Name: Avaliação da Ubiquização substrato por E3 Ubiquitin-ligase em Lysates de Células Mamárias (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 47 s
Description: Aprenda a avaliar a ubiquização de substratos por ligase E3 em lisados de células mamárias HEK293T usando imunoprecipitação e Western blot. Este método acessível auxilia no estudo de doenças como câncer e distúrbios neurológicos.

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O F.R.T é apoiado pelo número de bolsas da FAPESP nº 2020/15771-6 e cnpq universal 405836/2018-0. P.M.S.P e V.S são apoiados pela CAPES. C.R.S.T.B.C foi apoiado pela bolsa de estudos da FAPESP número 2019/23466-1. Agradecemos a Sandra R. C. Maruyama (FAPESP 2016/20258-0) pelo apoio material.

NOTA: Uma visão geral do protocolo de ensaio de onipresença em células de mamíferos está representada na Figura 1.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63561/63561fig01.jpg"> Figura 1. Visão geral do procedimento de ensaio de onipresença. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63561/63561fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
1. Cultura celular
<ol><li>Cresça a linha de células HEK293T em um prato de cultura tratado com TC de 100 mm para 80%-90% de confluência na mídia de crescimento (Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) alta glicose suplementada com 80%-90% de glicose 10% soro bovino fetal (FBS) e penicilina (100 unidades), estreptomicina (100 μg) e L-glutamina (0,292 mg/mL)). Incubar a cultura a 37 °C em uma incubadora de cultura celular umidificada a 5% de CO2.</li>
	<li>Para passar as células, aspire a mídia do prato de cultura usando uma pipeta sorológica. Lave as células uma vez com 1 mL de soro fisiológico esterilizado 1x tamponado com fosfato (PBS 1x).</li>
	<li>Retire as células adicionando 1 mL de trippsina/EDTA (ácido etilenodiaminetetraacético). Incubar o prato a 37 °C por 5 min. Resuspend as células usando uma pipeta sorológica em 2 mL de mídia de crescimento.</li>
	<li>Transfira a suspensão celular para um tubo fresco e limpo de 15 mL e centrífuga a 500 x g por 5 min a temperatura ambiente (RT). Remova o supernatante derramando-o com cuidado. Resuspenque suavemente a pelota celular em 3 mL de mídia de crescimento, pipetando para cima e para baixo para obter uma suspensão celular homogênea.</li>
	<li>Transfira 1 mL da suspensão celular para um prato de cultura tratado com TC de 100 mm contendo 9 mL de mídia de crescimento. NOTA: Se as células estiverem em boas condições, cada prato de cultura de HEK293T, em que a confluência é de 80%-90%, pode gerar três pratos de cultura com 80% de confluência 2 dias após a passagem.</li>
</ol>2. Transfecção celular
NOTA: Não é recomendável transfetar a cultura celular se a confluência alcançada for inferior a 80%.
<ol><li>Antes da transfecção, certifique-se se as células estão livres de contaminação e em uma confluência adequada para transfecções transitórias.</li>
	<li>Para cada amostra de transfecção, prepare os complexos DNA-Polietilenimina (PEI 1 μg/μL no pH 7.2) da seguinte forma:<ol>
<li>Diluir 3 μg de cada plasmídeo em 100 μL de opti-MEM reduzi o meio de soro sem suplementação e misture-o suavemente, pipetando a solução para cima e para baixo. NOTA: Aqui, as células foram transfeinadas com 4 μg de cada plasmídeo: Vetor vazio (pcDNA3) ou construções FLAG-Fbxo7 e UXT-V2-HA, com ou sem 6xHis-myc-ubiquitin. O teor total de DNA foi de 12 μg.</li>
		<li>Descongele o PEI na RT e adicione-o à solução seguindo uma proporção de 3 μL de PEI por 1 μg de DNA. Homogeneize a solução se escoando para cima e para baixo. Em seguida, incuba-lo por 15 min na RT para permitir a formação de complexos de DNA-PEI. NOTA: A proporção ideal do volume de PEI por quantidade de DNA difere de acordo com a linha celular selecionada.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Adicione o volume total de complexos de DNA-PEI a cada prato contendo a cultura celular e misture-o suavemente balançando a placa para frente e para trás. Incubar as células a 37 °C em uma incubadora de cultura celular umidificada a 5% de CO2.</li>
	<li>Substitua o meio de crescimento após 5h, uma vez que a exposição prolongada ao PEI pode ser tóxica para as células HEK293T. Incubar as células a 37 °C em uma incubadora de cultura celular umidificada a 5% de CO2 por 36 h.</li>
</ol>3. Lise celular e imunoprecipitação
<ol><li>Após o período de incubação e 6h antes da lise celular, trate as células transfeinadas com 10 μM do inibidor proteasome MG-132. Mais uma vez, incubar as células a 37 °C em uma incubadora de cultura celular umidificada a 5% de CO2.</li>
	<li>Aspire a mídia de cada prato de cultura usando uma pipeta sorológica e lave-a uma vez com 1 mL de 1x PBS. Retire as células adicionando 1 mL de trippsina e incubando o prato a 37 °C por 5 min. Resuspense as células em 1 mL de mídia de crescimento.</li>
	<li>Transfira a suspensão da célula para um tubo fresco e limpo de 15 mL e centrífuga a 500 x g por 5 min no RT.</li>
	<li>Remova o supernatante derramando-o com cuidado. Resuspenque suavemente a pelota de célula em 200 μL de tampão de lise NP-40 gelado (50 mM Tris-HCl pH 7.2, 225 mM KCl, e 1% NP-40), complementado com o coquetel de inibidores de protease e fosfatase (10 mM NaF e 1 mM Na3VO4), e transfira a solução para um microtubo limpo de 1,5 mL.</li>
	<li>Incubar a célula lysate por 30 minutos no gelo. Após a incubação, centrifugar as células lísceus a 16.900 x g para 20 min a 4 °C.</li>
	<li>Enquanto isso, equilibre as contas agarose-anti-HA com o tampão de lise NP-40 gelado. Use 15 μL de contas agarose-anti-HA para cada amostra. Lave as contas com 200 μL de tampão de lise NP-40 pulsando-as em um tubo de microcentrífuga a 3.000 x g por 1 min a 4 °C. Com uma pipeta, aspire e descarte o supernatante com muito cuidado; repetir este processo três vezes. Depois, mantenha as contas equilibradas no gelo até o uso.</li>
	<li>Depois de centrifugar as células, recupere o supernatante. Quantifique o teor de proteína no total do lysate utilizando o método Bradford16.</li>
	<li>Certifique-se de que cada amostra submetida à imunoprecipitação apresenta uma quantidade igual de proteína. Incubar o volume necessário de lise celular com as contas agarose-anti-HA equilibradas por 4h, girando suavemente em uma incubadora rotativa a 4 °C, o que permite que o UXT-V2-HA se ligue às contas agarose-anti-HA.</li>
	<li>Colete as contas agarose-anti-HA pulsando-as em um tubo de microcentrifuuge a 3.000 x g por 1 min a 4 °C. Aspire cuidadosamente e descarte o supernatante. Lave as contas três vezes com tampão de lise celular NP-40 gelado e duas vezes com tampão FLAG/HA gelado (10 mM Hepes pH 7.9, 15 mM MgCl2, 225 mM KCl e 0,1% NP-40).</li>
	<li>Após a lavagem final, remova todo o supernatante cuidadosamente usando uma pipeta e elute a proteína poliubiquitylated com peptídeo HA (300 μg/mL) diluído no tampão FLAG/HA. Incubar as contas agarose-anti-HA com peptídeo HA por 1 h a 4 °C em uma plataforma de shaker de balanço.</li>
	<li>Gire as contas a 3.000 x g por 2 min a 4 °C e pipeta cuidadosamente o supernatante contendo as proteínas polibiquitinadas. Se necessário, armazene o eluato em um microtube fresco e limpo a -20 °C.</li>
	<li>Resolva os eluatos e os lises celulares em 10% SDS-PAGE (sulfato de sódio-poliacrilamida eletroforese de gel de poliacrilamida)17 e imunoblotação.</li>
	<li>Neste estudo, foi realizada uma transferência molhada de WB. Para este tipo de transferência, coloque o gel em um sanduíche de transferência composto de papel filtro de papel-gel-papel-filtro-filtro, amorteça-o com almofadas e pressione-o junto por uma grade de suporte. Coloque este sistema verticalmente em um tanque cheio de tampão de transferência e entre eletrodos de aço inoxidável/fio de platina. A transferência ocorre por 90 min a 150 V em tampão de transferência molhada (glicina 192 mM, tris-base 25 mM, 0,025% SDS, 20% metanol). NOTA: Uma vez que os extratos celulares foram quantificados (etapa 3.7), execute uma SDS-PAGE com uma quantidade igual de proteína para cada amostra. Além disso, para resolver o elunato, execute volumes iguais de cada amostra.</li>
	<li>Teste a membrana do imunobloto usando anticorpos selecionados 11. Certifique-se de que um sinal de difamação seja detectado no eluato do substrato poliinubitado puxado no processo IP usando anticorpo anti-mímico nas amostras contendo a liga ligase E3 tipo selvagem, o substrato e o myc-ub. No liseto celular (entrada), certifique-se de que o sinal do substrato escolhido, a proteína Fbxo7, proteínas ubiquizadas e uma proteína de limpeza (por exemplo, GAPDH e β-actin) são detectados para garantir a mesma quantidade de proteínas em cada pista. NOTA: A diluição de cada anticorpo utilizado foi preparada de acordo com as instruções do fabricante.</li>
</ol>

<ol><li>Popovic, D., Vucic, D., Dikic, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitination+in+disease+pathogenesis+and+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Ubiquitination in disease pathogenesis and treatment.</a> Nature Medicine. 20 (11), 1242-1253 (2014).</li>
<li>Callis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ubiquitination+machinery+of+the+ubiquitin+system%5BTitle%5D)+AND+%22The+Arabidopsis+Book%22%5BJournal%5D)">The ubiquitination machinery of the ubiquitin system.</a> The Arabidopsis Book. 12, 0174(2014).</li>
<li>Koegl, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+ubiquitination+factor%2C+E4%2C+is+involved+in+multiubiquitin+chain+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A novel ubiquitination factor, E4, is involved in multiubiquitin chain assembly.</a> Cell. 96 (5), 635-644 (1999).</li>
<li>French, M. E., Koehler, C. F., Hunter, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+functions+of+branched+ubiquitin+chains%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Discovery%22%5BJournal%5D)">Emerging functions of branched ubiquitin chains.</a> Cell Discovery. 7 (1), 6(2021).</li>
<li>Komander, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+discrimination+of+structurally+equivalent+Lys+63-linked+and+linear+polyubiquitin+chains%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Reports%22%5BJournal%5D)">Molecular discrimination of structurally equivalent Lys 63-linked and linear polyubiquitin chains.</a> EMBO Reports. 10 (5), 466-473 (2009).</li>
<li>Clague, M. J., Urbé, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitin%3A+Same+molecule%2C+different+degradation+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Ubiquitin: Same molecule, different degradation pathways.</a> Cell. 143 (5), 682-685 (2010).</li>
<li>Davies, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vps9p+CUE+domain+ubiquitin+binding+is+required+for+efficient+endocytic+protein+traffic%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Vps9p CUE domain ubiquitin binding is required for efficient endocytic protein traffic.</a> Journal of Biological Chemistry. 278 (22), 19826-19833 (2003).</li>
<li>Raasi, S., Wolf, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitin+receptors+and+ERAD%3A+A+network+of+pathways+to+the+proteasome%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Ubiquitin receptors and ERAD: A network of pathways to the proteasome.</a> Seminars in Cell and Developmental Biology. 18 (6), 780-791 (2007).</li>
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<li>Raducu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SCF+%28Fbxl17%29+ubiquitylation+of+Sufu+regulates+Hedgehog+signaling+and+medulloblastoma+development%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">SCF (Fbxl17) ubiquitylation of Sufu regulates Hedgehog signaling and medulloblastoma development.</a> The EMBO Journal. 35 (13), 1400-1416 (2016).</li>
<li>Spagnol, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+E3+ubiquitin+ligase+SCF%28Fbxo7%29+mediates+proteasomal+degradation+of+UXT+isoform+2+%28UXT-V2%29+to+inhibit+the+NF-%CE%BAB+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+-+General+Subjects%22%5BJournal%5D)">The E3 ubiquitin ligase SCF(Fbxo7) mediates proteasomal degradation of UXT isoform 2 (UXT-V2) to inhibit the NF-κB signaling pathway.</a> Biochimica et Biophysica Acta - General Subjects. 1865 (1), 129754(2021).</li>
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<li>Huang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UXT-V1+facilitates+the+formation+of+MAVS+antiviral+signalosome+on+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">UXT-V1 facilitates the formation of MAVS antiviral signalosome on mitochondria.</a> The Journal of Immunology. 188 (1), 358-366 (2012).</li>
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</ol>

Os autores declaram que não há conflito de interesses.

A ubiquização é uma modificação pós-translacional essencial que regula os níveis de várias proteínas e desempenha um papel crucial em muitas vias de sinalização e processos biológicos, garantindo um ambiente intracelular saudável. O sistema ubiquitina-proteasome (UPS) é um dos principais focos de pesquisas farmacêuticas recentes, proporcionando a possibilidade de estabilizar supressores tumorais ou induzir a degradação de produtos oncogênicos22. Por exemplo, a proliferação aberrante de neoplasias ...

As modificações pós-translacionais (PTMs) são um mecanismo importante no que diz respeito à regulação da proteína, essencial para a homeostase celular. A ubiquidade proteica é uma modificação dinâmica e intrincada que cria uma variedade de diferentes sinais resultando em vários desfechos celulares em organismos eucarióticos. A ubiquização é um processo reversível que consiste na fixação de uma proteína de ubiquitina contendo 76 aminoácidos ao substrato, ocorrendo em uma cascata enzimática composta por três reações distintas1. O primeiro passo é caracterizado pela ativação da ubiquitina, que depende de uma hidrólise ATP para formar uma oniquitina ligada a tioéster de alta energia entre a ubiquitina C-terminus e o resíduo de cisteína presente no local ativo da enzima E1. Posteriormente, a ubiquitina é transferida para a enzima E2 formando um complexo de tiaster com a ubiquitina. Posteriormente, a ubiquitina é covalentemente ligada ao substrato pelo E2, ou mais frequentemente, pela enzima E3, que reconhece e interage com o substrato 2,3. Ocasionalmente, enzimas E4 (fatores de alongamento da cadeia ubiquitina) são necessárias para promover o conjunto da cadeia multiubiquitina3.
A ubiquitina possui sete resíduos de linfino (K6, K11, K27, K29, K33, K48 e K63), permitindo a formação de cadeias de poliugentina que geram ligações distintas para produzir diferentes estruturas tridimensionais que serão reconhecidas por várias proteínasefeitoras 4,5. Assim, o tipo de cadeia de poliuforma introduzida no substrato é essencial para decidir seu destino celular 6,7,8. Além disso, o substrato também poderia ser ubiquitinado através de seus resíduos n-terminais chamados N-degrons. As ubiquína-ligases específicas E3 são responsáveis pelo reconhecimento de N-degron, permitindo a poliuubiquização do resíduo de liseínanas proximidades 9.
Atualmente, há mais de 40 substratos específicos do SCF caracterizados. Entre elas, podem ser encontrados 10,11,12,13, 12,13. Assim, a identificação de substratos específicos de cada ubiquitina-ligase E3 é essencial para projetar um mapa abrangente de vários eventos biológicos. Embora a identificação de substratos verdadeiros seja bioquimicamente desafiadora, o uso de métodos baseados em bioquímica é muito adequado para avaliar a especificidade da cadeia e a distinção entre mono e poliumipremiado14. Este estudo descreve um protocolo completo para ensaio de onipresença usando a linha celular de mamíferos HEK293T sobreexpressando o substrato UXT-V2 (onipresentemente expresso como acompanhante de ubimia 2) com o complexo e3 ubiquitin-ligase SCF(Fbxo7). O UXT-V2 é um cofator essencial para a sinalização NF-κB, e uma vez que essa proteína é derrubada nas células, inibe a ativação NF-κB induzida por TN α F11. Assim, para detectar o UXT-V2 poliutilítulo, o inibidor proteasome MG132 é utilizado, pois tem a capacidade de bloquear a atividade proteolítica da subunidade 26S do complexoproteasome 15. Além disso, o extrato celular é submetido a um IP de pequena escala para purificar o substrato, utilizando um anticorpo específico imobilizado para resina agarose para posterior detecção por WB usando anticorpos selecionados. Este protocolo é muito útil para validar a ubiquização do substrato no ambiente celular, e também pode ser adaptado para diferentes tipos de células mamíferas e outros complexos de ubiquitina-ligase E3. No entanto, é necessário validar o substrato testado através de um ensaio de onipresença in vitro também, uma vez que ambos os protocolos se complementam em relação à identificação de substratos verdadeiros.

<table><tbody><tr><td>Microtubo de 1,5 mL</td><td>Axygen</td><td>PMI110-06A</td><td></td></tr><tr><td>Placa de cultura tratada com TC de 100 mm</td><td>Corning</td><td>430167</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de 15 mL</td><td>Placa de</td><td>430766</td><td></td></tr> de <tr><td>96 poços</td><td>Cralplast</td><td>655111</td><td></td></tr><tr><td>Grânulos de agarose-anti-HA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E6779</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo de camundongo</td><td>Seracare</td><td>5220-0341</td><td>Anticorpo anti-IgG anti-coelho de cabra</td></tr><tr><td></td><td>Seracare</td><td>5220-0337</td><td>Anticorpo anti-actina IgG de cabra</td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3853</td><td>Diluição usada: 1:2000</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-Fbxo7</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SAB1407251</td><td>Diluição usada: 1:1000</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-HA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3663</td><td>Diluição usada: 1:1000</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-Myc</td><td>Sinalização celular</td><td>2272</td><td>Diluição usada: 1:1000</td></tr><tr><td>Reagente Bradford</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B6916-500ML</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9647-100G</td><td>Incubadora de células de albumina de soro bovino</td></tr><tr><td></td><td>Nuaire</td><td>NU-4850</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>Eppendorf</td><td>5804R</td><td>500 x g por 5 min</td></tr><tr><td>Medidor de pH digital ChemiDoc</td><td>BioRad</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Kasvi</td><td>K39-2014B</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Águia Modificada' s Medium</td><td>Corning</td><td>10-017-CRV</td><td>Soro bovino fetal de alta glicose</td></tr><tr><td></td><td>Gibco</td><td>F4135</td><td>Filtrado de uso prévio</td></tr><tr><td>Peptídeo HA</td> de uso prévio <td>Sigma-Aldrich</td><td>I2149</td><td></td></tr><tr><td>HEK293T células</td><td>ATCC</td><td>CRL-3216</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Gibco</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>VWR Life Science</td><td>0365-500G</td><td></td></tr><tr><td>Kline rotator</td><td>Global Trade Technology</td><td>GT-2OIBD</td><td></td></tr><tr><td>MG-132</td><td>Boston Biochem</td><td>I-130</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrífuga</td><td>Eppendorf</td><td>5418R</td><td></td></tr><tr><td>Na3VO4 (Ortovanadato)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaF</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Membrana de Nitrocelulose</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td>10600016</tr><tr><td>NP40 (IGEPAL CA-630)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I8896-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio óptico</td><td>OPTIKA microscópios SN510768</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Gibco</td><td>31985-070</td><td></td></tr><tr><td>pcDNA3</td><td>Invitrogen</td><td>V79020</td><td>Para expressão de mamíferos</td></tr><tr><td>pcDNA3-2xFlag-Fbxo7</td><td>&nbsp; Gentilmente doado pelo Dr. Marcelo Dam&aacute; rio</td><td></td><td>Tag 2xFlag (N-terminal). Enzimas de restrição: EcoRI e XhoI</td></tr><tr><td>pcDNA3-2xFlag-Fbxo7-&Delta; F-box</td><td>&nbsp; Gentilmente doado pelo Dr. Marcelo Dam&aacute; rio</td><td></td><td>Tag 2xFlag (N-terminal). Enzimas de restrição: EcoRI e XhoI. &Delta; 335-367</td></tr><tr><td>pcDNA3-UXTV2-HA&</td><td>nbsp; Gentilmente doado pelo Dr. Marcelo Dam&aacute; rio</td><td></td><td>Tag HA (terminal C). Enzimas de restrição: EcoRI e XhoI</td></tr><tr><td>pCMV-6xHis-Myc-Ubiquitina</td><td>&nbsp; Gentilmente doado pelo Dr. Marcelo Dam&aacute; rio</td><td></td><td>Tag 6x-His-Myc (N-terminal). Enzimas de restrição: EcoRI e KpnI</td></tr><tr><td>Pen Strep Glutamina 100x</td><td>Gibco</td><td>10378-016</td><td></td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato 10x</td><td>AccuGENE</td><td>51226</td><td>Para obter um PBS 1x, dilua o PBS 10x em água ultrapura</td></tr><tr><td>Polietileninina (PEI)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9002-98-6</td><td></td></tr><tr><td>Ponceau S</td><td>VWR Life Science</td><td>0860-50G</td><td></td></tr><tr><td>Coquetel de inibidores de protease SIGMAFAST</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8820</td><td></td></tr><tr><td>Rocking Shaker</td><td>Kasvi</td><td>19010005</td><td></td></tr><tr><td>sistema SDS-PAGE BioRad</td><td></td><td>165-8004</td><td></td></tr><tr><td>Homogeneizador de Solução</td><td>Phoenix Luferco</td><td>AP-22</td><td></td></tr><tr><td>Base Trizma</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6066-500G</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina (TrypLe Express)</td> <td>Gibco</td><td>12605-028</td><td></td></tr><tr><td>Reagente de Luminol Western Blotting</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>SC-2048</td><td></td></tr></tbody></table>

avaliação da ubiquização substrato por e3 ubiquitin-ligase em lysates de células mamárias

Evaluation of Substrate Ubiquitylation by E3 Ubiquitin-ligase in Mammalian Cell Lysates

A ubiquização é uma modificação pós-translacional que ocorre em células eucarióticas que é fundamental para a regulação de várias vias biológicas, incluindo sobrevivência celular, proliferação e diferenciação. É um processo reversível que consiste em um apego covalente da ubiquitina ao substrato através de uma reação em cascata de pelo menos três enzimas diferentes, compostas por E1 (enzima de ativação de ubiquitina), E2 (enzima conjugante de Ubiquitina) e E3 (enzima Ubiquitin-ligase). O complexo E3 desempenha um papel importante no reconhecimento e na ubiquização do substrato. Aqui, um protocolo é descrito para avaliar a ubiquização substrato em células mamíferas usando co-transfecção transitória de um plasmídeo codificando o substrato selecionado, uma liga ligase de ubiquitina E3 e uma ubiquitina marcada. Antes da lise, as células transfeinadas são tratadas com o inibidor proteasome MG132 (carbobenzoxy-leu-leucinal) para evitar a degradação proteasómal substrato. Além disso, o extrato celular é submetido à imunoprecipitação em pequena escala (IP) para purificar o substrato poliubiquítado para posterior detecção por mancha ocidental (WB) usando anticorpos específicos para a tag ubiquitina. Assim, um protocolo consistente e descomplicado para ensaio de onipresença em células de mamíferos é descrito para auxiliar os cientistas no enfrentamento da onipresençação de substratos específicos e ligaduras de ubiquína E3.

UXT (transcrição onipresentemente expressa) é uma proteína pré-dobrada que forma complexos onipresentemente expressos de dobra de proteínas em tecidos humanos e camundongos, como coração, cérebro, músculo esquelético, placenta, pâncreas, rim e fígado18. Dois isóformes de emenda do UXT, que são chamados UXT-V1 e UXT-V2, foram descritos executando funções distintas e locais subcelulares. O UXT-V1 é predominantemente localizado no citoplasma e dentro das mitocôndrias, e está implicado na apoptose ind...

Fornecemos um protocolo detalhado para um ensaio de ubiquização de um substrato específico e uma ubiquitina-ligase E3 em células mamíferas. As linhas celulares HEK293T foram utilizadas para superexpressão de proteínas, o substrato poliubiquizado foi purificado a partir de lisestês celulares por imunoprecipitação, e resolvido em SDS-PAGE. A imunoblotação foi usada para visualizar esta modificação pós-translacional.

Avaliação da Ubiquização substrato por E3 Ubiquitin-ligase em Lysates de Células Mamárias

Ubiquitylation is a post-translational modification which occurs in eukaryotic cells that is critical for several biological pathways' regulation, ...

Este protocolo permite avaliar a ubiquização de um substrato específico por uma ligase E3. Sabemos que a caracterização da interação ligase-substrato é crucial para entender sua função nas células. Esta técnica não requer reagentes caros ou equipamentos sofisticados.Precisa de plasmídeos e codificação dos genes de interesse, desenvolvendo um ensaio de imunoprecipitação com lises celulares, e uma mancha ocidental para detectar ubiquização substrato. Várias doenças humanas, como câncer e distúrbios neurológicos, estão associadas à desregulação da ligase E3. Assim, a identificação da ubiquidade substrato por ligase específica do E3 poderia auxiliar no tratamento ou diagnóstico dessas doenças.Demonstrar o procedimento será de Valentine Spagnol. Para começar, cresça a linha de células HEK293T para 80 a 90% de confluência no meio modificado de Águias de Dulbecco complementado com soro bovino 10% fetal e 100 unidades de penicilina, 100 microgramas estreptomicina e 0,292 miligramas por mililitros L-glutamina. Então, incubar essa cultura a 37 graus Celsius em uma incubadora de cultura celular umidificada a 5% de dióxido de carbono.Passagem as células aspirando a mídia do prato de cultura usando uma pipeta sorológica e lave-as uma vez com um mililitro de 1X PBS esterilizado. Em seguida, desprende as células adicionando um mililitro de solução de ácido etilenodiaminetetraactic e após cinco minutos de incubação a 37 graus Celsius, resuspenda essas células em dois mililitros de mídia de crescimento usando uma pipeta sorológica. Transfira a suspensão celular para um tubo fresco e limpo de 15 mililitros e centrífuga a 500 vezes G por cinco minutos à temperatura ambiente.Em seguida, remova suavemente o supernasce e resuspenque a pelota de célula em três mililitros de mídia de crescimento, pipetando para cima e para baixo para obter uma suspensão celular homogênea. Em seguida, transfira um mililitro desta suspensão celular para um prato de cultura tratado com TC de 100 milímetros contendo nove mililitros de mídia de crescimento. Antes da transfecção, certifique-se se as células estão livres de contaminação e em uma confluência adequada para transfecções transitórias.Para cada amostra de transfecção, prepare os complexos de DNA-polietileneimina diluindo três microgramas de cada plasmídeo em 100 microliters de opti-MEM 1 meio soro reduzido sem suplementação e misturando-o suavemente, pipetando a solução para cima e para baixo. Em seguida, descongele o DNA-polietileneimina à temperatura ambiente e adicione-o à solução seguindo uma proporção de três microlitadores de DNA-polietileneimina por um micrograma de DNA. Homogeneize a solução se escoando para cima e para baixo.Em seguida, incuba-o por 15 minutos à temperatura ambiente para permitir a formação de complexos de DNA-polietileneimina. Adicione o volume total de complexos de DNA-polietileneimina a cada prato contendo a cultura celular e misture-o suavemente balançando a placa para frente e para trás. Em seguida, incubar essas células a 37 graus Celsius em uma incubadora de cultura celular umidificada.Após a incubação e seis horas antes da lise celular, trate as células transfeinadas com 10 micromolars proteasome inibidor MG132 e incubar as células na incubadora de cultura celular umidificada. Em seguida, aspire a mídia de cada prato de cultura usando uma pipeta sorológica e lave as células uma vez com um mililitro de 1X PBS. Em seguida, desprende as células adicionando um mililitro trypsin e incubar o prato a 37 graus Celsius por cinco minutos.Resuspenja as células em um mililitro de mídia de crescimento e transfira a suspensão celular para um microtubo fresco e limpo de dois mililitros e centrifuá-lo a 500 vezes G por cinco minutos à temperatura ambiente. Uma vez que a centrifugação acabou, remova o supernacido, despejando-o cuidadosamente e suavemente resuspend a pelota celular em 200 microliters de tampão de lise MP40 gelado complementado com o coquetel de inibidores de protease e fosfatase. Em seguida, transfira esta solução para um microtubo limpo de 1,5 mililitro.Incubar esta célula por 30 minutos no gelo, e após a incubação, centrifugar as células lísatos a 16.900 vezes G por 20 minutos a quatro graus Celsius. Enquanto isso, equilibre as contas anti-HA agarose com tampão de lise MP40 gelado. Use 15 microliters de contas anti-HA agarose para cada amostra.Lave as contas com 200 microliters de tampão de lise MP40 pulsando-as em um tubo de microcrédito a 3.000 vezes G por um minuto a quatro graus Celsius. Em seguida, aspire e descarte o supernatante cuidadosamente com uma pipeta e repita esse processo três vezes. Depois, mantenha as contas equilibradas no gelo até o uso.Após centrifugar os lises celulares, recupere o supernasal e quantifique o teor de proteína no total do lysate usando o método Bradford para garantir que cada amostra submetida à imunoprecipitação apresente uma quantidade igual de proteína. Incubar o volume necessário de lise celular com as contas anti-HA equilibradas por quatro horas, girando suavemente em uma incubadora rotativa a quatro graus Celsius, o que permite que o UXT-V2-HA se ligue às contas anti-HA agarose. Colete as contas anti-HA agarose, pulsando-as em um tubo de microcentrifuuge a 3.000 vezes G por um minuto a quatro graus Celsius.Aspire cuidadosamente e descarte o supernatante. Lave as contas três vezes com tampão de lise celular MP40 gelado e duas vezes com tampão HA FLAG HA gelado. Após a lavagem final, remova todo o supernatante cuidadosamente usando uma pipeta e elute a proteína poli-ubiquitylated com 300 microgramas por mililitro de peptídeo HA diluído no buffer FLAG HA.Incubar as contas anti-HA agarose com peptídeo HA por uma hora a quatro graus Celsius em uma plataforma de shaker de balanço. Em seguida, gire as contas a 3.000 vezes G por dois minutos a quatro graus Celsius e remova cuidadosamente o sobrenante contendo as proteínas poli-ubiquitinadas. Se necessário, armazene o eluent em um microtubo fresco e limpo a menos 20 graus Celsius.Resolva os eluents e os lises celulares em 10% de sulfato de sódio de poliacrilamida eletroforese e imunoblotação. Para realizar uma transferência molhada, coloque o gel em um sanduíche de transferência composto de papel filtro, papel filtro de membrana gel, amorteça-o com almofadas e pressione-o junto por uma grade de suporte. Em seguida, coloque este sistema verticalmente em um tanque cheio de buffer de transferência entre eletrodos de aço inoxidável ou fio de platina.A transferência ocorre por 90 minutos a 150 volts em um buffer de transferência molhado. Finalmente, teste a membrana do imunobloto usando anticorpo anti-mirílico. A poli-ubiquização específica de UXT-V2-HA mediada pela proteína F-box 7 nas células foi observada após sondar o eluente da imunoprecipitação anti-HA com um anticorpo anti-micóc, que detecta o micrúnico conjugado ao substrato.A especificidade do anti-mimato para substrato poli-ubiquílico foi visualizada nas faixas um e dois, onde uma mancha de proteínas poli-ubinciadas não foi detectada quando as células foram co-transtraídas com proteína F-box 7 e myc-ub na ausência de plasmídeo UXT-V2-HA. Além disso, nenhuma mancha correspondente à poli-ubiquização proteica foi visualizada na combinação de proteína F-box 7 e UXT-V2-HA sem o plasmídeo myc-ub. Quando uma proteína de caixa F de vetor vazio 7 ou proteína F-box 7 mutante incapaz de montar SCF ativo foi transectada em combinação com UXT-V2-HA e myc-ub, um forte sinal de difamação de UXT-V2 poli-ubiquílico foi observado apenas para a proteína da caixa F 7, sugerindo que o UXT-V2 foi poli-ubiquílico pelo complexo de proteína scf f-box 7 e células em comparação com os controles.Os passos de mono-precipitação, incluindo a incubação de lisatos celulares com as contas equilibradas e a eluição de proteínas imunoprecipitadas são essenciais para alcançar o objetivo deste protocolo. Após este procedimento, deve-se realizar um ensaio de onipresença in vitro para confirmar a especificidade da ubiquidade do substrato pela ligase E3.

evaluation-substrate-ubiquitylation-e3-ubiquitin-ligase-mammalian

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Ubiquitinação é uma modificação fundamental posttranslational realizado por um conjunto de três enzimas. Mutações dos genes envolvidos nesta modificação estão associadas com diferentes tipos de doenças humanas. Aqui, descrevemos os protocolos para detectar ubiquitinação de proteínas em células...

Detecção de Ubiquitinação Protein

Este vídeo demonstra o método in vitro para SUMOilação de proteínas de substrato usando uma cascata enzimática sequencial. Além disso, o status SUMOilado da proteína é identificado usando a técnica de eletroforese e immunoblotting.

Ensaio de SUMOilação: Uma Técnica In Vitro para Detectar o Status de SUMOilação de Proteínas de Substrato por Immunoblotting

Ao contrário da ubiquitina ligases, foram identificados alguns ligases E3 sumô. Este modificado em vitro protocolo SUMOylation é capaz de identificar o romance sumô E3 ligases por um ensaio de reconstituição em vitro .

In Vitro Ensaio de SUMOylation para estudar a atividade de Ligase E3 sumô

Apresentamos um método para a purificação, detecção e identificação de peptídeos diGly que se originam de proteínas ubiquitinadas de amostras biológicas complexas. O método apresentado é reprodutível, robusto e supera os métodos publicados em relação ao nível de profundidade da análise ubiquitinome.

Detecção de locais de ubiquitinação de proteínas por enriquecimento de peptídeos e espectrometria de massa

A ubiquitinação é uma modificação pós-translacional que desempenha papéis importantes em processos celulares e é fortemente coordenada pela deubiquitinação. Os defeitos em ambas as reações fundamentam patologias humanas. Nós fornecemos protocolos para a realização de ubiquitinação e reação de deubiquitinação in vitro usando componentes purificados.

Ensaios de Ubiquitinação e Deubiquitinação in vitro de histonas Nucleossomal

Este protocolo visa estabelecer proteomas específicos de ubiquitina (Ub) e ubiquitina (Ubls), a fim de identificar alterações desse tipo de modificações pós-translacional (PTMs), associadas a uma condição específica, como tratamento ou fenótipo.

Perfil de Ubiquitin e Ubiquitin-like Modificações pós-translacionais dependentes e identificação de alterações significativas

O objetivo deste manuscrito é apresentar um esboço para os estudos bioquímicos e funcionais abrangentes das ligaduras de ubiquitina ring-tipo E3. Este pipeline multipasso, com protocolos detalhados, valida uma atividade enzimática da proteína testada e demonstra como vincular a atividade à função.

Caracterização funcional do RING-Tipo E3 Ubiquitin Ligases In Vitro e In Planta

Este método descreve a avaliação das mudanças globais na topologia da cadeia de ubiquitina. A avaliação é realizada pela aplicação de uma abordagem de proteômica direcionada baseada em espectrometria de massa.

Análise da cadeia de Ubiquitin por monitoramento de reação paralela

O presente estudo fornece protocolos de ensaio de on-lona in vitro detalhados para a análise da atividade catalítica da ubiquitina E3. Proteínas recombinantes foram expressas usando sistemas procarióticos como a cultura Escherichia coli.

In vitro Análise da Função Ligase E3 Ubiquitin

A ubiquitinação é um regulador crítico das funções intracelulares das proteínas. Aqui, descrevemos dois métodos de lise celular para detectar os níveis de ubiquitinação de proteínas do substrato em células de mamíferos e comparamos sua eficácia na análise dos níveis de ubiquitinação. A superexpressão proteica em células HEK293T foi induzida por transfecção transitória, e proteínas ubiquitinadas foram detectadas por análise western blot.

Estratégias comparativas para detecção de ubiquitinação em lisados celulares de mamíferos usando SMAD2/SMURF2 como modelo

Este protocolo descreve um método para ubiquitinar Streptococcus pneumoniae usando lisado celular de mamífero ou complexo enzimático puro de ubiquitina, seguido de tratamento com complexo proteico purificado VCP/p97-UFD1-NPLOC4 para avaliar sua atividade bacteriolítica, possibilitando o estudo de efetores imunes dependentes de ubiquitina.

In vitro Reconstituição da Ubiquitinação Bacteriana e Eliminação Mediada por VCP/p97

Aprenda a avaliar a ubiquização de substratos por ligase E3 em lisados de células mamárias HEK293T usando imunoprecipitação e Western blot. Este método acessível auxilia no estudo de doenças como câncer e distúrbios neurológicos.

Avaliação da Ubiquização substrato por E3 Ubiquitin-ligase em Lysates de Células Mamárias

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