Name: Imagem da migração de neutrófilos na pele de camundongos para investigar a remodelação da membrana subcelular em condições fisiológicas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 41 s
Description: Aprenda a visualizar a remodelação dinâmica da membrana plasmática durante a migração de neutrófilos em camundongos vivos usando microscopia subcelular intravital. Este método permite estudar interações celulares em tempo real.

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Esta pesquisa foi apoiada pelo programa de pesquisa interna dos Institutos Nacionais de Saúde, Instituto Nacional do Câncer, Centro de Pesquisa do Câncer.

<ol><li>Trepat, X., Chen, Z., Jacobson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Comprehensive+Physiology%22%5BJournal%5D)">Cell migration.</a> Comprehensive Physiology. 2 (4), 2369-2392 (2012).</li>
<li>Oudin, M. J., Weaver, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physical+and+chemical+gradients+in+the+tumor+microenvironment+regulate+tumor+cell+invasion%2C+migration%2C+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Symposia+on+Quantitative+Biology%22%5BJournal%5D)">Physical and chemical gradients in the tumor microenvironment regulate tumor cell invasion, migration, and metastasis.</a> Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 81, 189-205 (2016).</li>
<li>Devreotes, P., Horwitz, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+networks+that+regulate+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Signaling networks that regulate cell migration.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (8), 005959(2015).</li>
<li>Alexandrova, A. Y., Chikina, A. S., Svitkina, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+cytoskeleton+in+mesenchymal-to-amoeboid+transition+of+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22International+Review+of+Cell+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Actin cytoskeleton in mesenchymal-to-amoeboid transition of cancer cells.</a> International Review of Cell and Molecular Biology. 356, 197-256 (2020).</li>
<li>Masedunskas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Bioarchitecture%22%5BJournal%5D)">Intravital microscopy.</a> Bioarchitecture. 2 (5), 143-157 (2012).</li>
<li>Wagner, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWagner%2C+R+%22Explanatory+panels+on+physiology+and+development+history+1839%22">Explanatory panels on physiology and development history 1839</a>. , Leopold Voss. Leipzig, Germany. (1839).</li>
<li>Yaniv, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+lymphatic+development+in+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Live imaging of lymphatic development in the zebrafish.</a> Nature Medicine. 12 (6), 711-716 (2006).</li>
<li>Vinegoni, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesoscopic+fluorescence+tomography+for+in-vivo+imaging+of+developing+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Mesoscopic fluorescence tomography for in-vivo imaging of developing Drosophila.</a> Journal of Visualized Experiments. (30), e1510(2009).</li>
<li>Sack, F. -U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+microscopy+of+pulmonary+microcirculation+after+single+lung+transplantation+in+pigs%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation+Proceedings%22%5BJournal%5D)">Intravital microscopy of pulmonary microcirculation after single lung transplantation in pigs.</a> Transplantation Proceedings. 38 (3), 737-740 (2006).</li>
<li>Rehberg, M., Krombach, F., Pohl, U., Dietzel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+3D+visualization+of+cellular+and+tissue+structures+in+intact+muscle+with+second+and+third+harmonic+generation+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Label-free 3D visualization of cellular and tissue structures in intact muscle with second and third harmonic generation microscopy.</a> PloS One. 6 (11), 28237(2011).</li>
<li>Weigelin, B., Bakker, G. -J., Friedl, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+third+harmonic+generation+microscopy+of+collective+melanoma+cell+invasion%3A+Principles+of+interface+guidance+and+microvesicle+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Intravital%22%5BJournal%5D)">Intravital third harmonic generation microscopy of collective melanoma cell invasion: Principles of interface guidance and microvesicle dynamics.</a> Intravital. 1, 32-43 (2012).</li>
<li>Poole, J. J. A., Mostaço-Guidolin, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+microscopy+and+the+extracellular+matrix+structure%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Optical microscopy and the extracellular matrix structure: A review.</a> Cells. 10 (7), 1760(2021).</li>
<li>Weigelin, B., Bakker, G. -J., Friedl, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Third+harmonic+generation+microscopy+of+cells+and+tissue+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Third harmonic generation microscopy of cells and tissue organization.</a> Journal of Cell Science. 129 (2), 245-255 (2016).</li>
<li>Ebrahim, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+polyhedral+actomyosin+lattices+remodel+micron-scale+curved+membranes+during+exocytosis+in+live+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Dynamic polyhedral actomyosin lattices remodel micron-scale curved membranes during exocytosis in live mice.</a> Nature Cell Biology. 21 (8), 933-939 (2019).</li>
<li>Shitara, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cdc42+negatively+regulates+endocytosis+during+apical+membrane+maintenance+in+live+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Cdc42 negatively regulates endocytosis during apical membrane maintenance in live animals.</a> Molecular Biology of the Cell. 30 (3), 324-332 (2019).</li>
<li>Masedunskas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+for+the+actomyosin+complex+in+regulated+exocytosis+revealed+by+intravital+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Role for the actomyosin complex in regulated exocytosis revealed by intravital microscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (33), 13552-13557 (2011).</li>
<li>Subramanian, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+LTB4-BLT1+axis+regulates+actomyosin+and+%CE%B22-integrin+dynamics+during+neutrophil+extravasation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The LTB4-BLT1 axis regulates actomyosin and β2-integrin dynamics during neutrophil extravasation.</a> The Journal of Cell Biology. 219 (10), 201910215(2020).</li>
<li>Yan, S. L. S., Hwang, I. -Y., Kamenyeva, O., Kehrl, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+F-Actin+filament+organization+during+lymphocyte+transendothelial+and+interstitial+migration+revealed+by+intravital+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">In vivo F-Actin filament organization during lymphocyte transendothelial and interstitial migration revealed by intravital microscopy.</a> iScience. 16, 283-297 (2019).</li>
<li>Porat-Shliom, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+tissue-wide+synchronization+of+mitochondrial+metabolic+oscillations%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">In vivo tissue-wide synchronization of mitochondrial metabolic oscillations.</a> Cell Reports. 9 (2), 514-521 (2014).</li>
<li>Takihara, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+axonal+transport+of+mitochondria+in+the+diseased+and+aged+mammalian+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of axonal transport of mitochondria in the diseased and aged mammalian CNS.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (33), 10515-10520 (2015).</li>
<li>Calvo-Rodriguez, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+mitochondrial+calcium+levels+associated+with+neuronal+death+in+a+mouse+model+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Increased mitochondrial calcium levels associated with neuronal death in a mouse model of Alzheimer's disease.</a> Nature Communications. 11, 2146(2020).</li>
<li>Lämmermann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+swarms+require+LTB4+and+integrins+at+sites+of+cell+death+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Neutrophil swarms require LTB4 and integrins at sites of cell death in vivo.</a> Nature. 498 (7454), 371-375 (2013).</li>
<li>Li, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+multiphoton+imaging+of+immune+responses+in+the+mouse+ear+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Intravital multiphoton imaging of immune responses in the mouse ear skin.</a> Nature Protocols. 7 (2), 221-234 (2012).</li>
<li>Swamydas, M., Lionakis, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+purification+and+labeling+of+mouse+bone+marrow+neutrophils+for+functional+studies+and+adoptive+transfer+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3AJoVE%22%5BJournal%5D)">Isolation, purification and labeling of mouse bone marrow neutrophils for functional studies and adoptive transfer experiments.</a> Journal of Visualized Experiments:JoVE. (77), e50586(2013).</li>
<li>Rose, S., Misharin, A., Perlman, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+Ly6C%2FLy6G-based+strategy+to+analyze+the+mouse+splenic+myeloid+compartment%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry.+Part+A%3A+The+Journal+of+the+International+Society+for+Analytical+Cytology%22%5BJournal%5D)">A novel Ly6C/Ly6G-based strategy to analyze the mouse splenic myeloid compartment.</a> Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 81 (4), 343-350 (2012).</li>
<li>Lakschevitz, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+neutrophil+surface+marker+changes+in+health+and+inflammation+using+high-throughput+screening+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Identification of neutrophil surface marker changes in health and inflammation using high-throughput screening flow cytometry.</a> Experimental Cell Research. 342 (2), 200-209 (2016).</li>
<li>Oh, H., Siano, B., Diamond, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+Isolation+Protocol%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3AJoVE%22%5BJournal%5D)">Neutrophil Isolation Protocol.</a> Journal of Visualized Experiments:JoVE. (17), e745(2008).</li>
<li>MATLAB - Bio-Formats 6.1.0 documentation. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://docs.openmicroscopy.org/bio-formats/6.1.0/users/matlab/index.html">https://docs.openmicroscopy.org/bio-formats/6.1.0/users/matlab/index.html</a> (2022).</li>
<li>Otsu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Threshold+selection+method+from+gray-level+histograms%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Transactions+on+Systems%2C+Man%2C+and+Cybernetics%22%5BJournal%5D)">A Threshold selection method from gray-level histograms.</a> IEEE Transactions on Systems, Man, and Cybernetics. 9, 62-66 (1979).</li>
<li>Crocker, J. C., Grier, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+of+digital+video+microscopy+for+colloidal+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Colloid+and+Interface+Science%22%5BJournal%5D)">Methods of digital video microscopy for colloidal studies.</a> Journal of Colloid and Interface Science. 179, 298-310 (1996).</li>
<li>Xu, C., Prince, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Snakes%2C+shapes%2C+and+gradient+vector+flow%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Transactions+on+Image+Processing%3A+A+Publication+of+the+IEEE+Signal+Processing+Society%22%5BJournal%5D)">Snakes, shapes, and gradient vector flow.</a> IEEE Transactions on Image Processing: A Publication of the IEEE Signal Processing Society. 7 (3), 359-369 (1998).</li>
<li>Driscoll, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+image+analysis+of+nuclear+shape%3A+what+can+we+learn+from+a+prematurely+aged+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Aging%22%5BJournal%5D)">Automated image analysis of nuclear shape: what can we learn from a prematurely aged cell.</a> Aging. 4 (2), 119-132 (2012).</li>
<li>Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+global+double-fluorescent+Cre+reporter+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">A global double-fluorescent Cre reporter mouse.</a> Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).</li>
<li>Tauer, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advantages+and+risks+of+multiphoton+microscopy+in+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Physiology%22%5BJournal%5D)">Advantages and risks of multiphoton microscopy in physiology.</a> Experimental Physiology. 87 (6), 709-714 (2002).</li>
<li>Débarre, D., Olivier, N., Supatto, W., Beaurepaire, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitigating+phototoxicity+during+multiphoton+microscopy+of+live+Drosophila+embryos+in+the+1.0-1.2+%C2%B5m+wavelength+range%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Mitigating phototoxicity during multiphoton microscopy of live Drosophila embryos in the 1.0-1.2 µm wavelength range.</a> PloS One. 9 (8), 104250(2014).</li>
<li>Masedunskas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+microscopy%3A+a+practical+guide+on+imaging+intracellular+structures+in+live+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Bioarchitecture%22%5BJournal%5D)">Intravital microscopy: a practical guide on imaging intracellular structures in live animals.</a> Bioarchitecture. 2 (5), 143-157 (2012).</li>
<li>Ng, L. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+the+neutrophil+response+to+sterile+tissue+injury+in+mouse+dermis+reveals+a+three-phase+cascade+of+events%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Investigative+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Visualizing the neutrophil response to sterile tissue injury in mouse dermis reveals a three-phase cascade of events.</a> The Journal of Investigative Dermatology. 131 (10), 2058-2068 (2011).</li>
<li>Wu, X. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Melanoregulin+regulates+a+shedding+mechanism+that+drives+melanosome+transfer+from+melanocytes+to+keratinocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Melanoregulin regulates a shedding mechanism that drives melanosome transfer from melanocytes to keratinocytes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (31), 2101-2109 (2012).</li>
</ol>

Os autores declaram não haver interesses financeiros concorrentes.

Apesar de décadas de avanços no campo da migração celular e remodelação da membrana, muito poucos estudos empregaram a IVM para visualizar características subcelulares em animais vivos. Os procedimentos descritos neste protocolo fornecem uma ferramenta poderosa para obter novos insights sobre a migração de neutrófilos em animais vivos e, mais especificamente, sobre a remodelação da membrana plasmática durante esse processo. Essa abordagem possibilita investigar a migração de neutrófilos em condições fisiológicas, considerando a complexidade inerente do microambiente tecidual. De fato, o uso de MPM permite a visualização de múltiplas características dentro do tecido hospedeiro usando uma combinação de cepas de camundongos que expressam marcadores fluorescentes selecionados, marcação de tecido exógeno, excitação de fluorescência endógena e sinais gerados por SHG ou THG12,13.
Um problema potencial a ser considerado neste procedimento é o fotodano. Embora o MPM seja geralmente mais seguro do que a microscopia confocal em relação ao fotobranqueamento e fototoxicidade, deve-se ter cuidado ao obter imagens de tecidos vivos34. A fototoxicidade pode prejudicar drasticamente os resultados, criando artefatos de imagem que variam de pequenas manchas brilhantes a áreas maiores de tecido danificado ou inibindo / estimulando uma variedade de vias intracelulares. Para evitar a fototoxicidade, a potência do laser deve ser mantida no mínimo e os controles apropriados devem ser projetados para verificar se as condições fisiológicas são mantidas (por exemplo, medição do fluxo sanguíneo, sondas para estresse oxidativo)35,36. Além disso, nesse procedimento específico, que envolve a pele, as cepas albinas são altamente recomendadas, pois a melanina presente em animais de pêlo escuro é mais sensível à fototoxicidade 36,37,38.
Entre as principais limitações do procedimento estão o sistema de microscópio utilizado e a natureza dos neutrófilos. Embora o uso do MPM aumente significativamente a profundidade da imagem do tecido quando comparado com outras técnicas de microscopia de luz (por exemplo, disco confocal, giratório), a capacidade de visualizar a dinâmica subcelular na orelha é restrita às camadas mais externas do tecido (80-100 μm). Isso se deve ao intenso espalhamento de luz produzido pela espessa camada de ECM, dificultando a investigação da migração nas camadas mais profundas. Outra limitação é o fato de que os neutrófilos têm vida muito curta e não podem ser mantidos em cultura por tempo suficiente para realizar técnicas de edição de genes. Isso pode ser superado pela engenharia de camundongos para produzir neutrófilos sem genes específicos ou abrigando mutações selecionadas, o que obviamente aumenta os custos e a duração da pesquisa.
Os procedimentos descritos aqui, embora projetados para investigar a dinâmica da membrana, podem ser adaptados para abordar qualquer questão biológica celular não apenas em neutrófilos, mas também em outros tipos de células imunes e células migratórias. As informações coletadas por meio de IVM de baixa ampliação sobre comportamentos celulares (por exemplo, fenótipo migratório, velocidade celular e direcionalidade22) podem ser complementadas e correlacionadas com informações mecanicistas adquiridas por meio do ISMic sobre reposicionamento de organelas, secreção de proteínas, endocitose, dinâmica nuclear, dinâmica do cálcio, organização do citoesqueleto e netose. O uso de manipulações farmacológicas e/ou genéticas pode destacar o papel de vias moleculares específicas no processo de interesse, tornando esta uma abordagem única e muito poderosa.

A migração celular dirigida é um evento crítico que ocorre durante diferentes processos fisiológicos e patológicos, incluindo desenvolvimento, resposta imune, reparo tecidual e iniciação, progressão e disseminação do tumor 1,2. Esse processo depende de sinais quimiotáticos extracelulares específicos detectados por seus receptores cognatos na membrana plasmática e, em seguida, transduzidos em intrincados sinais intracelulares. Essas vias, por sua vez, ativam a migração celular por meio de uma série de respostas, incluindo ativação local do citoesqueleto, tráfego e remodelação da membrana e polarização celular3. Dois tipos distintos de migração celular foram bem caracterizados: mesenquimal e amebóide4. A migração mesenquimal é relativamente lenta (<1 μm/min), depende de forte adesão entre as células e a matriz extracelular (MEC) e depende da degradação da matriz induzida por metaloproteases. Em contraste, a migração amebóide, uma característica das células imunes que respondem rapidamente a estímulos inflamatórios, é mais rápida (>10 μm/min) e utiliza aderências fracas para navegar pela MEC. Independentemente da modalidade, a migração celular requer uma remodelação constante da membrana plasmática, resultando na geração de estruturas protrusivas na borda de ataque das células, que são fortemente coordenadas com a retração da membrana na parte traseira1.
Para desvendar os mecanismos moleculares subjacentes a esses processos subcelulares, é fundamental visualizar a dinâmica das membranas nas células migratórias em uma resolução temporal e espacial apropriada. Além disso, como a remodelação da membrana é fortemente influenciada pelas propriedades do microambiente tecidual ao redor das células migratórias, é crucial obter imagens desse processo diretamente no tecido nativo, em animais vivos. Isso é feito usando microscopia intravital (IVM)5. A primeira imagem de MIV foi realizada ~ 200 anos atrás, quando o extravasamento de leucócitos foi visualizado usando um microscópio de transiluminação simples6 e, posteriormente, a MIV foi usada principalmente em organismos modelo semitransparentes, como peixe-zebra e Drosophila 7,8. Nas últimas duas décadas, a MIV tem sido usada com sucesso para investigar processos celulares em camundongos, ratos e mamíferos maiores, como porcos 5,9. Isso foi possível devido a 1) desenvolvimentos significativos na microscopia confocal e multifóton (MP) e 2) o aumento da tecnologia de edição de genes, como o CRISPR-Cas9, que permitiu a engenharia rápida de uma variedade de modelos animais para expressar proteínas e repórteres marcados com fluorescência. Além disso, a visualização de células individuais e seu microambiente durante processos como iniciação tumoral, migração celular e resposta imune tem sido possibilitada por outras formas de marcação exógena, como a introdução sistêmica de corantes para marcar a vasculatura10,11, e a excitação de moléculas endógenas, como o colágeno por meio da Segunda Geração Harmônica (SHG)10, 12 e fibras nervosas através da Terceira Geração Harmônica (THG)11,13. Finalmente, um aprimoramento nas técnicas para minimizar os artefatos de movimento devido aos batimentos cardíacos e à respiração levou ao desenvolvimento da microscopia subcelular intravital (ISMic), que permitiu aos pesquisadores obter imagens e investigar vários eventos subcelulares diretamente em animais vivos em um nível de resolução semelhante aos observados in vitro 14,15,16,17 . Exemplos de ISMic incluem a investigação da dinâmica do citoesqueleto durante a exocitose 14,15,16,17 e endocitose 15, remodelação dinâmica do citoesqueleto durante a migração celular17,18, localização e metabolismo mitocondrial19,20 e sinalização de cálcio no cérebro21.
Este protocolo detalha as diferentes etapas e procedimentos para investigar a remodelação da membrana celular em uma resolução subcelular durante a migração de neutrófilos na pele da orelha de um camundongo vivo usando ISMic. Essa abordagem é baseada em protocolos descritos anteriormente 22,23 e adaptada para alcançar maior resolução espacial e temporal.

<table><tbody><tr><td>Tubos de 1,5 mL</td><td>USA Scientific</td><td>4036-3204</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de 15 mL</td><td>Corning</td><td>430766</td><td></td></tr><tr><td>seringa de 1 mL</td><td>Covidien</td><td>8881501400</td><td></td></tr><tr><td>agulha de 27 G</td><td>Kendall</td><td>827112</td><td></td></tr><tr><td>conjunto de infusão alada de 27 G</td><td>Terumo</td><td>SV*27EL</td><td></td></tr><tr><td>objetiva de 30x</td><td>Olympus</td><td>UPLSAPO30XS</td><td>1,05 NA, imersão em óleo de silício</td></tr><tr><td>40x objetiva</td><td>Olympus</td><td>UPLSAPO40XS</td><td>1,23 NA, imersão em óleo de silício</td></tr><tr><td>pratos de 60 mm</td><td>Falcon</td><td>353002</td><td></td></tr><tr><td>seringa de 6 mL</td><td>Kendall</td><td>8881516937</td><td></td></tr><tr><td>Acepromazina (10 mg/mL)</td><td>Vet one</td><td>13985-587-50</td><td></td></tr><tr><td>ACK lise buffer</td><td>Qualidade Biológica</td><td>118-156-101</td><td></td></tr><tr><td>Balance</td><td>E</td><td>EK-1200A</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9647</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de célula 40 &micro; m</td><td>Sigma Aldrich</td><td>CLS431750</td><td></td></tr><tr><td>Fiji</td><td>ImageJ</td><td>N/A</td><td>Software de visualização/análise de imagem</td></tr><tr><td>Fluoview Software</td><td>Olympus</td><td>N/A</td><td>Software de aquisição</td></tr><tr><td>FVB cepa de rato</td><td>Jackson</td><td>N/A</td><td>FVB fundo</td></tr><tr><td>Sistema de anestesia a gás</td><td>Patterson veterinário</td><td>07-8915712</td><td>Link 7 modelo</td></tr><tr><td>Green Cell rastreador</td><td>Thermo</td><td>C2925</td><td>Solubilizado em grau de cultura de células DMSO para atingir a concentração de 1 mM (1000x)</td></tr><tr><td>Creme depilatório</td><td>Nair</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>HBSS (sem Ca2+, Mg2+)</td><td>Gibco</td><td>14175-095</td><td></td></tr><tr><td>HEPES 1 M pH 7.3</td><td>Qualidade Biológica</td><td>118-089-721</td><td></td></tr><tr><td>Histopaco 1077</td><td>Sigma Aldrich</td><td>10771-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Histopaque 1991</td><td>Sigma Aldrich</td><td>11191-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Imaris</td><td>Bitplane</td><td>N/A</td><td>Software de visualização/análise de imagem</td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Vet one</td><td>13985-528-40</td><td></td></tr><tr><td>Cetamina (100 mg/mL)</td><td>Vet one</td><td>13985-584-10</td><td></td></tr><tr><td>LyzM-cre x mT/mG</td><td>gerado no laboratório</td><td>N/A</td><td>C57BL/6J background</td></tr><tr><td>Micromanipulador manual</td><td>WPI</td><td>M3301R</td><td></td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>MatWorks</td><td>N/A</td><td>Software de análise</td></tr><tr><td>de linhagem de camundongo mtomato</td><td>gerada no laboratório</td><td>N/A</td><td>mT/mG, fundo FVB</td></tr><tr><td>Laser multifotônico</td><td>Espectros Física</td><td>Insight DS+</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio multifotônico</td><td>Olympus</td><td>MPE-RS</td><td></td></tr><tr><td>Nanofil 10 &micro; Seringa L</td><td>WPI</td><td>NANOFIL</td><td></td></tr><tr><td>Nanofil 33 G agulha</td><td>WPI</td><td>NF33BV-2</td><td></td></tr><tr><td>Aquecedor de objetiva</td><td>Bioptechs</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Controlador de aquecedor de objetiva</td><td>Bioptechs</td><td>150803</td><td></td></tr><tr><td>Pomada oftálmica</td><td>Major</td><td>NDC 0904-6488-38</td><td></td></tr><tr><td>Concentrador de oxigênio</td><td>Caire</td><td>VisionAire 5</td><td></td></tr><tr><td>PBS (sem Ca2+, Mg2+)</td><td>Qualidade Biológica</td><td>114-058-131</td><td></td></tr><tr>Qualidade<td>Salina</td><td>Biológica</td><td>114-055-101</td><td></td></tr><tr><td>Aquecedor de palco</td><td>Okolab</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Controlador de aquecedor de palco</td><td>Okolab</td><td>H401-T</td><td></td></tr><tr><td>Fita cirúrgica</td><td>3M</td><td>1538-1</td><td>Hipoalergênico</td></tr><tr><td>Chave de seringa</td><td>Harvard Aparelho</td><td>PHD Ultra</td><td></td></tr><tr><td>Almofadas de aquecimento</td><td>Parkland Scientific</td><td>A2789B</td><td></td></tr><tr><td>Bomba de aquecimento</td><td>Parkland Scientific</td><td>TP-700</td><td></td></tr><tr><td>Xilazina (100 mg/mL)</td><td>Vet one</td><td>13985-704-10</td><td></td></tr></tbody></table>

imagem da migração de neutrófilos na pele de camundongos para investigar a remodelação da membrana subcelular em condições fisiológicas

Imaging Neutrophil Migration in the Mouse Skin to Investigate Subcellular Membrane Remodeling Under Physiological Conditions

O estudo do recrutamento e função de células imunes em tecidos tem sido um campo muito ativo nas últimas duas décadas. Os neutrófilos estão entre as primeiras células imunes a atingir o local da inflamação e a participar da resposta imune inata durante a infecção ou dano tecidual. Até agora, a migração de neutrófilos foi visualizada com sucesso usando vários sistemas experimentais in vitro baseados em estimulação uniforme ou migração confinada sob agarose ou canais microfluídicos. No entanto, esses modelos não recapitulam o microambiente complexo que os neutrófilos encontram in vivo. O desenvolvimento de técnicas baseadas em microscopia multifotônica (MPM), como a microscopia subcelular intravital (ISMic), oferece uma ferramenta única para visualizar e investigar a dinâmica dos neutrófilos em resoluções subcelulares sob condições fisiológicas. Em particular, a orelha de um camundongo anestesiado vivo oferece uma vantagem experimental para acompanhar a migração intersticial de neutrófilos em tempo real devido à sua facilidade de acessibilidade e falta de exposição cirúrgica. O ISMic fornece a resolução óptica, a velocidade e a profundidade de aquisição necessárias para rastrear processos celulares e, mais importante, subcelulares em 3D ao longo do tempo (4D). Além disso, a imagem multimodal do microambiente intersticial (ou seja, vasos sanguíneos, células residentes, matriz extracelular) pode ser facilmente realizada usando uma combinação de camundongos transgênicos expressando marcadores fluorescentes selecionados, marcação exógena por meio de sondas fluorescentes, fluorescência intrínseca do tecido e sinais gerados por segundo / terceiro harmônico. Este protocolo descreve 1) a preparação de neutrófilos para transferência adotiva para a orelha do camundongo, 2) diferentes configurações para imagens subcelulares ideais, 3) estratégias para minimizar artefatos de movimento enquanto mantém uma resposta fisiológica, 4) exemplos de remodelação de membrana observados em neutrófilos usando ISMic e 5) um fluxo de trabalho para a análise quantitativa de remodelação de membrana em neutrófilos migratórios in vivo.

Aqui, dois conjuntos diferentes de resultados são apresentados para ilustrar o IVM clássico e o ISMic que fornecem resolução celular e subcelular, respectivamente. No primeiro exemplo, os neutrófilos foram purificados de um camundongo do tipo selvagem (WT), marcados com Cell Tracker Green para corar o citoplasma e injetados em um camundongo transgênico expressando uma proteína fluorescente direcionada à membrana plasmática (camundongo mTomato, também conhecido como mT / mG33, Figura 1 e Filme 1 e Filme 2). Este camundongo receptor permitiu a visualização de características estruturais no tecido da orelha, como vasos sanguíneos, células residentes e folículos pilosos (Figura 1C e Filme 1) por meio da abordagem baseada em MIV (etapa 6.8.1). As fibras colágenas, reveladas via SHG (detectadas na metade do comprimento de onda da excitação), foram dispostas em uma intrincada rede na derme, onde os neutrófilos foram injetados. Ao longo da borda dos folículos pilosos (HF), foi observada uma camada de células epiteliais (ou seja, queratinócitos). Ocasionalmente, artefatos de pêlos residuais resultando em depressão local da pele foram visualizados (H). As lesões induzidas pelo laser foram facilmente visualizadas devido à sua forte autofluorescência detectada em todos os canais e pelas alterações do arranjo do colágeno (Figura 1D). Uma visão mais completa da arquitetura 3D da pele e da localização dos neutrófilos injetados pode ser apreciada no Filme 1, que retrata uma pilha Z da pele das camadas externa para interna e uma renderização de volume 3D. A imagem de lapso de tempo mostrou os neutrófilos coletando amostras da pele da orelha e interagindo com a ECM e o tecido hospedeiro (Filme 2). A aquisição de imagens nessa resolução e a aquisição de uma pilha Z a cada 30 s permitem realizar o rastreamento celular e a medição de parâmetros de motilidade (ou seja, velocidade e direcionalidade), mas uma análise precisa e detalhada da remodelação da membrana é um desafio nessa resolução.
No segundo exemplo, a remodelação da membrana foi avaliada por meio da abordagem ISMic (etapa 6.8.2) usando neutrófilos que expressam mGFP purificados de camundongos LyzM-cre mT / mG e injetados em animais WT (Figura 2A, fluxograma experimental). Usando o protocolo ISMic (Filme 3 e imagens estáticas na Figura 2B) e após a lesão a laser, a remodelação dinâmica da membrana plasmática é observada durante a migração, e a formação de saliências da membrana na borda de ataque e a retração da parte traseira das células são claramente visualizadas (Figura 2 e Filme 3). As sequências de lapso de tempo destacadas no Filme 3 revelam a complexidade das interações com o ECM. De fato, os neutrófilos migraram através do espaço intersticial movendo-se ao longo das fibras ou nos espaços entre elas. Finalmente, aspectos quantitativos como as mudanças na curvatura e as mudanças de área na frente e atrás das células foram quantificados para cada ponto de tempo. Usando a célula descrita na Figura 2B como exemplo, a dinâmica local da membrana plasmática foi analisada usando um pipeline de algoritmo (consulte a etapa 7) com base na identificação de 100 pontos de contorno subjacentes à superfície da célula (Figura 3A). As mudanças na curvatura local (Figura 3B) e na área sublinhada por saliências da membrana plasmática (Figura 3C) foram calculadas para cada ponto de contorno e relatadas para cada período de tempo como quimógrafos (Figura 3D, E). Tanto a frente quanto a parte de trás das células mantêm uma curvatura maior do que a lateral das células (Figura 3D); mudanças de área negativas (retrações, regiões azuis) são mais aparentes na parte de trás das células do que na borda de ataque, onde as mudanças de área positivas são mais proeminentes (saliências, regiões vermelhas) (Figura 3E).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63581/63581fig01.jpg"> Figura 1: MIV de neutrófilos na pele da orelha do camundongo. (A) Desenho esquemático da configuração da orelha no estágio do microscópio. (B) Fluxograma experimental. (C) Imagem representativa da pele da orelha de um camundongo mTomato injetado com neutrófilos marcados com fluorescência, com diferentes projeções. Folículo piloso (HF), vaso sanguíneo (BV), epiderme (E), derme (D), camada basocelular (BCL) e artefato capilar (devido a um cabelo residual na superfície da pele, H). (D) Imagem representativa da pele do camundongo após uma lesão estéril por laser: canal azul (direita), canais verde e vermelho (meio), imagem mesclada (esquerda). A lesão é visível à esquerda da imagem por uma forte emissão de autofluorescência nos canais verde e vermelho, bem como uma ruptura da ECM observada pela formação de um buraco nas fibras de colágeno-I. Em C e D, Verde: neutrófilos; Vermelho: tecido hospedeiro de camundongo; Ciano: Colágeno-I SHG. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63581/63581fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63581/63581fig02.jpg"> Figura 2: Lapso de tempo de migração de neutrófilos mGFP em uma orelha de camundongo WT. (A) Fluxograma experimental. (B) Imagens estáticas representativas do filme 3. (C) Renderização de volume da mesma célula para visualizar a organização 3D da membrana. A área de alta dinâmica da membrana é ilustrada por uma seta (vermelha para retração e azul para protrusão). (D) Visualização aproximada e inclinada do volume celular renderizado. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63581/63581fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63581/63581fig03.jpg"> Figura 3: Pipeline de análise para quantificação da dinâmica da membrana coletada usando ISMic. (A) Determinação do contorno celular e repartição dos pontos de contorno (100 pontos de contorno) entre dois quadros consecutivos para neutrófilos mGFP descritos na Figura 2B. (B) Os limites coloridos representam a curvatura da membrana local determinada para cada ponto de limite. (C) A área local muda entre dois quadros consecutivos (atual: azul e próximo: vermelho). As áreas verdes representam os resultados de rastreamento do movimento local da membrana. As setas amarelas indicam a direção geral do deslocamento da membrana. (D) Cimógrafo de curvatura de limite da célula ao longo do tempo. O eixo vertical representa os índices de pontos de contorno onde 1 e 100 representam a parte traseira da célula de acordo com sua direção de migração. (E) Quimógrafo de mudança de área local refletindo a protrusão da membrana (vermelho) e a retração da membrana (azul) da célula ao longo do tempo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63581/63581fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Filme 1: Neutrófilos marcados em verde visualizados em uma orelha de camundongo mTomato usando IVM. Vermelho: mTomato tecido de camundongo hospedeiro. Ciano: Colágeno-I SHG; Verde: neutrófilo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63581/Movie1_Jove_final.mp4" target="_blank">Por favor, clique aqui para baixar este filme.</a>
Filme 2: IVM de neutrófilos migrando em uma pele de orelha de camundongo mTomato. Os vídeos são projeções de intensidade máxima de uma pilha de imagens adquirida por ͂27 min com uma taxa de quadros de 5 quadros/s. Vermelho: mTomato tecido de camundongo hospedeiro. Ciano: Colágeno-I SHG; Verde: neutrófilo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63581/Movie2_Jove_final.mp4" target="_blank">Por favor, clique aqui para baixar este filme.</a>
Filme 3: ISMic da remodelação da membrana durante a migração de neutrófilos em uma orelha de camundongo WT. Os vídeos são projeções de intensidade máxima de uma pilha de imagens adquirida por ͂8 min com uma taxa de quadros de 10 quadros/s. Vermelho: mTomato tecido de camundongo hospedeiro. Ciano: Colágeno-I SHG; Verde: neutrófilo mGFP; Verde claro: neutrófilo renderizado. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63581/Movie3_Jove_final.mp4" target="_blank">Por favor, clique aqui para baixar este filme.</a>

A migração de neutrófilos depende da remodelação rápida e contínua da membrana plasmática em resposta ao quimioatraente e suas interações com o microambiente extracelular. Descrito aqui é um procedimento baseado em Microscopia Subcelular Intravital para investigar a dinâmica de remodelação da membrana em neutrófilos injetados na orelha de camundongos anestesiados.

Imagem da migração de neutrófilos na pele de camundongos para investigar a remodelação da membrana subcelular em condições fisiológicas

The study of immune cell recruitment and function in tissues has been a very active field over the last two decades. Neutrophils are among the first ...

Este método descreve uma técnica para estudar a remodelação da membrana durante a migração de neutrófilos no animal vivo usando microscopia subcelular intravital. Este protocolo fornece uma abordagem única para estudar a dinâmica da membrana durante a migração animal sob condição física e para não envolver o microambiente tecidual. Esta técnica pode ser adaptada para abordar a remodelação da membrana e o reposicionamento dinâmico de órgãos do citoesqueleto e o tráfego de membrana em diferentes tipos de células e células migratórias.Para começar, adicione o corante fluorescente verde à suspensão de neutrófilos, purificada do camundongo selvagem em 1,5 mililitros de tubo revestido com BSA. Incubar durante 30 minutos à temperatura ambiente sob agitação suave num rotador de tubos. Dê três lavagens usando HBSS, seguidas de centrifugação a 400 vezes G em temperatura ambiente por cinco minutos e ressuspensão do pellet em um mililitro de solução salina balanceada de Hanks.Coloque esta suspensão no tubo revestido com BSA em um rotador de tubo sob agitação suave até o procedimento de injeção. Antes da injeção, ressuspenda o pellet celular em solução salina para atingir uma densidade de 2 milhões a 5 milhões de células por 20 microlitros. Transfira o animal anestesiado para uma almofada de aquecimento com 37 graus Celsius para manter a temperatura corporal.Depois de testar o reflexo de retirada da pata, remova os pelos da orelha usando um aparador fino para otimizar a qualidade da imagem. Coloque o animal de lado, segure a borda da orelha e alise-a ao longo da almofada de aquecimento usando a fita cirúrgica, depois encha uma seringa equipada com uma agulha de calibre 33 com a suspensão de neutrófilos e monte-a em um micromanipulador. Mova suavemente a agulha em direção à orelha e perfure lentamente a pele.Assim que a agulha estiver dentro da pele, empurre lentamente o pistão e forneça de dois a três microlitros de suspensão celular. Depois de repetir cuidadosamente a injeção em duas a três áreas diferentes da orelha, remova cuidadosamente a fita cirúrgica e deixe o animal recuperar a consciência sob supervisão. Deixe o animal descansar por uma hora antes da imagem para permitir que o tecido e as células se recuperem do procedimento de injeção.Certifique-se de que o microscópio esteja ligado e que a platina e as lentes sejam pré-aquecidas a 37 graus Celsius antes de colocar o animal anestesiado na platina do microscópio. Cubra o buraco no palco com uma lamínula de vidro. Mova o animal anestesiado para o palco com cuidado.Se a imagem for planejada para mais de uma hora, aplique a pomada oftálmica e proteja o sistema de perfusão baseado em infusão alada. Coloque uma gota de solução salina no centro da lamínula e coloque a orelha injetada de neutrófilos em cima dela. Alise suavemente a orelha usando um cotonete estéril no centro da lamínula para remover bolsas de ar.Prenda a orelha pressionando suavemente uma vara de madeira na lateral da orelha mais perto da cabeça do animal e prendendo-a com fita adesiva. Em seguida, encontre uma área de interesse usando a ocular do microscópio e mude para o modo de aquisição de vários fótons. Defina o comprimento de onda de excitação do laser para 900 a 930 nanômetros para permitir a aquisição simultânea de corante fluorescente verde, mTomato e colágeno-I.Em seguida, defina o conjunto apropriado de espelhos e combinações de filtros nos detectores para coletar a luz emitida. Determine a configuração mais apropriada para a configuração de hardware. Mesmo que as células migratórias possam ser rastreadas com intervalos de 30 segundos a um minuto, a imagem de eventos subcelulares com uma velocidade maior de pelo menos menos dez segundos em intervalos.Na abordagem clássica de microscopia intravital, use uma lente de 30X e um scanner Galvo com um tamanho de imagem de 512 por 512 pixels para rastrear a migração celular e investigar o tecido do camundongo hospedeiro e defina o deslocamento do eixo Z usando o estágio motorizado com um tamanho de passo de dois micrômetros para permitir a imagem de um volume de 30 micrômetros de profundidade a cada 30 segundos. Na abordagem de microscopia subcelular intravital, use uma lente de 40X e um scanner de ressonância com média de três vezes para obter imagens da remodelação da membrana altamente dinâmica com maior ampliação e resolução. Defina também o deslocamento do eixo Z usando um piezo com um tamanho de passo de um micrômetro, permitindo imagens de volume de 20 micrômetros de profundidade a cada quatro a cinco segundos.Induza uma lesão por laser estéril para desencadear a migração de neutrófilos, focalizando um laser de excitação de alta potência em uma área estreita de 20 por 20 micrômetros por 10 segundos. Identifique a lesão induzida por laser por seus fortes sinais autofluorescentes que aparecem em todos os canais e pela alteração resultante do arranjo de colágeno. Salve os dados no final da experimentação para análises posteriores.O camundongo receptor permitiu visualizar características estruturais no tecido da orelha, como vasos sanguíneos, células residentes e folículos pilosos por meio de uma abordagem baseada em microscopia intravital. As lesões induzidas pelo laser foram facilmente visualizadas devido à sua forte autofluorescência detectada em todos os canais e pelas alterações do arranjo de colágeno. Uma visão completa da arquitetura tridimensional da pele e a localização dos neutrófilos injetados retratam uma pilha Z da pele das camadas externa para interna EM uma renderização de volume tridimensional.A imagem de lapso de tempo mostrou os neutrófilos coletando amostras da pele da orelha e interagindo com a matriz intracelular e o tecido hospedeiro. Usando a microscopia subcelular intravital, a remodelação dinâmica da membrana plasmática durante a migração, a formação de saliências da membrana na borda de ataque e a retração da parte traseira das células são claramente visualizadas. As sequências de lapso de tempo revelam a complexidade das interações com a matriz intracelular.A dinâmica local da membrana plasmática foi analisada usando um pipeline de algoritmo baseado na identificação de 100 pontos de contorno subjacentes à superfície celular. As mudanças na curvatura local e na área sublinhada pelas saliências da membrana plasmática foram calculadas para cada ponto de contorno e relatadas para cada período de tempo como quimógrafos. Tanto a frente quanto a parte de trás das células mantêm uma curvatura mais alta do que a lateral das células.As mudanças negativas na área são mais aparentes na parte de trás das células do que na borda de ataque, onde as mudanças positivas na área são mais proeminentes. Após a imagem, o tecido pode ser coletado, fixado e processado para coloração para avaliar melhor o alvo de interesse e elucidar os mecanismos. Este procedimento projetado para obter imagens da dinâmica da membrana pode ser adaptado para abordar questões mais amplas de biologia celular em diferentes tipos de células e células migratórias em seus respectivos ambientes.

imaging-neutrophil-migration-mouse-skin-to-investigate-subcellular

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Aqui, descrevemos um método não invasivo de dois fótons abordagem microscopia (2P) para estudo de leucócitos homing na pata do rato. Discutimos os aspectos técnicos de nossa preparação tissular e andar o leitor através de um experimento típico de configuração inicial para coleta de execução e de dados.

Não-invasiva por imagem do Homing leucócitos e Migração In vivo</em

Nós descrevemos um protocolo de brightfield microscopia intravital para medir a dinâmica interações neutrófilos-célula endotelial durante o recrutamento de neutrófilos em resposta à fonte de um chemoattractant neutrófilos in vivo. Neutrófilos rastejando intraluminal, a migração transendotelial e quimiotaxia em tecido muscular do rato cremaster são visualizados com o tempo decorrido, fotografia, vídeo e rastreados com ImageJ.

Rastreamento Crawling neutrófilos Intraluminal, migração transendotelial e Quimiotaxia em tecido por Microscopia intravital Vídeo

Este vídeo demonstra imagens in vivo para estudar a dinâmica de recrutamento de neutrófilos em um local de infecção em um camundongo transgênico imunocomprometido com neutrófilos que expressam GFP. Envolve a injeção de bactérias luminescentes para causar uma infecção. Isso leva ao recrutamento de neutrófilos para o local da infecção, cujo rastreamento é feito por imagem.

Monitoramento da dinâmica de recrutamento de neutrófilos e carga bacteriana no local da infecção em um modelo murino

Os leucócitos atravessam a monocamada endotelial utilizando o paracelular ou o percurso intracelular. Foi desenvolvido um ensaio simples para seguir a distribuição de juncional endógeno VE-caderina e PECAM-1 durante a migração transendotelial de leucócitos sob fluxo fisiológico para discriminar entre as duas vias de transmigração.

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Imagem da migração de neutrófilos na pele de camundongos para investigar a remodelação da membrana subcelular em condições fisiológicas (Vídeo) | JoVE Journal

Imagem da migração de neutrófilos na pele de camundongos para investigar a remodelação da membrana subcelular em condições fisiológicas

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