Avaliação de um Biomarcador Confiável em um Modelo de Sepse de Camundongo Induzido por Ligadura Cecal e Punção
9 de dezembro de 2022
Este protocolo apresenta os detalhes operatórios da ligadura e punção cecal (FLP) em um modelo de sepse em camundongo. O CLP é uma das técnicas mais utilizadas para criar um modelo animal de sepse. Portanto, um protocolo CLP padronizado é necessário para a obtenção de resultados de pesquisa confiáveis.
O principal objetivo deste estudo é utilizar modelo de camundongo de ligadura cecal e sepse induzida por punção para avaliar biomarcadores sanguíneos confiáveis de sepse. A ligadura e punção cecal, ou CLP em suma, é um modelo clinicamente relevante de sepse. A FLP é um modelo comumente usado na pesquisa de sepse.
A histona H3 citrulinada, ou CitH3, origina-se da NETose induzida por sepse. Nosso estudo anterior demonstra que o CitH3 é um biomarcador diagnóstico confiável de sepse. Selecione camundongos machos C57BL/6.
Pesar o rato e anestesiar o rato por inalação de 1,5%isoflurano. Fixe o mouse em uma almofada de aquecimento. Aplique creme depilatório no abdômen e deixe por não mais de um minuto antes de remover o creme e o cabelo.
Prepare instrumentos cirúrgicos estéreis adequados para cirurgia de animais roedores. Desinfete a pele abdominal com iodo pelo menos três vezes. Cubra a área cirúrgica operatória com a cortina cirúrgica estéril adequada.
Use tesouras cirúrgicas estéreis para fazer uma incisão de aproximadamente dois centímetros na parede abdominal, ao longo da linha alba. Identifique e isole o ceco para fora da cavidade peritoneal com pinças estéreis. Ligue 75 volume do ceco com sutura de seda 4-0.
Não ligue os vasos sanguíneos mesentéricos. A ser observado, diferentes porcentagens de ceco ligado determinam a gravidade da sepse. 25% leva a uma sepse de baixo grau, 50% leva à sepse de grau médio e 75% leva a uma sepse de alto grau.
Perfure o ceco por uma perfuração através de uma perfuração com uma agulha de calibre 21 no ponto médio entre a extremidade da cauda e a ligadura. Esprema suavemente as fezes para fora do ceco através de orifícios de penetração. A ser observado, a quantidade de fezes espremidas na cavidade peritoneal deve ser consistente, uma vez que as fezes também determinam a gravidade da sepse.
Substitua o ceco, bem como as fezes na cavidade abdominal suavemente. Feche a camada muscular abdominal e a camada de pele com sutura de seda 6-0. Desinfete a incisão com iodo.
A injeção de cetoprofeno, cinco miligramas por quilograma, deve ser realizada no quadrante inferior esquerdo do abdômen para evitar o ceco. Coloque o mouse em uma almofada de aquecimento até a recuperação completa. O rato está alojado numa sala com temperatura controlada e tem acesso gratuito a alimentos e água.
Os animais serão eutanasiados por overdose de dióxido de carbono com sintomas de sepse, relevantes para os nossos desfechos predefinidos com base em nosso estudo apresentado. Os ratos são divididos aleatoriamente no grupo simulado, grupo FLP e CLP mais Cl-amidina ou grupo de tratamento YW3-56. Camundongos no grupo simulado recebem todos os procedimentos de FLP, exceto ligadura e punção do ceco.
Colher sangue periférico 24 horas de pós-operatório e preparar o soro através de centrifugação. A concentração de CitH3 foi determinada por western blotting e um kit ELISA autodesenvolvido. Como mostrado na figura dois, nenhum CitH3 foi detectado no grupo simulado.
Os níveis de CitH3 foram elevados após a inserção da FLP, o que foi atenuado pela inibição da DAP significativamente. Com base em nossos dados, concluímos que a CitH3 circulante é um biomarcador diagnóstico confiável de sepse.
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Visão Geral
Este protocolo apresenta os detalhes operacionais da ligadura e punção cecal (CLP) em um modelo murino de sepse. A CLP é uma das técnicas mais amplamente utilizadas para criar um modelo animal de sepse, exigindo um protocolo padronizado para resultados de pesquisa confiáveis.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biologia
- Pesquisa em Sepse
Contexto
- A ligadura e punção cecal (CLP) é um modelo clinicamente relevante de sepse.
- A CLP é comumente utilizada na pesquisa sobre sepse.
- Biomarcadores confiáveis são essenciais para o diagnóstico da sepse.
- A histona H3 citrulinada (CitH3) está associada à NETose induzida por sepse.
Objetivo do Estudo
- Avaliar biomarcadores sanguíneos confiáveis de sepse utilizando um modelo murino.
- Estabelecer um protocolo padronizado de CLP para garantir consistência na pesquisa.
- Investigar o potencial diagnóstico da CitH3 na sepse.
Métodos Utilizados
- Seleção de camundongos machos C57BL/6 para o estudo.
- Indução de sepse por ligadura e punção cecal.
- Avaliação de biomarcadores sanguíneos após a indução.
- Comparação dos níveis de CitH3 para avaliar a confiabilidade diagnóstica.
Resultados Principais
- Demonstração da CitH3 como biomarcador diagnóstico confiável.
- Protocolo CLP padronizado que produz resultados consistentes.
- Identificação da NETose induzida por sepse no modelo.
- Validação do modelo murino para pesquisas futuras sobre sepse.
Conclusões
- O modelo CLP é eficaz para o estudo da sepse.
- A CitH3 atua como um biomarcador promissor para o diagnóstico da sepse.
- Protocolos padronizados aumentam a confiabilidade da pesquisa.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Biomarcadores precoces confiáveis são essenciais para reduzir os riscos na descoberta de medicamentos para sepse e permitir a continuidade translacional de modelos pré-clínicos para pesquisas clínicas. O modelo de camundongo induzido por CLP, combinado com a medição quantitativa de CitH3, fornece uma plataforma padronizada para validação de alvos e investigação mecanicista na sepse. Essa abordagem sustenta a confiança preditiva e a triagem de portfólios em pontos críticos de inflexão no processo de descoberta.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Permite testes rigorosos de hipóteses sobre a fisiopatologia da sepse utilizando um modelo animal clinicamente relevante.
- Apóia a validação funcional de alvos ao quantificar CitH3 como biomarcador mecanicista da NETose.
- Facilita a desmistificação biológica e a priorização de alvos candidatos para desenvolvimento adicional.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Oferece um sistema reprodutível para avaliar terapêuticas candidatas direcionadas a mecanismos da sepse.
- Padroniza a quantificação de biomarcadores por meio de ensaios validados de ELISA e western blot para CitH3.
- Permite comparação confiável dos efeitos de intervenções entre grupos experimentais.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Alinha leituras de biomarcadores pré-clínicos às necessidades diagnósticas clínicas para sepse.
- Apoia a continuidade dos achados em modelos animais para estratégias de biomarcadores translacionais em humanos.
- Reduz o risco translacional ao estabelecer desfechos robustos e relevantes para a doença.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este modelo e fluxo de trabalho de biomarcadores integra a descoberta inicial, a identificação de compostos promissores e a validação pré-clínica na pesquisa de sepse.
- Biologia da Descoberta: Permite testar hipóteses mecanicistas e esclarecer vias envolvidas na NETose induzida por sepse.
- Triagem: Fornece leituras quantitativas de CitH3 para o desenvolvimento padronizado de ensaios e avaliação de compostos.
- Análises: Oferece medidas reprodutíveis de biomarcadores para comparar a eficácia de intervenções e a gravidade da doença.
- Pesquisa Translacional: Facilita a integração de dados pré-clínicos de biomarcadores com estratégias diagnósticas clínicas.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma padronizada e reutilizável para pesquisas contínuas sobre sepse e avaliação terapêutica.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva e reduz a ambiguidade mecanicista na validação de alvos em sepse.
- Valor Operacional: Melhora a reprodutibilidade e a padronização entre equipes de pesquisa e estudos.
- Valor Estratégico: Aprimora a tomada de decisões de avanço ou interrupção de projetos e a eficiência do capital ao permitir triagem precoce orientada por biomarcadores.
- Impacto no Portfólio: Apoia a priorização ajustada ao risco e o avanço de programas para sepse.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em cirurgia animal, desenvolvimento de ensaios de biomarcadores e análise quantitativa.
- Necessita de acesso a kits de ELISA validados, infraestrutura para western blotting e instalações animais padronizadas.
- Exige padronização rigorosa entre equipes dos parâmetros do procedimento de CLP e dos protocolos de medição de biomarcadores.
- A adaptação a outros modelos de doenças ou espécies pode exigir otimização e validação do protocolo.
- As limitações incluem a variabilidade do modelo conforme a técnica cirúrgica e a necessidade de critérios de ponto final consistentes.
