Name: Co-Cultura de Organoides Epiteliais do Intestino Delgado Murine com Células Linfoides Inatas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-23T13:20:00.000+00:00
Duration: 8 min 22 s
Description: Aprenda a estabelecer co-cultura de organoides intestinais murinos com células linfoides inatas tipo 1 para estudar interações epiteliais-imunes e homeostase intestinal.

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E.R. reconhece uma bolsa de doutorado da Wellcome Trust (215027/Z/18/Z). G.M.J. reconhece uma bolsa de doutorado da Wellcome Trust (203757/Z/16/A). D.C. reconhece um doutorado do NIHR GSTT BRC. J.F.N. reconhece uma Bolsa Marie Skłodowska-Curie, uma bolsa do King's Prize, uma bolsa do Fundo RCUK/UKRI RutherfordRI (MR/R024812/1) e um Prêmio semente em Ciência do Wellcome Trust (204394/Z/16/Z). Agradecemos também à equipe do núcleo de citometria de fluxo brc sediada no Hospital Guy. Rorc(γt)-GfpTG C57BL/6 repórteres ratos foram um presente generoso de G. Eberl (Institut Pasteur, Paris, França). Os ratos CD45.1 C57BL/6 foram gentilmente dados por T. Lawrence (King's College London, Londres) e P. Barral (King's College London, Londres).

<ol><li>Martini, E., Krug, S. M., Siegmund, B., Neurath, M. F., Becker, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mend+your+fences%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Gastroenterology+and+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Mend your fences.</a> Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 4 (1), 33-46 (2017).</li>
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<li>Diefenbach, A., Gnafakis, S., Shomrat, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+lymphoid+cell-epithelial+cell+modules+sustain+intestinal+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Innate lymphoid cell-epithelial cell modules sustain intestinal homeostasis.</a> Immunity. 52 (3), 452-463 (2020).</li>
<li>Ebbo, M., Crinier, A., Vély, F., Vivier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+lymphoid+cells%3A+major+players+in+inflammatory+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Innate lymphoid cells: major players in inflammatory diseases.</a> Nature Reviews Immunology. 17 (11), 665-678 (2017).</li>
<li>Vivier, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+lymphoid+cells%3A+10+years+on%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Innate lymphoid cells: 10 years on.</a> Cell. 174 (5), 1054-1066 (2018).</li>
<li>Klose, C. S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+type+1+ILCs+from+a+common+progenitor+to+all+helper-like+innate+lymphoid+cell+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Differentiation of type 1 ILCs from a common progenitor to all helper-like innate lymphoid cell lineages.</a> Cell. 157 (2), 340-356 (2014).</li>
<li>Bernink, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-12+and+-23+control+plasticity+of+CD127%2B+group+1+and+group+3+innate+lymphoid+cells+in+the+intestinal+lamina+propria%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Interleukin-12 and -23 control plasticity of CD127+ group 1 and group 3 innate lymphoid cells in the intestinal lamina propria.</a> Immunity. 43 (1), 146-160 (2015).</li>
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<li>Wong, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+factor+ROR%CE%B1+is+critical+for+nuocyte+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Transcription factor RORα is critical for nuocyte development.</a> Nature Immunology. 13, 229-236 (2012).</li>
<li>Neill, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuocytes+represent+a+new+innate+effector+leukocyte+that+mediates+type-2+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Nuocytes represent a new innate effector leukocyte that mediates type-2 immunity.</a> Nature. 464, 1367-1370 (2010).</li>
<li>Mjösberg, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcription+factor+GATA3+is+essential+for+the+function+of+human+type+2+innate+lymphoid+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">The transcription factor GATA3 is essential for the function of human type 2 innate lymphoid cells.</a> Immunity. 37 (4), 649-659 (2012).</li>
<li>Hoyler, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcription+factor+GATA-3+controls+cell+fate+and+maintenance+of+type+2+innate+lymphoid+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">The transcription factor GATA-3 controls cell fate and maintenance of type 2 innate lymphoid cells.</a> Immunity. 37 (4), 634-648 (2012).</li>
<li>Huang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-25-responsive%2C+lineage-negative+KLRG1hi+cells+are+multipotential+%27inflammatory%27+type+2+innate+lymphoid+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">IL-25-responsive, lineage-negative KLRG1hi cells are multipotential 'inflammatory' type 2 innate lymphoid cells.</a> Nature Immunology. 16, 161-169 (2014).</li>
<li>von Moltke, J., Ji, M., Liang, H. E., Locksley, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tuft-cell-derived+IL-25+regulates+an+intestinal+ILC2-epithelial+response+circuit%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Tuft-cell-derived IL-25 regulates an intestinal ILC2-epithelial response circuit.</a> Nature. 529, 221-225 (2016).</li>
<li>Gerbe, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+epithelial+tuft+cells+initiate+type+2+mucosal+immunity+to+helminth+parasites%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Intestinal epithelial tuft cells initiate type 2 mucosal immunity to helminth parasites.</a> Nature. 529, 226-230 (2016).</li>
<li>Eberl, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+essential+function+for+the+nuclear+receptor+RORgamma%28t%29+in+the+generation+of+fetal+lymphoid+tissue+inducer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">An essential function for the nuclear receptor RORgamma(t) in the generation of fetal lymphoid tissue inducer cells.</a> Nature Immunology. 5, 64-73 (2004).</li>
<li>Spits, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+lymphoid+cells--a+proposal+for+uniform+nomenclature%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Innate lymphoid cells--a proposal for uniform nomenclature.</a> Nature Reviews Immunology. 13, 145-149 (2013).</li>
<li>Mebius, R. E., Rennert, P., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developing+lymph+nodes+collect+CD4%2BCD3-+LTbeta%2B+cells+that+can+differentiate+to+APC%2C+NK+cells%2C+and+follicular+cells+but+not+T+or+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Developing lymph nodes collect CD4+CD3- LTbeta+ cells that can differentiate to APC, NK cells, and follicular cells but not T or B cells.</a> Immunity. 7 (4), 493-504 (1997).</li>
<li>Lindemans, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-22+promotes+intestinal-stem-cell-mediated+epithelial+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Interleukin-22 promotes intestinal-stem-cell-mediated epithelial regeneration.</a> Nature. 528 (7583), 560-564 (2015).</li>
<li>Meininger, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-specific+features+of+innate+lymphoid+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Tissue-specific features of innate lymphoid cells.</a> Trends in Immunology. 41 (10), 902-917 (2020).</li>
<li>Dutton, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterisation+of+innate+lymphoid+cell+populations+at+different+sites+in+mice+with+defective+T+cell+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Wellcome+Open+Research%22%5BJournal%5D)">Characterisation of innate lymphoid cell populations at different sites in mice with defective T cell immunity.</a> Wellcome Open Research. 2, 117(2018).</li>
<li>Bal, S. M., Golebski, K., Spits, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasticity+of+innate+lymphoid+cell+subsets%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Plasticity of innate lymphoid cell subsets.</a> Nature Reviews Immunology. 20, 552-565 (2020).</li>
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<li>Qiu, Z., Sheridan, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolating+lymphocytes+from+the+mouse+small+intestinal+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Isolating lymphocytes from the mouse small intestinal immune system.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (132), e57281(2018).</li>
<li>Sato, T., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growing+self-organizing+mini-guts+from+a+single+intestinal+stem+cell%3A+mechanism+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Growing self-organizing mini-guts from a single intestinal stem cell: mechanism and applications.</a> Science. 340 (6137), 1190-1194 (2013).</li>
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<li>Lukonin, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+landscape+of+intestinal+organoid+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Phenotypic landscape of intestinal organoid regeneration.</a> Nature. 586 (7828), 275-280 (2020).</li>
<li>Cardoso, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+regulation+of+type+2+innate+lymphoid+cells+via+neuromedin+U%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Neuronal regulation of type 2 innate lymphoid cells via neuromedin U.</a> Nature. 549 (7671), 277-281 (2017).</li>
<li>Gury-BenAri, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+spectrum+and+regulatory+landscape+of+intestinal+innate+lymphoid+cells+are+shaped+by+the+microbiome%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The spectrum and regulatory landscape of intestinal innate lymphoid cells are shaped by the microbiome.</a> Cell. 166 (5), 1231-1246 (2016).</li>
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</ol>

Os autores não têm conflitos de interesse.

Este protocolo descreve os métodos para estabelecer organoides do intestino delgado murina, isolando iLC1 raro minimizando a perda de linfócitos durante o protocolo de dissociação intestinal, e estabelecendo co-culturas entre esses dois compartimentos. Existem muitos passos para este protocolo, e embora alguns sejam específicos para iLC1s, essa abordagem pode ser aplicada a outros tipos de células imunes intestinais, e as configurações de co-cultura podem ser adaptadas modularmente para se adequar a questões individuais ...

A comunicação entre o epitélio intestinal e o sistema imunológico residente no intestino é central para a manutenção da homeostase intestinal1. As interrupções nessas interações estão associadas a doenças locais e sistêmicas, incluindo doença inflamatória intestinal (DIB) e cânceres gastrointestinais2. Um exemplo notável de um regulador crítico mais recentemente descrito de homeostase vem do estudo de células linfoides inatas (ILCs), que surgiram como atores-chave na paisagem imunológica intestinal3. ILCs são um grupo de células imunes heterogêneas inatas que regulam a homeostase intestinal e orquestram inflamação em grande parte através da sinalização mediada porcitocinas 4.
Os ILCs murinos são amplamente divididos em subtipos baseados nos perfis de fator de transcrição, receptor e citocina5. Os ILCs tipo 1, que incluem células citotóxicas do Natural Killer (NK) e ILCs tipo 1 (ILC1s) tipo 1, são definidos pela expressão do fator de transcrição (eomesodermina) Eomes e proteína t-box expressa em células T (T-bet)6, respectivamente, e citocinas secretas associadas à imunidade tipo 1 (TH1) auxiliar: interferon-γ (IFNγ) e fator de necrose tumoral (TNF), em resposta à interleucina (IL)-12, IL-15 e IL-187. Durante a homeostase, os ILC1s residentes em tecidos secretam o Fator transformador de crescimento β (TGF-β) para impulsionar a proliferação epitelial e a remodelação matricial8. IlCs tipo-2 (ILC2s) respondem principalmente à infecção por helminto por secreção de cytocinas associadas ao auxiliar T-2 (TH2): IL-4, IL-5, e IL-13, e são caracterizados pela expressão do receptor órfão retinóico relacionado ao ácido (ROR) α (ROR-α)9 e GATA Binding Protein 3 (GATA-3)10,11,12 . Em camundongos, iLC2s "inflamatórios" intestinais são ainda mais caracterizados pela expressão do receptor semelhante à lectina celular assassina (membro G subfamília 1, KLRG)13 onde respondem a células epiteliais derivadas il-2514,15. Finalmente, ILCs tipo 3, que incluem células indutoras de tecido linfoide e ILCs tipo 3 (ILC3s), dependem do fator de transcrição ROR-γt16, e agrupam-se em grupos que secretam tanto o Fator Estimulante da Colônia Macifáfica Granulocyte (GM-CSF), IL-17 ou IL-22 em resposta aos sinais locais il-1β e-2317. As células indutoras de tecido linfoide se aglomeram nas manchas de Peyer e são cruciais para o desenvolvimento desses órgãos linfoides secundários durante o desenvolvimento18, enquanto os ILC3s são o subtipo ilc mais abundante no intestino delgado de murina adulto. Um dos primeiros sistemas de cocultura organoide intestinal murina com ILC3s foi aproveitado para provocar o impacto da citocina IL-22 no Transdutor de Sinal e Ativador da Transcrição 3 (STAT-3) mediado leucina-rich Repeat Contendo G Protein Acoplada Receptor 5 (Lgr5)+ proliferação de células-tronco intestinais19, um poderoso exemplo de uma interação regenerativa ILC-epitelial. Os ILCs exibem a heterogeneidade de impressão entre os órgãos20,21 e exibem plasticidade entre subconjuntos em resposta à polarização das citocinas22. O que impulsiona essas impressões específicas do tecido e as diferenças de plasticidade, e qual o papel que desempenham em doenças crônicas como o IBD23, permanecem tópicos emocionantes que poderiam ser abordados usando co-culturas organoides.
Os organoides intestinais emergiram como um modelo bem sucedido e confiável para estudar o epitélio intestinal24,25. Estas são geradas por células-tronco epiteliais intestinais, ou criptas isoladas inteiras, que incluem células paneth como uma fonte endógena do Membro da Família Wnt 3A (Wnt3a). Essas estruturas 3D são mantidas em hidrogéis sintéticos26 ou em biomateriais que imitam a ápula basal de lamina, por exemplo, a Matriz Extracelular Basal (TBEM), e são ainda complementadas com fatores de crescimento que imitam o nicho circundante, mais notavelmente o Fator de Crescimento Epitelial (EGF), o Inibidor de Proteína Morfogenética Óssea (BMP) e um Lgr5-ligante e Wnt-agonista R-Spondin127 . Nessas condições, os organoides mantêm a polaridade epitelial apico-basal e recapitulam a estrutura cript-villi do epitélio intestinal com criptas de células-tronco que se diferenciam terminalmente em células absortivas e secretas no centro da organoide, que então se derramou no pseudolumen interno por anoikis28. Embora os organoides intestinais sozinhos tenham sido extremamente vantajosos como modelos reducionistas de desenvolvimento epitelial e dinâmicaisoladamente 29,30, eles têm um enorme potencial futuro para entender como esses comportamentos são regulados, influenciados ou mesmo interrompidos pelo compartimento imunológico.
No protocolo a seguir, é descrito um método de cocultura entre organoides intestinais murinas pequenas e iLC1s derivados da lamina propria, que foi recentemente usado para identificar como essa população diminui inesperadamente as assinaturas intestinais de inflamação e, em vez disso, contribui para o aumento da proliferação epitelial via TGF-β neste sistema8.

<table><tbody><tr><td><forte>Reagentes</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoetanol</td><td>Gibco</td><td>21985023</td><td></td></tr><tr><td>Anti-rato CD45 (BV510)</td><td>BioLegend</td><td>103137</td><td></td></tr><tr><td>Anti-rato NK1.1 (PE)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12-5941-83</td><td></td></tr><tr><td>B-27 Suplemento (50X), sem soro</td><td>Gibco</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>CD127 Anticorpo Monoclonal (APC)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17-1271-82</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo Monoclonal CD19 (eFluor 450)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>48-0193-82</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo Monoclonal CD3e (eFluor 450)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>48-0051-82</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo Monoclonal CD5 (eFluor 450)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>48-0031-82</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Tocris</td><td>4423/10</td><td></td></tr><tr><td>COLAGENASE D, 500MG</td><td>Merck</td><td>11088866001</td><td></td></tr><tr><td>Cultrex HA- RSpondin1-Fc HEK293T Cells</td><td>A linha celular foi usada para colher o sobrenadante RSpondin1 condicionado, a linha celular e o Acordo de Transferência de Materiais foram fornecidos pelo Conselho de Curadores da Lelands Stanford Junior University (Calvin Kuo, MD, PhD, Stanford University)</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>DISPASE II (PROTEASE NEUTRA, GRAU II)</td><td>Merck</td><td>4942078001</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12 (1:1) (1X) Dulbecco's Modified Eagle Medium Nutrient Mixture F-12 (Advanced DMEM/F12)</td><td>Gibco</td><td>11320033</td><td></td></tr><tr><td>DNASE I, GRAU II</td><td>Merck</td><td>10104159001</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (1X)</td><td>Gibco</td><td>21969-035</td><td></td></tr><tr><td>Ácido Tetraacetato de Etilenediamina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP2482-100</td><td></td></tr><tr><td>FC block</td><td>2B Scientific</td><td>BE0307</td><td></td></tr><tr><td>Soro Fetal Bovino, qualificado, inativado por ouvir</td><td>Gibco</td><td>10500064</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX (100X)</td><td>Gibco</td><td>3050-038</td><td></td></tr><tr><td>Hanks' Balanced Salt Solution (10X)</td><td>Gibco</td><td>14065056</td><td></td></tr><tr><td>HBSS (1X)</td><td>Gibco</td><td>12549069</td><td></td></tr><tr><td>HEK-293T- mNoggin-Fc A</td><td>linhagem celular foi usada para colher sobrenadante Noggin condicionado, linhagem celular adquirida por meio de Acordo de Transferência de Materiais com o Hubrecth Institute, Uppsalalaan8, 3584 CT Utrecht, Holanda, e é baseada na publicação de Farin, Van Es e Clevers Gastroenterology (2012).</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Solução tampão HEPES (1M)</td><td>Gibco</td><td>15630-056</td><td></td></tr><tr><td>KLRG1 Anticorpo monoclonal (PerCP eFluor-710)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>46-5893-82</td><td></td></tr><tr><td>Kit de coloração de células mortas azuis fixáveis vivas/mortas, para excitação UV</td> Anticorpo monoclonal <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>L23105</td><td></td></tr><tr><td>Ly-6G/Ly-6C (eFluor 450)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>48-5931-82</td><td></td></tr><tr><td>Matriz de membrana basal reduzida ao fator de crescimento Matrigel, sem vermelho de fenol,</td> sem <td>cloro</td><td>356231</td><td></td></tr><tr><td>N-2 sem LDEV (100X)</td><td>Gibco</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>N-acetilcisteína (500mM)</td><td>Merck</td><td>A9165</td><td></td></tr><tr><td>NKp46 Anticorpo monoclonal (PE Cyanine7)</td><td>Thermo Fisher</td><td>25-3351-82</td><td></td></tr><tr><td>PBS (1 X) 7.2 pH</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12549079</td><td></td></tr><tr><td>PBS (10X)</td><td>Gibco</td><td>70013032</td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>Cytiva</td><td>17089101</td><td></td></tr><tr><td>EGF humano recombinante, proteína livre de animais</td><td>R& D Systems</td><td>AFL236</td><td></td></tr><tr><td>Proteína Humana Recombinante IL-15 GMP, CF</td><td>R& D Systems</td><td>247-GMP</td><td></td></tr><tr><td>IL-2 humano recombinante (sem transportadora)</td><td>BioLegend</td><td>589106</td><td></td></tr><tr><td>Mouse recombinante IL-7 (sem transportadora)</td><td>R& D Systems</td><td>407-ML-005/CF</td><td></td></tr><tr><td>UltraComp eBeads</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>01-2222-42</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 dicloridrato (inibidor de ROCK)</td><td>Bio-techne</td><td>1254</td><td></td></tr><tr><td>Plásticos</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 mL tubo</td><td>Falcon</td><td>10788561</td><td></td></tr><tr><td>tubo de 1,5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>30121023</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta de 10 mL</td><td>StarLab</td><td>E4860-0010</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de 15 mL</td><td>Falcon</td><td>11507411</td><td></td></tr><tr><td>Pipa de 25 mL</td><td>Ponteiras de pipeta StarLab</td><td>E4860-0025</td><td></td></tr><tr><td>p10 Ponteiras</td> de pipeta <td>StarLab</td><td>S1121-3810-C</td><td></td></tr><tr><td>p1000 Ponteiras</td> de pipeta <td>StarLab</td><td>I1026-7810</td><td></td></tr><tr><td>p200 Ponteiras de pipeta</td><td>StarLab</td><td>E1011-0921</td><td></td></tr><tr><td>Placa de 24 poços tratada com cultura de tecidos padrão</td><td>Falcon</td><td>353047</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5810 R</td><td></td></tr><tr><td>CO2 e incubadora com temperatura controlada</td><td>Eppendorf</td><td>Galaxy 170 R/S</td><td></td></tr><tr><td>Flow Assisted Cellular Sorter</td><td>Equipamento BD</td><td>FACS Aria II</td><td></td></tr><tr><td>Agitador aquecido</td><td>Stuart Equipment</td><td>SI500</td><td></td></tr><tr><td>Caixa</td> <td>de gelo -</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Microscópio de luz invertida</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>EVOS XL Core Imaging System (AMEX1000)</td><td></td></tr> <tr><td>p10 pipeta</td><td>Eppendorf</td><td>3124000016</td><td></td></tr><tr><td>p1000 pipeta</td><td>Eppendorf</td><td>3124000063</td><td></td></tr><tr><td>p200 pippette</td><td>Eppendorf</td><td>3124000032</td><td></td></tr><tr><td>pistola Pippette</td><td>Eppendorf</td><td>4430000018</td><td></td></tr><tr><td>Gelo molhado</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr></tbody></table>

co-cultura de organoides epiteliais do intestino delgado murine com células linfoides inatas

Co-Culture of Murine Small Intestine Epithelial Organoids with Innate Lymphoid Cells

Co-culturas complexas de organoides com células imunes fornecem uma ferramenta versátil para interrogar as interações bidirecionais que sustentam o delicado equilíbrio da homeostase mucosa. Esses sistemas 3D e multicelulares oferecem um modelo reducionista para lidar com doenças multifatoriais e resolver dificuldades técnicas que surgem ao estudar tipos de células raras, como células linfoides inatas residentes em tecido (ILCs). Este artigo descreve um sistema murino que combina organoides intestinais pequenos e ilCs derivados do lic do tipo 1 (ILC1s) do intestino delgado, que podem ser facilmente estendidos a outras populações ILC ou imunológicas. Os ILCs são uma população residente em tecidos que é particularmente enriquecida na mucosa, onde promovem a homeostase e respondem rapidamente a danos ou infecções. Co-culturas organoides com ILCs já começaram a lançar luz sobre novos módulos de sinalização epitelial-imune no intestino, revelando como diferentes subconjuntos iLC impactam a integridade e regeneração da barreira epitelial intestinal. Este protocolo permitirá novas investigações sobre interações recíprocas entre células epiteliais e imunes, que têm o potencial de fornecer novas percepções sobre os mecanismos de homeostase mucosa e inflamação.

Quando concluídas com sucesso, criptas recém-isoladas devem formar estruturas criptas brotantes dentro de 2-4 dias (Figura 1A). Culturas organoides saudáveis e robustas devem estar crescendo ativamente e podem ser passagemdas e expandidas conforme detalhado no protocolo.
Este protocolo descreve o isolamento do pequeno ILC1 intestinal da linha de repórter transgênico murina murina RORγtGFP , que permite o isolamento do ILC1 vivo pelo FACS (<strong class=...

Este protocolo oferece instruções detalhadas para estabelecer organoides do intestino delgado murine, isolar células linfoides tipo 1 da lamina propria do intestino delgado murina e estabelecer coculturas tridimensionais (3D) entre ambos os tipos de células para estudar interações bidirecionais entre células epiteliais intestinais e células linfoides inatas tipo 1.

Co-Cultura de Organoides Epiteliais do Intestino Delgado Murine com Células Linfoides Inatas

Complex co-cultures of organoids with immune cells provide a versatile tool for interrogating the bi-directional interactions that underpin the delicate ...

Este protocolo fornece uma ferramenta significativa para estudar as interações entre as células imunes intestinais e o epitélio e dissecar como essas interações podem regular na homeostase intestinal e inflamação. A principal vantagem dessa técnica é a requintada quantidade de controle experimental facilitada pela redução do modelo in vitro, que pode ser usado para abordar questões em biologia epitelial e imunológica. Este sistema já foi usado para determinar o papel do ILC1 na expansão de criptas epiteliais CD44 positivas e tem o potencial de avançar ainda mais nossa compreensão de doenças gastrointestinais mediadas por inflamação.Para começar, coloque a matriz extracelular basal transversal térmica no gelo para descongelar e pré-aquecer uma placa padrão tratada com cultura de tecido 24 poços, colocando-a em uma incubadora de 37 graus Celsius. Depois, remova a placa contendo organoides da incubadora e descarte a mídia do poço a ser passagem. Em seguida, adicione 500 microliters de DMEM F12 avançados de gelo aos poços, e usando uma ponta P-1000, colde os organoides de todos os poços em um tubo de 15 mililitros.Enxágüe a parte inferior dos poços com 250 a 300 microlitres de DMEM F12 avançados no gelo, garantindo que não haja organoides no poço e se acumule no tubo de 15 mililitros contendo organoides colhidos. Resuspend a pelota organoide colhida de um a dois dias de idade em um mililitro de gelo frio avançado DMEM F12. Pré-reveste um tubo de 1,5 mililitro com PBS2 por células linfoides inatas replicam amostra e, em seguida, usando uma ponta PBS2 pré-revestida, distribuem aproximadamente 100 a 200 organoides no tubo.Usando uma ponta P-1000 revestida de PBS2, adicione um volume de nada menos que 500 ILC1s calculado desde a etapa de classificação até o tubo de 1,5 mililitro revestido de PBS2 contendo os organoides. Gire ILC1 e organoides a 300 G por cinco minutos a quatro graus Celsius e certifique-se de evitar centrífugas de mesa de pequeno diâmetro, pois elas puxarão as células ao longo da borda do interior do tubo em vez de criar uma pelota na ponta do tubo. Em seguida, remova o sobrenante lentamente e suavemente sem perturbar a pelota e coloque a amostra no gelo.Enquanto segura o tubo em uma superfície fria, resuspenja os organoides e o ILC em 30 microliters de matriz extracelular basal de cruzamento térmico pelo menos 10 a 15 vezes para garantir uma distribuição uniforme. Aplique 30 microliters por poço de organoides ILC na matriz extracelular basal de cruzamento térmico a uma placa pré-aquecida de 24 ou 48 poços para formar uma única cúpula. Depois, coloque a placa diretamente na incubadora por 10 a 20 minutos a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono.Em seguida, adicione 550 microliters de meio ILC1 completo por poço com qualquer citocina experimental desejada ou anticorpos de bloqueio e incubar a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por 24 horas. Após 24 horas, retire suavemente a placa da incubadora e deixe que a placa fique em uma capa de cultura de tecido por um minuto para garantir que os linfócitos sejam assentados. Remova de 200 a 250 microliters de mídia e coloque-o em um poço vazio de uma placa de 24 poços.Usando um microscópio invertido, verifique o supernatante para garantir que nenhum linfócito foi removido. Se o supernatante estiver claro, adicione 300 microliters de meio ILC1 fresco à co-cultura no poço original. Se os linfócitos estiverem presentes no supernatário, centrífuga de 300 a 400 G por três a cinco minutos a quatro graus Celsius e resuspensar a pelota em 300 microliters de meio ILC1 fresco.Em seguida, adicione a suspensão celular aos 200 a 250 microliters restantes de mídia no poço original. Realize a análise a jusante usando imunofluorescência, citometria de fluxo ou purificação FACS de populações-alvo em tampão de lise para análise de expressão genética por uma busca de RNA unicelular ou a granel ou RT-qPCR, conforme descrito no texto. Após a conclusão bem sucedida da passagem, culturas organoides saudáveis e robustas revelaram que as criptas recém-isoladas devem formar estruturas criptas brotantes dentro de dois a quatro dias.A análise citométrica de fluxo foi realizada para isolar o pequeno ILC1 intestinal da linha de repórter transgênico de gamma-T ROR, e a faixa de contagem de ILC esperada foi encontrada em 350 a 3.500 células isoladas. Após serem semeadas com organoides, as coculturas podem ser visualizadas por citoquímica imunoquímica. A microscopia confocal revelou as imagens de pequenos organoides intestinais que são cultivados sozinhos e na presença de ILC1s.A coloração imunocológica revela a presença de ILC1 CD45 positivo nas proximidades das células epiteliais procedentas de Zonula ocluintes em células epiteliais organoides ILC1. A citometria de fluxo demonstrou que a molécula de adesão celular epitelial marca células epiteliais intestinais em organoides, enquanto o CD45 marca ILC1s. A trama citométrica de fluxo e a imunoquímica revelaram aumento da expressão de CD44 em células epiteliais intestinais quando co-cultivado com ILC1.Os estudos do RT-qPCR mostram que a co-cultura ILC1 especificamente aumentou a variante CD44 6, que foi inibida por TGF-beta 1, 2, 3 anticorpo neutralizante, e regulada por TGF-beta 1 recombinante em pequenas culturas intestinais-organóides. É importante ser gentil durante a manipulação dos organoides para garantir que todas as estruturas sejam mantidas e verificar se as estruturas foram pelotas suficientemente após a centrifugação. Ao aumentar a complexidade do sistema adicionando outros componentes imunes e não imunes, este sistema in vitro pode ser usado para abordar outras questões na biologia intestinal.

co-culture-murine-small-intestine-epithelial-organoids-with-innate

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Neste protocolo de vídeo, damos uma explicação passo a passo da transdução lentiviral em organoides do epitélio intestinal primário e do processamento e análise a jusante dessas culturas por RT-PCR quantitativo, RNA-microarray e imuno-histoquímica.

Um Protocolo de Transdução Lentivirus e Análise de Downstream da Intestinal Organóides

As culturas derivadas de células-tronco abrigam um tremendo potencial para modelar doenças infecciosas. Aqui, a cultura de organoides gástricos de camundongos e humanos derivados de células-tronco adultas é descrita. Os organoides são microinjetados com o patógeno gástrico Helicobacter pylori.

Organóides como modelo para Doenças Infecciosas: Cultura dos Direitos Humanos e Organóides e estômago murino Microinjection do Helicobacter pylori

Aqui, um protocolo para a colheita, manter, e tratar rato pequenas Organóides intestinais com padrões de agentes patogénicos associados moleculares (PAMPs) e Listeria monocytogenes é descrito, bem como a ênfase na expressão de genes e técnicas de normalização adequada para a proteína.

o<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Cultura e Reconhecimento de Padrões Receptor Stimulation of Mouse Intestinal Organóides

Neste protocolo, descrevemos como gerar monótolais de cólon epitelial primário murina diretamente de criptas intestinais. Fornecemos abordagens experimentais para gerar monocamadas confluentes em filtros permeáveis, monocamadas confluentes para cura de feridas de risco e estudos bioquímicos, e monocamadas esparsas e confluentes para análise de imunofluorescência.

Geração de Monócamas Epiteliais de Cólon Primário Murine de Criptas Intestinais

Aqui apresentamos dois protocolos que permitem a modelagem de interações apical-específicas intestinais. Monocamadas intestinais derivadas de organoides e culturas de Interface Ar-Líquido (ALI) facilitam a geração de epitélio bem diferenciadas acessíveis tanto de lados luminosos quanto basolaterais, enquanto as organoides intestinais invertidas pela polaridade expõem seu lado apical e são favoráveis a ensaios de alto rendimento.

Métodos culturais para estudar interações específicas apical usando modelos organoides intestinais

O presente protocolo descreve o estabelecimento de um sistema organoide colônico murino para estudar a atividade e o funcionamento das células-tronco colônicas em um modelo knockout de claudina-7.

Cultura tridimensional de criptas colônicas murinas para estudar a função das células-tronco intestinais ex vivo

Neste trabalho, descrevemos um protocolo de cultivo de organoides 3D intestinais de suínos a partir de criptas epiteliais criopreservadas. Descrevemos também um método para estabelecer monocamadas celulares derivadas de organoides 3D, permitindo o acesso ao lado apical de células epiteliais.

Cultura de Organoides 3D Intestinais de Leitões a partir de Criptas Epiteliais Criopreservadas e Estabelecimento de Monocamadas Celulares

Descrevemos um protocolo para isolar criptas murinas do intestino delgado e cultura de organoides intestinais 3D das criptas. Adicionalmente, descrevemos um método para gerar organoides a partir de uma única célula-tronco intestinal na ausência de um nicho celular subepitelial.

A Cultura 3D de Organoides de Criptas Intestinais Murinas e uma Única Célula-Tronco para Pesquisa de Organoides

O estudo apresenta um método para investigação in vitro de infecção bacteriana utilizando organoides intestinais derivados de células-tronco teciduais. O protocolo descreve como cultivar e diferenciar organoides em duas dimensões, infectá-los com Escherichia coli invasiva aderente e avaliar leituras-chave, incluindo ruptura da barreira epitelial, imagem de infecção e resposta de RNA epitelial.

Uma cultura organoide bidimensional em extrato de invasina ou membrana basal para estudar as interações hospedeiro-bactéria

Este artigo descreve métodos diferentes de...

Co-cultura de Modelos Pseudomonas aeruginosa Biofilmes Grown no Live Células Airway Humanos

Aprenda a estabelecer co-cultura de organoides intestinais murinos com células linfoides inatas tipo 1 para estudar interações epiteliais-imunes e homeostase intestinal.

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