia dentro do bioreator a uma bomba de seringa programável através de um conector de luer e entregue cinco mililitros de meio de cultura fresca na câmara bioreaator a 37 graus Celsius para cobrir a superfície externa da traqueia. Em seguida, administre 10 microliters bolus da mistura célula-hidrogel na traqueia desetelializada dentro do bioreator para gerar uma camada de hidrogel celular no lúmen traqueia. Após a injeção celular, coloque o bioreator em uma incubadora de cultura celular estéril a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono para gelação por 30 minutos para permitir a gelagem.Para visualizar a distribuição de células implantadas, esterilize a lente verde com álcool ou etanol isopropílico de 70% e coloque o bioreator no estágio de imagem para obter as fotos e vídeos em modos de campo brilhante e fluorescente. Após 30 minutos de semeadura celular, infundir um mililitro de cultura no lúmen traqueia a uma taxa de fluxo de um mililitro por minuto. Finalmente, cultura a traqueia semeada por células dentro do bioreator em uma incubadora a 37 graus Celsius para o tempo desejado.Durante a cultura celular, mantenha a mídia dentro do lúmen estático, enquanto a mídia fora da traqueia é continuamente perfundida através de um fluxo unidirecional. Nas imagens de campo brilhante e fluorescentes da traqueia desetelializada, nenhum sinal fluorescente foi observado antes da rotulagem cfse. Com o CFSE, observou-se um sinal fluorescente uniforme em todo o epitélio.Após a desetelialização, a intensidade fluorescente foi diminuída significativamente, indicando ablação do epitélio. A hematoxilina e a coloração de eosina da traqueia desetelializada ilustraram a remoção do epitélio pseudoestestificado do lúmen da traqueia, e a preservação de células e matriz extracelular, ou micro-estruturas ECM, em camadas de tecido subjacente. Além disso, a coloração pentachrome e tricromática confirmou a manutenção da arquitetura de tecido traqueia e componentes ECM, como colágeno e proteoglycans.A imunofluorescência das células epiteliais e do colágeno revelei a remoção completa do epitélio e a preservação do colágeno I dentro do tecido sub-epitelial. Os micrografos eletrônicos de varredura indicaram que a traqueia nativa era povoada com células multilastadas e cálices. Na traqueia des epitelializada, a membrana do porão foi exposta, conforme indicado por uma rede de malha de fibras de matriz extracelular e a ausência de células epiteliais.As imagens de fluorescência da traqueia desetelializada, ao semear com PBS e colágeno, são mostradas aqui. Em comparação com as células semeadas via meio de cultura, as células fluorescentes fornecidas via hidrogel permaneceram aderidas de forma mais uniforme em todo o lúmen. O estudo de viabilidade celular demonstrou que a viabilidade não foi afetada pelo procedimento de entrega de células, e mais de 90% das células permaneceram viáveis.Criar uma película fina de detergente no processo de desepilação e usar hidrogel como veículo de entrega para células são passos essenciais para o sucesso deste protocolo. Nosso próximo objetivo de pesquisa é implantar as vias aéreas primárias cultivadas em laboratório ou células-tronco no tecido das vias aéreas des epitelializadas para investigar se o tecido funcional das vias aéreas pode ser preparado.

imaging-guided-bioreactor-for-generating-bioengineered-airway-tissue

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

Nosso grupo desenvolveu um sistema de cultura biorreator que imita as tensões pulsátil fisiológica do sistema cardiovascular para regenerar implantáveis ​​de pequeno diâmetro enxertos vasculares.

Engenharia Biológica Baseado em enxertos vasculares Usando um biorreator pulsátil

Nós desenvolvemos uma matriz extracelular e de pulmão decelularizado biorreator romance biomimético que pode ser usado para gerar tecido pulmonar funcional. Por semeadura de células na matriz e cultura no biorreator, geramos tecido que demonstra a troca gasosa eficaz quando transplantadas in vivo por curtos períodos de tempo.

Procedimento para a Engenharia de pulmão

A descelularização de órgãos inteiros produz andaimes biológicos naturais que podem ser usados para medicina regenerativa. A descrição de um modelo de regeneração pulmonar de primatas não humanos em que pulmões inteiros são descelularizados e depois semeados com células-tronco adultas e células endoteliais em um biorreator que facilita a circulação vascular e a ventilação em meio líquido é apresentada.

Descelularização e recelularização pulmonar de primatas não humanos usando um biorreator especializado de órgãos grandes

A recapitulação do microambiente órgão-específico, que estimula a angiogênese local, é indispensável para a regeneração bem-sucedida dos tecidos danificados. Este relatório demonstra um novo método para implantar géis de fibrina na superfície pulmonar de camundongos vivos, a fim de explorar como o microambiente específico do pulmão modula a angiogênese e a regeneração alveolar em camundongos adultos.

Implantação de fibrina Gel no tapete do pulmão para o Estudo de angiogênese Lung-specific

Os avanços nas tecnologias de biomateriais permitem o desenvolvimento de construções tridimensionais do tipo multicelular. Desenvolvemos protocolos de eletrofiação para produzir três andaimes individuais para cultivar as principais células estruturais das vias aéreas para fornecer um modelo 3D in vitro da parede bronquíola das vias aéreas.

Adaptação do Processo Electrospinning para fornecer três ambientes únicos para um Tri-camadas<em&gt; In Vitro</em&gt; Modelo da parede das vias aéreas

Estenose de enxerto representa um obstáculo crítico em substituição de engenharia de tecidos das vias respiratórias. Para investigar os mecanismos celulares subjacentes estenose, utilizamos um modelo murino de substituição traqueal de engenharia de tecidos com células mononucleares de medula semeado (BM-MNC). Aqui, nós detalhe nosso protocolo, incluindo a fabricação de andaime, BM-MNC isolamento, enxerto semeadura e implantação.

A propagação e a implantação de um enxerto traqueal biossintética engenharia de tecido em um modelo do rato

O objetivo deste protocolo é executar uma co-cultura dinâmica de macrófagos humanos e miofibroblasts em andaimes eletroscarados tubulares para investigar a regeneração de tecidos conduzidos por materiais, usando um bioreator que permite o desacoplamento do estresse da tesoura e do estiramento cíclico.

Um Bioreator multi-cue para avaliar a capacidade inflamatória e regenerativa de biomateriais sob fluxo e estiramento

Este protocolo descreve um método para gerar tecidos pulmonares projetíveis, de pequena escala, repovoando fatias pulmonares descelularizadas cortadas com células epiteliais tipo 2 alveolares, fibroblastos e células endoteliais.

Tecidos pulmonares projetados preparados a partir de fatias pulmonares descelularizadas

O presente protocolo descreve células pluripotentes pluripotentes induzidas por células-tronco derivadas do tipo 2 (iAT2s). Essas células podem ser cultivadas como esferas de auto-renovação na cultura 3D ou adaptadas à cultura de interface ar-líquido (ALI).

Gerando esferas 3D e culturas de interface ar-líquido 2D de células-tronco pluripotentes induzidas pelo homem

Os recentes avanços nos protocolos de diferenciação de células-tronco pluripotentes induzidos pelo homem permitem a derivação stepwise de tipos celulares específicos de órgãos. Aqui, fornecemos etapas detalhadas para a manutenção e expansão das células basais derivadas das vias aéreas derivadas do iPSC e sua diferenciação em um epitélio mucociliary em culturas de interface ar-líquido.

Geração de culturas de interface ar-líquido de células epiteliais das vias aéreas a partir de células-tronco pluripotentes humanas

Este protocolo descreve a geração de organoides a partir de células epiteliais alveolares A549 e fibroblastos pulmonares MRC-5 em um andaime de hidrogel de matriz extracelular, seguida pela incorporação em géis de colágeno 3D e exposição a tensão mecânica usando um biorreator de estiramento celular para investigar a mecanobiologia alveolar.

Geração de organoides alveolares 3D embutidos em colágeno A549/MRC-5 usando um Biorreator Mecânico de Estiramento Celular

Aprenda a construir um biorreator com imagem guiada para remoção seletiva do epitélio endógeno da traqueia de rato e distribuição homogênea de células exógenas. Este método permite visualização microscópica direta e cultura in vitro de longo prazo para engenharia de tecidos das vias aéreas.

Bioreator guiado por imagem para geração de tecido das vias aéreas bioengenharia

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