Name: Ensaio padrão de alimentação de membrana para a detecção de infecção por plasmodium falciparum em Vetores de Mosquito Anopheles (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 28 s
Description: Aprenda o ensaio padrão de alimentação de membrana para avaliar compostos antimaláricos em mosquitos Anopheles gambiae infectados com Plasmodium falciparum. Este método permite detectar oocistos no intestino médio e medir a atividade bloqueadora da transmissão.

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Os autores gostariam de reconhecer Prof. Lyn-Mari Birkholtz e a Dra. A cepa de parasita foi obtida a partir deste último departamento (não faz parte desta publicação). O Departamento de Ciência e Inovação (DSI) e a Fundação Nacional de Pesquisa (NRF); Iniciativa sul-africana de cadeiras de pesquisa (UID 64763 para LK e UID 84627 para LMB); as Comunidades de Prática nrf (UID 110666 para LMB e LK); e o Conselho De Pesquisa Médica da África do Sul Parcerias Estratégicas de Inovação em Saúde (SHIP) também são reconhecidos por fundos do DSI.

Consulte a Figura 1 para obter uma ilustração do protocolo. A liberação ética foi obtida do Comitê de Ética em Ciências da Saúde da Universidade de Pretória (506/2018) para a retirada e uso de sangue humano.
1. Cultura gametócica
NOTA: Antes da criação da SMFA, foi preparada uma cultura gametocito na Universidade de Pretória (ver Leitor et al.22 para o protocolo completo).
<ol><li>Prepare uma cultura de gametocito que consiste em gametocitos estágio V da cepa de parasitas NF54.</li>
	<li>Certifique-se de que a gametocytemia da cultura está entre 1,5% e 2,5%, com hematócrito de 50% em soro masculino A+, ao qual são adicionados glóbulos vermelhos frescos.</li>
	<li>Separe a cultura em diferentes frascos e adicione 2 μM de cada composto para cada tratamento respectivo 48 h antes de conduzir a SMFA. Deixe o grupo de controle sem tratamento.</li>
	<li>Avalie a cultura gametócica pouco antes de conduzir a SMFA para garantir a exflagellação de gametas masculinos, com a presença de uma proporção 3:1 feminino:masculino.</li>
</ol>2. Infecção artificial de mosquitos através da SMFA
NOTA: Biossegurança: os mosquitos infectados devem ser alojados em uma instalação de biossegurança nível 2 (BSL2) com acesso restrito.
<ol><li>Usando um aspirador bucal, coloque 25 mosquitos an. gambiae fêmeas não alimentados em um copo de alimentação de 350 mL. Faça o mesmo para cada xícara de tratamento e rotule os copos claramente de acordo com se eles devem ser usados como grupos de controle ou tratamento. Escolha o número de copos por tratamento de acordo com o número de réplicas técnicas incluídas. NOTA: Mosquitos colônias entre 5 e 7 dias de idade são usados em uma avaliação típica do composto de bloqueio de transmissão. Mosquitos famintos por 3-4 h ou mais antes da alimentação sanguínea facilitarão a absorção de sangue durante a SMFA.</li>
	<li>Conecte o sistema alimentador de vidro ao banho de água e mantenha a temperatura a 37 °C. NOTA: O alimentador de vidro consiste em dois braços, que estão conectados à tubulação de silicone à qual o banho de água está conectado (Figura 2). A estrutura oca do alimentador permite que a água circule e manum a temperatura do sangue.</li>
	<li>Prepare o intestino da vaca (ou membrana sintética) enxaguando-o na água da torneira e corte-o em pedaços que são montados para cada alimentador. Cubra cada alimentador e aperte a membrana com uma faixa elástica. NOTA: Não foi necessária autorização ética para o intestino, pois foi comprado de uma carnificina local, onde é vendido ao público para preparação de alimentos.</li>
	<li>Coloque os copos de infecção debaixo dos alimentadores, com a membrana colocada em cima da rede do copo.</li>
	<li>Adicione 1 mL de sangue infectado por gametocito aos alimentadores dos copos de controle e sangue infectado por gametocitos com composto adicionado a cada alimentador composto correspondente e copo.</li>
	<li>Deixe os mosquitos se alimentarem por aproximadamente 40 minutos com os alimentadores descobertos. NOTA: As alimentaçãos ocorrem em condições insetídas (25 °C, 80% de umidade relativa) no escuro. O diâmetro de um alimentador é de aproximadamente 13 mm.</li>
	<li>Após a alimentação, remova os alimentadores dos copos, enxágue os alimentadores e trate o excesso de sangue com hipoclorito.</li>
	<li>Remova os mosquitos não-cidos do copo derrubando todos os mosquitos no gelo (por 1-2 min) e separando os mosquitos não-cidos daqueles que fizeram uma refeição de sangue. Procure por abdômens inchados e vermelhos (indicando sangue) para distinguir os mosquitos alimentados e totalmente engorgados dos não alimentados (Figura 3).</li>
	<li>Coloque os copos de infecção na câmara de biossegurança (Figura Suplementar S1) e forneça a cada xícara uma almofada de água 10% açucarada, substituindo a água de açúcar em dias alternados por 8-10 dias.</li>
</ol>3. Preparação de mosquitos infectados
NOTA: Esta parte do protocolo ocorre dentro da sala de infecção BSL2. Apenas funcionários autorizados e treinados podem entrar na sala de infecção onde os mosquitos infectados estão alojados. Os mosquitos são mantidos em copos modificados que contêm apenas um ponto de entrada, que sela automaticamente quando o aspirador da boca é removido. Estes copos são colocados dentro de um recipiente transparente e termoplástico para evitar a fuga. O contêiner está localizado na sala de infecção atrás de um sistema de porta dupla. Todos os protocolos necessários devem estar em vigor para exposição acidental a mosquitos infectados (Arquivo Suplementar S1). Os protocolos são específicos do país e dependem das exigências da instituição.
<ol><li>Nos dias 8-10 pós-infecção, derrube os mosquitos infectados colocando-os no gelo e transferindo-os para tubos rotulados com 70% de etanol (mantendo os mosquitos de cada grupo de controle e tratamento separados).</li>
	<li>Certifique-se de que todos os mosquitos estão mortos antes de sair da sala de infecção.</li>
</ol>4. Dissecções de mosquitos infectados
NOTA: Esta parte do protocolo é realizada em laboratório.
<ol><li>Transfira os mosquitos para placas de Petri rotuladas forradas com papel filtro, mantendo o controle e os grupos de teste separados.</li>
	<li>Coloque uma gotícula de soro fisiológico tamponado de fosfato (PBS) em um slide de microscópio (marcado de acordo com o grupo de controle/teste) e transfira um mosquito individual do papel filtro para o PBS.</li>
	<li>Remova o midgut da amostra imobilizada e infectada prendendo o tórax do mosquito com a agulha dissecando enquanto puxa o7º segmento abdominal com os fórceps.</li>
	<li>Com o intestino sendo exposto e visível, procure os túbulos malpighianos (Figura 4A,B) para distinguir o intestino dos ovários. Remova-o do PBS, transfira-o para uma gota de 0,1% de mercurocromo em um novo slide de microscópio, e deixe o intestino para manchar por 8-10 min.</li>
	<li>Após a coloração, coloque uma mancha no intestino manchado e veja o intestino sob iluminação de campo brilhante em ampliação de 20x-40x (Figura 4C,D).</li>
	<li>Regissuço a presença e o número de oocistos por midgut para cada grupo de controle e tratamento (Arquivo Suplementar S2).</li>
	<li>Calcular a atividade de bloqueio de transmissão usando Equação (1): %TBA <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63546/63546eq01.jpg" style="margin: auto;"> (1) onde TBA = atividade de bloqueio de transmissão (redução da prevalência de oócito); p = prevalência de oócito; C = controle; e T = tratamento.</li>
	<li>Calcular a atividade redutor de transmissão usando Equação (2): %TRA = <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/63546/63546eq02.jpg" style="margin: auto;"> (2) onde TRA = atividade redutor de transmissão (redução da intensidade do oocisto); I = intensidade oocicísto; C = controle; e T = tratamento. NOTA: O TBA pode não ser significativamente reduzido, mas uma diferença significativa pode ser observada no TRA e vice-versa. Isso depende do material químico que está sendo avaliado.</li>
	<li>Realizar análise estatística utilizando o t-test não paramétrico (Mann-Whitney).</li>
</ol>

Os autores não têm conflitos de interesse para divulgar.

Para que este protocolo seja executado com sucesso, deve-se dar atenção a cada passo, embora possa ser um processo tedioso e trabalhoso. Um dos passos mais importantes é garantir que a cultura gametócito seja de boa qualidade e que ela consista em gametocitos maduros, com a razão masculina/feminina correta, antes de iniciar a SMFA23,24. Durante a SMFA, também é crucial manter a cultura gametocito na temperatura correta para evitar que os gametas machos exflagella...

A malária, conhecida como uma das doenças mais destrutivas do mundo, ainda representa uma grande ameaça para vários países - especialmente aqueles dentro da região africana - e contribui para aproximadamente 95% dos casos em todo o mundo1. Esta doença é causada por um parasita protozoário e, juntamente com seu vetor de mosquito Anopheles, esses culpados podem causar grandes danos ao hospedeiro humano2. Mais especificamente, a espécie falciparum do gênero parasita Plasmodium é responsável por cerca de 99% dos casos de malária na África Subsaariana1. Além disso, vários dos principais vetores de mosquito Anopheles (incluindo An. gambiae Giles, An. arabiensis Patton, An. coluzzii Coetzee & Wilkerson sp.n., e An. funestus Giles) poderiam ser culpados por mais de 95% da transmissão de parasitas globalmente 3,4,5,6,7,8 . Para que o companheirismo parasita-vetor ideal seja estabelecido, o vetor do mosquito deve ser suscetível ao parasita e ser capaz de transmiti-lo9. Além disso, tanto o vetor quanto o parasita devem superar barreiras físicas para formar a combinação infecciosa perfeita - o vetor do mosquito deve ser capaz de sustentar o desenvolvimento de parasitas, e o parasita deve ter a capacidade de superar os mecanismos de defesa do hospedeiro10,11.
Os gametócitos, a fase sexual do parasita P. falciparum, desempenham um papel crucial na conexão dos parceiros vetoriais e parasitas12. O desenvolvimento sexual ocorre in vivo, e gametocitogênese descreve o processo de diferenciação de gametócitos maduros em microgametas masculinos motile e macrogametas femininos13. Outro processo que ocorre dentro do mosquito é a exflagellação - o processo durante o qual o gametocito masculino se transforma em gametas e emerge dos glóbulos vermelhos tomados durante uma refeição sanguínea11. O processo de exflagellação é ainda sugerido para ser aprimorado por uma mudança favorável no ambiente do mosquito midgut14. Após a exflagellação, um zigoto é formado pela fusão dos gametas masculino e feminino13. Do zigoto, surge um ookinete motile e se move da refeição sanguínea para o epitélio do mosquito midgut13. Aqui, o ookinete amadurece, e um oocisto é formado, que, por sua vez, produz esporozoites motile13,15. Os esporozoitas então migram para as glândulas salivares do mosquito e, como o mosquito toma uma refeição sanguínea de seu hospedeiro, esses esporozoitas são injetados na corrente sanguínea do hospedeiro15.
As intervenções de controle da malária, combinando estratégias de controle vetorial e o uso de medicamentos antimaláricos eficazes, tornaram-se cruciais no combate a esta doença15. Com o aumento da resistência a parasitas e mosquitos, a urgência para a identificação de novos compostos antimaláricos está aumentandoem 16. Portanto, a avaliação in vivo dos compostos de bloqueio de transmissão é importante16. Após o desenvolvimento de medicamentos de bloqueio de transmissão tão eficazes, a SMFA tem sido utilizada para avaliar se esses compostos inibem o desenvolvimento sexual de P. falciparum no mosquito Anopheles 17,18,19. Este ensaio ganhou reconhecimento desde a década de 1970-1980 como o padrão-ouro para avaliar o bloqueio de transmissão 20,21. Este ensaio fornece uma alternativa mais barata do que outros ensaios, como o RT-qPCR, que requer equipamentos especializados. Além disso, não são necessários pacientes para executar os experimentos. Este ensaio também envolve o fornecimento de sangue induzido por gametocito para mosquitos fêmeas, que são então dissecados para avaliar se o desenvolvimento oocisto está presente21. Isso permite quantificação de gametocito e detecção de oocistos deformados por causa dos compostos22. Para que um composto seja classificado como eficaz, a prevalência (a proporção de mosquitos que abrigam pelo menos um oocisto no midgut) e o número de oocistos (intensidade) no mosquito midgut devem ser avaliadas para avaliar a inibição da infecção 17,21,22.

<table><tbody><tr><td>Intestino bovino/</td><td>Composto de açougue</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MMV1581558</td><td>MMV</td><td></td><td>Caixa de resposta à pandemia</td></tr><tr><td>Agulhas de dissecação</td><td>WRIM</td><td></td><td>Tubo de falcão feito sob medida</td></tr><tr><td></td><td>Lasec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alimentadores de vidro</td><td>Glastechniek Peter Coelen B.V.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Graphpad Prism (8.3.0)</td><td>Graphpad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mercurochrome</td><td>Merck (Sigma-Aldrich)</td><td>129-16-8</td><td></td></tr><tr><td>Lâminas de microscópio</td><td>Merch (Sigma-Aldrich)</td><td>S8902</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Cleansafe</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS tablets</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>BP2944</td><td></td></tr><tr><td>Gabinete de biossegurança Perspex</td><td>Wits University</td><td></td><td>Feito pelos empreiteiros da Wits</td></tr><tr><td>Copos de plástico (350 mL)</td><td>Plastic Land</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ensaio padrão de alimentação de membrana para a detecção de infecção por plasmodium falciparum em vetores de mosquito anopheles

Standard Membrane Feeding Assay for the Detection of Plasmodium falciparum Infection in Anopheles Mosquito Vectors

A malária continua sendo uma das doenças mais devastadoras do mundo e, até o momento, a região africana ainda é responsável por 94% de todos os casos em todo o mundo. Esta doença parasitária requer um parasita protozoário, um vetor de mosquito Anopheles e um hospedeiro de vertebrados. O gênero Anopheles compreende mais de 500 espécies, das quais 60 são conhecidas como vetores do parasita. O gênero parasita Plasmodium é composto por 250 espécies, e 48 delas estão envolvidas na transmissão da doença. Além disso, o parasita Plasmodium falciparum contribuiu para cerca de 99,7% dos casos de malária na África Subsaariana nos últimos anos. 
Os gametócitos fazem parte do estágio sexual do parasita e são ingeridos pelo mosquito fêmea ao se alimentarem de um hospedeiro humano infectado. O desenvolvimento do parasita dentro do mosquito é potencializado por condições ambientais favoráveis no meio do mosquito. Aqui, a fusão dos gametas femininos e masculinos ocorre, e os ookinetes motile se originam. Os ookinetes entram no epitélio médio do mosquito, e ookinetas maduros formam oócitos, que, por sua vez, produzem esporozoites motile. Esses esporozoitas migram para as glândulas salivares do mosquito e são injetados enquanto um mosquito toma uma refeição de sangue. 
Para fins de descoberta de drogas, os mosquitos foram artificialmente infectados com sangue infectado por gametocito no ensaio padrão de alimentação de membrana (SMFA). Para detectar infecção dentro do mosquito e/ou avaliar a eficácia dos compostos antimaláricos, os meios-médios dos mosquitos fêmeas foram removidos após a infecção e foram manchados com mercurocromo. Este método foi utilizado para melhorar a detecção visual de oocistos sob o microscópio para a determinação precisa da prevalência e intensidade do oócito.

O número total de amostras de controle dissecadas foi de 47, com prevalência média de 89% e intensidade de 9,5 oocistos por midgut (Tabela 1, conforme publicado anteriormente22). Para o composto MMV1581558, o tamanho da amostra atingiu um total de 42 espécimes, com prevalência de oocisto de 36% e intensidade média de 1,5 oocistos. Isso mostra uma redução na prevalência de oócito de 58% e uma TRA de 82% nas três réplicas biológicas (Tabela 1).
<p class="jove_co...

O ensaio padrão de alimentação de membrana (SMFA) é considerado como o padrão-ouro para a avaliação e identificação de potenciais compostos antimaláricos. Este sistema de alimentação artificial é usado para infectar mosquitos para avaliar ainda mais os efeitos desses compostos na intensidade e prevalência do parasita Plasmodium falciparum .

Ensaio padrão de alimentação de membrana para a detecção de infecção por plasmodium falciparum em Vetores de Mosquito Anopheles

Malaria remains one of the most devastating diseases worldwide and, to date, the African region is still responsible for 94% of all cases worldwide. This ...

O protocolo permite detectar o efeito do tratamento sobre a suscetibilidade da malária dos vetores africanos da malária. Por exemplo, compostos destinados a bloquear a transmissão do humano para o mosquito. Essa técnica permite que os pesquisadores avaliem um grande número de compostos em condições laboratoriais, mesmo antes da toxicidade que as GATEs estão disponíveis.Dissecções midgut podem ser desafiadoras no início, mas é preciso apenas alguma prática. Além disso, ser capaz de identificar oocistos nem sempre é fácil. Primeiro, usando um aspirador bucal, coloque 25 mosquitos anofelinos de gâmbia fêmeas não alimentados em um copo de alimentação de 350 mililitros.Rotule os copos claramente para distinguir entre grupos de controle e tratamento. Escolha o número de copos por tratamento de acordo com o número de réplicas técnicas incluídas. Conecte o sistema alimentador de vidro a um banho de água e mantenha a temperatura a 37 graus Celsius.Em seguida, prepare o intestino da vaca ou a membrana sintética enxaguando-o na água da torneira e cortando-o em pedaços que são montados para cada alimentador. Cubra a parte inferior de cada alimentador e aperte a membrana com uma faixa elástica. Para usar os copos de alimentação como xícaras de infecção, primeiro, mantenha a membrana em cima das redes dos copos.Em seguida, coloque os copos de infecção debaixo dos alimentadores. Agora, adicione um mililitro de sangue infectado por gametocito aos alimentadores dos copos de controle, e sangue infectado por gametocito com um composto de teste aos alimentadores dos copos de tratamento. Em seguida, deixe os mosquitos se alimentarem por cerca de 40 minutos.Após a alimentação, remova os alimentadores dos copos, enxágue os alimentadores e trate o excesso de sangue com hipoclorito. Em seguida, derrube todos os mosquitos no gelo por um a dois minutos, e selecione os mosquitos que fizeram uma refeição de sangue procurando abdômen inchado e vermelho. Substitua a água de açúcar que é dada em dias alternados para cada xícara de infecção por uma almofada de água 10% açucarada, e incubar os copos de infecção em uma câmara de biossegurança por oito a dez dias.Oito a dez dias após a alimentação, derrube os mosquitos infectados colocando-os no gelo. Em seguida, transfira-os para tubos rotulados com 70% de etanol, mantendo o controle em cada grupo de tratamento em tubos separados. Mantendo os grupos de controle e teste separados, transfira os mosquitos para placas de Petri rotuladas forradas com papel filtro.Adicione uma gota de PBS em um slide de vidro apropriadamente marcado e transfira um mosquito do papel filtro para a gota. Fixar o tórax do mosquito com agulha dissecando. Em seguida, remova o midgut puxando o sétimo segmento abdominal com fórceps, e transfira-o para uma gota de 0,1% mercurocromo em um novo slide de microscópio.Deixe o intestino manchar por 8 a 10 minutos. Em seguida, coloque um deslizamento de cobertura no intestino manchado, e veja-o sob iluminação de campo brilhante em 20 a 40 vezes a ampliação. Registos oocistos por midgut para o controle e cada grupo de tratamento.Neste estudo, o composto MMV1581558 restringiu significativamente o número de oocistos plasmodium falciparum no meio do mosquito Anopheles gambiae feminino em comparação com o controle. No grupo controle, a prevalência média de oocistos no midgut foi de 89% com intensidade média de 9,5 oocistos por midgut. Mas no grupo tratado MMV1581558, a prevalência média de oocistos foi de 36%, com intensidade média de apenas 1,5 oocistos por midgut.Assim, o tratamento MMV1581558 resultou em 58% de atividade de bloqueio de transmissão e redução de 82% da atividade em todas as três réplicas biológicas. É fundamental garantir que os mosquitos se alimentem de uma cultura de gametocite saudável. Se estes são gametocitos imaturos, ou não gametocitos estágio cinco, a probabilidade de obter uma infecção no mosquito é limitada ou impossível.O ensaio utiliza um método de identificação morfológica visual, no entanto, ensaios de quantificação molecular podem ser usados. Isso é, no entanto, mais caro e pode limitar seu uso em laboratórios com recursos restritos. Ter a capacidade de fazer essa técnica abre novos caminhos para avaliar a mudança da prevalência e intensidade da malária entre quase tudo no mosquito.Por exemplo, comparando a capacidade vetorial das espécies.

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Research

JoVE Journal

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