Name: Proteômica por Espectrometria de Massas Guiada por Linhagem Celular no Embrião em Desenvolvimento (Rã) (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 18 s
Description: Aprenda análise proteômica guiada por linhagem celular em embriões de Xenopus laevis usando espectrometria de massas. Este método revela mecanismos moleculares do desenvolvimento com resolução espacial e temporal.

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Somos gratos a Jie Li (University of Maryland, College Park) pelas valiosas discussões sobre dissociação embrionária e FACS. Agradecemos a Vi M. Quach e Camille Lombard-Banek pelo auxílio na preparação de amostras e coleta de dados em estudos anteriores exemplificando as aplicações proteômicas destacadas neste protocolo. Partes deste trabalho foram apoiadas pela National Science Foundation sob o número de prêmio IOS-1832968 CAREER (para P.N.), os Institutos Nacionais de Saúde sob o número de prêmio R35GM124755 (para P.N.), o Programa de Parceria do Instituto Nacional do Câncer da Universidade de Maryland (para P.N.) e os prêmios de pesquisa da Fundação COSMOS Club (para A.B.B. e L.R.P.).

Os autores declaram não haver interesses concorrentes.

Este protocolo possibilita a caracterização da expressão de proteínas em linhagens celulares identificadas em embriões da espécie Xenopus. Derivada do HRMS, a metodologia combina especificidade requintada na identificação molecular, capacidade de detecção de multiproteínas sem sondas moleculares (geralmente centenas a milhares de proteínas diferentes) e capacidade de quantificação. A adaptabilidade a ferramentas clássicas e fluxos de trabalho em (neuro)biologia celular e de desenvolvimento expande a proteômica d...

Nossa compreensão da diferenciação celular e da gênese de tecidos e órgãos é o resultado de décadas de elaboradas telas direcionadas de genes e seus produtos. Aumentar nosso conhecimento de todas as biomoléculas e suas quantidades durante eventos celulares importantes ajudaria a desvendar mecanismos moleculares que controlam o padrão espacial e temporal do plano corporal dos vertebrados. Tecnologias que permitem amplificação molecular e sequenciamento são agora capazes de relatar rotineiramente um grande número de genes e transcritos, apoiando estudos orientados por hipóteses em pesquisa biológica básica e translacional. Para entender os sistemas em desenvolvimento, uma complexa relação entre transcrição e tradução defende a análise direta de múltiplas proteínas e suas modificações pós-traducionais. A proteômica global utilizando sistemas biológicos in vitro, como as células-tronco pluripotentes induzidas, começou a delinear mecanismos de indução tecidual 1,2. Em organismos complexos, como o embrião de vertebrados, o desenvolvimento depende de gradientes morfogênicos no contexto do espaço e do tempo3. Conclui-se que obter conhecimento das mudanças proteômicas à medida que as células se diferenciam para formar tecidos especializados, como tecidos neurais, oferece uma chave para desbloquear programas moleculares que controlam o desenvolvimento normal e defeituoso e orientar a terapêutica de próxima geração.
A rã-de-garra vertebrada sul-africana (Xenopus laevis) é um modelo bem estabelecido em biologia celular e de desenvolvimento, neuro e regenerativa. O Prêmio Nobel de Fisiologia ou Medicina de Sir John Gurdon em 2012 4,5 pela descoberta da pluripotência do núcleo somático destacou a importância desse modelo para descobertasem estudos básicos e translacionais. Os embriões de Xenopus desenvolvem-se externamente à mãe, facilitando assim a manipulação direta de células, clones celulares e expressão gênica ao longo de vários estágios de desenvolvimento. A pigmentação assimétrica e as divisões celulares estereotipadas permitiram o mapeamento de mapas reprodutíveis do destino do embrião de 16-6 e 32 célulasem 7,8 estádios. Para proteômica baseada em espectrometria de massa de alta resolução (EMAR), vantagens adicionais do modelo incluem tamanho relativamente grande (~1 mm de diâmetro), que produz conteúdo proteico abundante para análise (~130 μg em embriões em estágio inicial de clivagem, ~10 μg de conteúdo proteico em células isoladas do embrião de 16 células)9,10.
Atualmente, o HRMS é a tecnologia líder de escolha para detectar proteínas. Essa tecnologia permite a detecção e quantificação direta, sensível e específica de múltiplas, geralmente centenas a milhares de proteínas diferentes11. A proteômica ascendente por HRMS envolve uma série de etapas interconectadas. Após a extração da amostra de célula/tecido, as proteínas são digeridas com uma enzima proteolítica, como a tripsina (proteômica de baixo para cima). Os peptídeos resultantes são separados com base em suas diferentes propriedades físico-químicas, incluindo hidrofobicidade (cromatografia líquida de fase reversa, LC), carga líquida (cromatografia de troca iônica), tamanho (cromatografia de exclusão de tamanho) ou mobilidade eletroforética (eletroforese capilar, CE). Os peptídeos são então carregados (ionizados), tipicamente usando ionização por eletrospray (ESI), e íons peptídeos são detectados e sequenciados via fragmentação em fase gasosa por EMHR tandem. Os dados peptídicos resultantes são mapeados para o proteoma do organismo em estudo. Com a intensidade de sinal do peptídeo específico para proteínas (proteotípicas) correlacionando-se com a concentração, a quantificação da proteína pode ser realizada sem rótulos ou baseada em marcadores (quantificação multiplexação). A proteômica da HRMS fornece um rico recurso de informações sobre o estado molecular do sistema em estudo, permitindo a geração de hipóteses e estudos funcionais de acompanhamento.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63586/63586fig01v2.jpg"> Figura 1: Proteômica espaço-temporalmente escalável permitindo a proteômica de HRMS guiada por linhagem celular no embrião em desenvolvimento (rã). (A) Visualização do espécime (1) utilizando um estereomicroscópio (2) para injeção de uma célula identificada (inset), utilizando uma micropipeta fabricada (3) sob controle por um estágio de translação (4). (B) Amostragem subcelular da célula D 11 esquerda identificada em um embrião de16 células. (C) Dissecção de uma célula D11 inteira de um embrião de 16 células. (D) Traçado fluorescente (verde) das progênies D111 esquerda e direita de um embrião de 32 células para guiar a dissecção do ectoderma neural (NE) na gástrula (estágio 10) e isolamento do tecido descendente do girino usando FACS. Barras de escala: 200 μm para embriões, 1,25 mm para o frasco para injetáveis. As figuras foram adaptadas com permissão das referências 15,19,21,59. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63586/63586fig01largev2.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
O protocolo aqui apresentado permite a quantificação baseada em HRMS de um grande número de proteínas em células/tecidos identificados em embriões de X. laevis em desenvolvimento. A abordagem baseia-se na identificação celular precisa, mapas de destino celular reprodutíveis e metodologias estabelecidas para rastrear linhagens celulares neste modelo biológico 6,7,8. Como mostrado na Figura 1, estudamos proteomas de células isoladas empregando dissecção de células inteiras ou microamostragem capilar para aspirar o conteúdo celular. O monitoramento da linhagem de uma célula nos permite estudar a evolução espaço-temporal do proteoma à medida que as células formam tecidos durante a gastrulação. A progênie celular é marcada fluorescentemente pela injeção de um fluoróforo conjugado a dextran inerte ou mRNA para proteína fluorescente (por exemplo, proteína fluorescente verde ou GFP). A progênie marcada é isolada nos momentos de desenvolvimento desejados. Durante a gastrulação, clones celulares que estão firmemente agrupados podem ser isolados por dissecção. Após a gastrulação, os clones celulares podem ser distribuídos dentro do embrião devido a movimentos migratórios e podem ser isolados de tecidos dissociados por triagem celular ativada por fluorescência (FACS). As proteínas nessas células e tecidos são medidas via proteômica bottom-up empregando HPLC ou CE para separação e ESI tandem HRMS para identificação. A proteômica da HRMS guiada por linhagens celulares é escalável para diferentes tamanhos e linhagens celulares dentro do embrião e é específica, sensível e quantitativa. Através de exemplos selecionados mostrados aqui, também demonstramos que este protocolo é escalável e amplamente adaptável a diferentes tipos de células e linhagens celulares.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63586/63586fig02.jpg"> Figura 2: O fluxo de trabalho bioanalítico. A microdissecção e a aspiração capilar, ou FACS, facilitaram a amostragem do conteúdo de proteínas celulares e clonais. A depleção de proteínas vitelínicas abundantes e a separação por eletroforese capilar (CE) ou cromatografia líquida de nanofluxo (LC) aumentaram a sensibilidade de identificação (ID) usando espectrometria de massa de alta resolução (EMRH) com ionização por eletrospray (ESI). A quantificação revelou desregulação, fornecendo novas informações para estudos baseados em hipóteses em conjunto com informações disponíveis na ontologia gênica (GO). As figuras foram adaptadas com permissão da referência15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63586/63586fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

<table><tbody><tr><td>Acetonitrila (grau LC-MS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>A955</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>R0492</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato de amônio</td><td>Fisher Scientific</td><td>A643-500</td><td></td></tr><tr><td>Coluna Analítica</td><td>Thermo Scientific</td><td>164941</td><td></td></tr><tr><td>Microbalança Analítica</td><td>Mettler-Toledo</td><td>XSE105DU</td><td></td></tr><tr><td>Plataforma automática de fracionamento de peptídeos</td><td>Agilent</td><td>1260 Infinity II</td><td></td></tr><tr><td>Borosilicate Capillaries</td><td>Sutter Instruments Co.</td><td>B100-50-10</td><td></td></tr><tr><td>Capilares de borosilicato (para fazer emissores)</td><td>Sutter Instruments</td><td>B100-75-10</td><td></td></tr><tr><td>C18 colunas de rotação (para dessalinização)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>89870</td><td></td></tr><tr><td>Câmera ro monitor eletrospray</td><td>Edmund Optics Inc.</td><td>EO-2018C</td><td></td></tr><tr><td>Combretastatina A4</td><td>Millipore Sigma</td><td>C7744</td><td></td></tr><tr><td>Sistema CESI comercial</td><td>AB SCIEX</td><td>CESI</td><td></td></tr> <tr><td>(Ácido ciclohexilamino) -1-propanossulfônico (CAPS)</td> <td>VWR</td><td>97061-492</td><td></td></tr><tr><td>Citocalasina D</td><td>Millipore Sigma</td><td>C8273</td><td></td></tr><tr><td>Dextran, Alexa Fluor 488; 10.000 MW, aniônico, fixável</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>D22910</td><td></td></tr><tr><td>Diothiothreitol</td><td>Fisher Scientific</td><td>FERR0861</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 Fórceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-30</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>AAJ62786AP</td><td></td></tr><tr><td>Fonte de luz de epifluorescência</td><td>Lumencore</td><td>AURA III</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf LoBing microcentrífugas&nbsp; tubos: proteína</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-698-793</td><td></td></tr><tr><td>Ácido fórmico (grau LC-MS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>A117-50</td><td></td></tr><tr><td>Freezer (-20 &deg; C)</td> <td>Fisher Scientific</td><td>97-926-1&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Freezer (-80 &deg; C)</td> <td>Thermo Scientific</td><td>TSX40086A</td><td></td></tr><tr><td>Capilar de sílica fundida</td><td>Molex</td><td>1088150596</td><td></td></tr><tr><td>Bloco de calor</td><td>Benchmark</td><td>BSH300</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de cromatografia líquida de alta pressão</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Dionex Ultimate 3000 RSLC nanossistema</td><td></td></tr><tr><td>Fonte de alimentação de alta tensão</td><td>Spellman</td><td>CZE1000R</td><td></td></tr><tr><td>Espectrômetro de massa de alta resolução</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer</td><td></td></tr><tr><td>HPLC caps</td><td>Frascos</td> de HPLC Thermo Scientific <td>C4013-40A</td><td></td></tr> Thermo <tr><td></td><td>Scientific</td><td>C4013-11</td><td></td></tr><tr><td>Iluminador, por exemplo, Goosenecks</td><td>Nikon</td><td>C-FLED2</td><td></td></tr><tr><td>Ingenuity Pathway Analysis</td><td>Qiagen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Iodoacetamida</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC122275000</td><td></td></tr><tr><td>Metanol (grau LC-MS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>A456</td><td></td></tr><tr><td>Metanol (grau LC-MS)</td><td>Extrator microcapilar Fisher Scientific</td><td>A456-4</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Suttor Instruments</td><td>P-2000</td><td></td></tr><tr><td>Microinjetor</td><td>Warner Instrument, Handem, CT</td><td>PLI-100A</td><td></td></tr><tr><td>Extrator de micropippette</td><td>Sutter Instruments Co.</td><td>Software de análise de dados P-1000</td><td></td></tr><tr><td>MS, software comercial</td> de análise de dados <td>ProteomeDiscoverer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MS,</td> substituto de código aberto <td>MaxQuant</td><td></td><td></td></tr><tr><td>non-idet 40</td><td>Millipore Sigma</td><td>11754599001 placa de</td><td></td></tr><tr><td>Petri 60 mm e 80 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>S08184</td><td></td></tr><tr><td>Pierce 10 &micro; Cama em L Zip-tips (para dessalinização)</td> <td>ThermoFisher Scientific</td><td>87782</td><td></td></tr><tr><td>Pierce kit de ensaio de proteína de ácido bicinchonínico</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>Pierce ensaio de peptídeo colorimétrico quantitativo</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>23275</td><td></td></tr><tr><td>Pierce Tryps Protease (MS Grade)</td> <td>Frascos</td><td></td> Fisher Scientific PI90058 <td></td></tr><tr><td>Protein LoBind</td><td>Eppendorf</td><td>0030108434 ,</td> Centrífuga Refrigerada 0030108442 <td></td></tr><tr><td>Incubadora Refrigerada</td><td>Eppendorf</td> 5430R <td></td> Isetionato de sódio Thermo Scientific PR505755R/3721 <td></td></tr><tr><td></td><td>Millipore Sigma</td><td>220078</td><td></td></tr><tr><td>pirofosfato de sódio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>221368-100G</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> Frasco BGE de aço inoxidável <td></td></tr><tr><td></td><td>Frascos de</td> amostra de aço inoxidável personalizados <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Estereomicroscópio personalizado</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(objetiva 10x)</td> <td>Nikon</td><td>SMZ 1270, SZX18</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>VWR</td><td>97063-790</td><td></td></tr><tr><td>Bombas de seringa (2)</td> <td>Aparelho Harvard</td><td>704506</td><td></td></tr><tr><td>Seringas (à prova de gás): 500-ndash; 1000 &micro; L</td><td>Hamilton</td><td>1750TTL</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas de transferência (Plástico, descartáveis)</td> <td>Fisher Scientific</td><td>13-711-7M</td><td></td></tr><tr><td>Coluna de Armadilha</td><td>Thermo Scientific</td><td>164750</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl (solução 1 M)</td> <td>Fisher Scientific</td><td>AAJ22638AP</td><td></td></tr><tr><td>Concentrador de vácuo capaz de operar a 4&ndash; 10 &deg; C</td><td>Labconco</td><td>7310022</td><td></td></tr><tr><td>Vortex-mixer</td><td>Benchmark</td><td>BS-VM-1000</td><td></td></tr><tr><td>Água (grau LC-MS)</td><td>Água Fisher Scientific</td><td>W6</td><td></td></tr><tr><td>(grau LC-MS)</td>Estágio de tradução <td>Fisher Scientific</td><td>W6</td><td></td></tr><tr><td>XYZ Estágio de tradução</td><td>Thorlabs</td><td>PT3</td><td></td></tr><tr><td>XYZ Personalizado</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

proteômica por espectrometria de massas guiada por linhagem celular no embrião em desenvolvimento (rã)

Cell-Lineage Guided Mass Spectrometry Proteomics in the Developing (Frog) Embryo

A caracterização de eventos moleculares à medida que as células dão origem a tecidos e órgãos aumenta o potencial para entender melhor o desenvolvimento normal e projetar remédios eficientes para doenças. Tecnologias que permitam a identificação e quantificação precisas de diversos tipos e grande número de proteínas forneceriam informações ainda escassas sobre os mecanismos moleculares que orquestram o desenvolvimento de tecidos e organismos no espaço e no tempo. Aqui, apresentamos um protocolo baseado em espectrometria de massas que permite a medição de milhares de proteínas em linhagens celulares identificadas em embriões de Xenopus laevis (rã). A abordagem baseia-se em mapas reprodutíveis de destino celular e métodos estabelecidos para identificar, marcar fluorescentemente, rastrear e amostrar células e suas progênies (clones) a partir deste modelo de desenvolvimento de vertebrados. Após a coleta do conteúdo celular por microamostragem ou isolamento de células por dissecção ou classificação celular ativada por fluorescência, as proteínas são extraídas e processadas para análise proteômica ascendente. Cromatografia líquida e eletroforese capilar são usadas para fornecer separação escalável para detecção e quantificação de proteínas com espectrometria de massas de alta resolução (EMAR). Exemplos representativos são fornecidos para a caracterização proteômica de células adiposas do tecido neural. A proteômica da HRMS guiada por linhagem celular é adaptável a diferentes tecidos e organismos. É suficientemente sensível, específico e quantitativo para perscrutar a dinâmica espaço-temporal do proteoma durante o desenvolvimento dos vertebrados.

Este protocolo possibilitou o estudo de proteínas em células isoladas e suas linhagens à medida que estabelecem tecidos em embriões de X. laevis. A Figura 1 ilustra uma dessas aplicações da abordagem para estudar proteínas em células de tecido neural e o ectoderma neural recém-induzido no embrião. Como mostrado na Figura 1A, o fluxo de trabalho bioanalítico integrou ferramentas tradicionais da biologia celular e do desenvolvimento para identificar, inje...

Descrevemos aqui uma caracterização proteômica baseada em espectrometria de massa de linhagens celulares com destino tecidual conhecido no embrião do vertebrado Xenopus laevis .

Proteômica por Espectrometria de Massas Guiada por Linhagem Celular no Embrião em Desenvolvimento (Rã)

Characterization of molecular events as cells give rise to tissues and organs raises a potential to better understand normal development and design ...

Esta abordagem guiada por linhagens permite a análise proteômica de eventos importantes do desenvolvimento com resolução espacial e temporal dentro do embrião vertebrado, transmitindo informações que não seriam acessíveis através de medidas embrionárias inteiras. Esta abordagem pode ser prontamente estendida para estudar proteínas, metabólitos e transcritos de diferentes células embrionárias à medida que se diferenciam durante o desenvolvimento. Este método pode avançar nossa compreensão dos mecanismos moleculares que controlam o desenvolvimento normal e da doença, incluindo mecanismos de indução tecidual e comprometimento do destino celular durante o desenvolvimento inicial.Use um laço de cabelo para guiar cada embrião em um poço e posicione-os suavemente de modo que a célula-alvo de interesse esteja no ângulo certo com a microagulha. Siga os mapas de destino do tecido xenopus laevis para identificar a célula precursora da linhagem de interesse. Use duas pinças afiadas para remover suavemente a membrana vitelínica ao redor do embrião.Isolar as células isoladas do embrião por dissecção manual com pinças. Comece por configurar a agulha de injeção que contém a solução traçadora de linhagem. Monte a agulha de microinjeção em um suporte de micropipeta controlado por um micromanipulador multieixo.Conecte o suporte da micropipeta a um microinjetor e encha a agulha com o traçador de linhagem aplicando pressão negativa. Calibrar a agulha e ajustar o tamanho da ponta da agulha e o tempo de injeção para fornecer aproximadamente um nanolitro da solução traçadora de linhagem medida em óleo mineral. Certifique-se de que o tamanho da gota que está sendo injetada seja preciso e ajuste as configurações do injetor, se necessário.Inundar a placa de argila de microinjeção com uma solução de 3%fCAL e transferir aproximadamente 10 embriões para a placa de argila usando uma pipeta de transferência. Injetar nas células de interesse aproximadamente um nanolitro do dextran fluorescente ou 200 picogramas de mRNA GFP. Usando um microscópio estéreo, confirme o sucesso da marcação celular.Certifique-se de que apenas a célula pretendida é injetada. Descartar embriões contendo células lesionadas ou rotuladas incorretamente seguindo políticas institucionais. Transferir os embriões injetados para uma placa de Petri contendo solução de Steinberg 0,5x.Cultivá-los entre 14 a 25 graus Celsius até atingirem o estágio de desenvolvimento desejado. Transferir de três a cinco embriões para uma placa de ágar contendo solução de Steinberg 0,2x para microdissecções. Use fórceps para dissecar o clone marcado do embrião.Coletar o tecido dissecado com pipeta de 0,5 a 10 microlitros e depositá-lo em uma lima de microcentrífuga. Usando uma pipeta, aspirar o meio ao redor do tecido coletado para limitar os sais na amostra para evitar interferência na análise da EMAR. Congelar imediatamente as células isoladas, colocando o frasco para injetáveis da amostra em gelo seco ou azoto líquido.Conservar as amostras a menos 80 graus Celsius até à análise por espectrometria de massas. Para o processamento de amostra de célula única por CE, desnature as proteínas aquecendo a amostra a 60 graus Celsius por aproximadamente 15 minutos. Em seguida, equilibre a amostra à temperatura ambiente por cinco minutos e adicione tripsina às amostras para digestão.Para análise por NanoLC, lisar até cinco tecidos dissecados em 50 microlitros de tampão de lise. Facilite o processo pipetando a amostra para cima e para baixo. Para processar os tecidos dissecados, incubar o lisado a quatro graus Celsius por 10 minutos.Em seguida, pellet os restos celulares e plaquetas gema a quatro graus Celsius por centrificação a 4.500 RCF. Transfira o sobrenadante para um frasco de microcentrífuga limpo e adicione 10% SDS para obter uma concentração final de 1% SDS no lisado. Para os tecidos, adicionar 0,5 molar ditiotreitol ao lisado para obter uma concentração final de aproximadamente 25 milimolares.Em seguida, incube o lisado por 30 minutos a 60 graus Celsius para reduzir quimicamente as ligações dissulfeto nas proteínas. Adicionar iodoacetamida 0,5 molar para obter a concentração final de aproximadamente 75 milimolares no lisado e incubar a mistura por 15 minutos à temperatura ambiente no escuro. Adicionar ditiotreitol 0,5 molar igual ao volume inicial para extinguir os reagentes remanescentes da reação de alquilação.Precipitar proteínas em acetona durante a noite como descrito no protocolo de texto e reconstituir em bicarbonato de amônio 0,5 molar. Adicione tripsina para digestão da amostra e incube os frascos para injetáveis a 37 graus Celsius. Para separar os peptídeos usando CE, reconstitua a proteína digerida em um a dois microlitros do solvente da amostra.Vórtice a amostra mista e a centrifusão a 10.000 RCF por dois minutos a quatro graus Celsius para detritos de células pelletizadas. Inicialize o instrumento CE-ESI lavando o capilar CE com o BGE. Coloque um microlitro de amostra no frasco para injetáveis da amostra e injete de um a 10 nanolitros da amostra no capilar de separação CE por injeção hidrodinâmica.Transfira a extremidade de entrada do capilar de separação CE para o BGE. Inicie a separação eletroforética aumentando gradualmente a tensão de separação CE do aterramento. Potenciais de 20 a 28 quilovolts com corrente abaixo de 10 microamperes garantem desempenho instrumental estável e reprodutível para análise.Para separar usando Nano LC, ressuspenda a amostra de peptídeo na fase móvel A.A concentração e o volume de injeção da amostra dependem do sistema e da coluna LC disponíveis. Transfira a amostra para um frasco para injetáveis LC. Carregue aproximadamente 200 nanogramas a dois microgramas de amostra de peptídeo na coluna analítica C18 e separe os peptídeos a uma taxa de fluxo de 300 nanolitros por minuto usando eluição de gradiente conforme descrito no manuscrito do texto.Usando uma câmera, verifique o fluxo de líquido através do emissor de eletrospray e inspecione visualmente a configuração em busca de possíveis vazamentos. Adquirir eventos de espectrometria de massa e sequenciar os peptídeos conforme descrito no manuscrito do texto. Diferenças na translação gênica foram detectadas entre células D11 dissecadas de diferentes embriões usando CE-ESI-HRMS.Clones de células dissecadas marcados com linhagem foram analisados por LC-HRMS. A análise da via das proteínas mostrou upregulated da tradução proteica e do metabolismo energético no organizador de Spemann com o neuroectoderma. O neuroectoderma prodeum foi enriquecido em proteínas associadas ao transporte nuclear de carga proteica na célula, provavelmente indicando eventos a jusante após sinalização.A análise de enriquecimento das funções moleculares indicou upregulation na iniciação da tradução, ligação do RNA e ligação do complexo proteassoma, sugerindo um papel para o turnover dinâmico de proteínas desenvolvendo o organizador de Spemann. Selecionar apenas embriões estereotipados para este protocolo para melhorar a reprodutibilidade e interpretação dos resultados. O tecido dissecado deve ser transferido para um frasco para injetáveis e imediatamente congelado contendo o mínimo possível de tampão de meio para minimizar a contaminação por sais tampão.Esta abordagem nos permitiu estudar a dinâmica de proteínas em células identificadas e linhagens celulares em embriões vivos. As novas informações que obtivemos sobre a produção espaço-temporal de proteínas importantes em tecidos em desenvolvimento nos permitiram projetar experimentos direcionados para avaliar sua função biológica.

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Química

Xenopus embrionárias epitélios são um sistema modelo ideal para estudar os comportamentos das células, como o desenvolvimento de polaridade e mudar de forma durante a morfogênese epitelial. Histologia tradicional de amostras fixa é cada vez mais sendo complementado por live-célula de imagem confocal. Aqui nós demonstrar os métodos para isolar os tecidos de rã e visualizar ao vivo as células epiteliais e seus citoesqueleto usando live-célula microscopia confocal.

Em células vivas, Imagem e Análise Quantitativa de células embrionárias epiteliais em Xenopus laevis</em

O destino de uma célula individual embrionário pode ser influenciado por moléculas hereditárias e / ou por sinais de células vizinhas. Utilizando mapas destino da clivagem embrionária fase Xenopus, blastômeros individuais podem ser identificados para a cultura de isolamento para avaliar as contribuições de moléculas herdados contra interações célula-célula.

Explantes blastômero para testar Compromisso destino celular durante o desenvolvimento embrionário

A questão de como os reguladores e os estados de cromatina cromatina afetar o genoma in vivo é essencial para a nossa compreensão de como o diagnóstico precoce decisões destino celular são feitas no embrião em desenvolvimento. Abordagem mais popular para investigar características de cromatina em um nível-se global definida aqui para embriões de Xenopus o chip-Seq-.

Snapshot Genome-wide de Reguladores da cromatina e Estados em<em&gt; Xenopus</em&gt; Os embriões por Chip-Seq

O manuscrito aqui fornece um simples conjunto de métodos que permitam analisar a secreção e difusão de ligantes marcados fluorescentes em Xenopus. Isto proporciona um contexto para testar a capacidade de outras proteínas para modificar a distribuição de ligando e permitindo experiências que podem dar uma visão sobre os mecanismos que regulam a gradientes de morfogénio.

Utilizando Análise de confocal<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Para Investigar moduladores de Wnt e Shh morfogénio gradientes

Este protocolo apresenta um método para realizar, de uma única célula quantitativa análise in situ da expressão de proteínas para o estudo especificação das linhagens em embriões de rato pré-implantação. Os procedimentos necessários para a coleta de blastocistos, toda montagem de detecção de imunofluorescência de proteínas, a imagem latente de amostras em um microscópio confocal, e segmentação nuclear e análise de imagem são descritos.

Análise quantitativa da expressão da proteína para estudar Especificação Lineage no mouse Preimplantation Embriões

Descrevemos as etapas que permitem rápida situ em amostragem de uma pequena porção de uma célula individual com alta precisão e mínima invasão usando microamostragem baseada em capilar, para facilitar a caracterização química de um instantâneo da atividade metabólica em viver de embriões utilizando uma plataforma de espectrometria de massa e eletroforese capilar Custom-Built única célula.

Microsonda eletroforese capilar espectrometria de massa para célula única Metabolomics em embriões de viver rã (Xenopus laevis)

Aqui apresentamos um método multiplexado de sequenciamento de mRNA de célula única para perfilar a expressão gênica em tecidos embrionários de camundongos. O método de sequenciamento de mRNA de célula única baseada em gotículas (scRNA-Seq) em combinação com estratégias multiplexing pode perfilar células únicas a partir de várias amostras simultaneamente, o que reduz significativamente os custos de reagente e minimiza os efeitos experimentais do lote.

Análise multiplexada do sequenciamento de mRNA celular único de células embrionárias de camundongos

Apresentamos um protocolo de duas partes que combina imagens fluorescentes de cálcio com hibridização in situ, permitindo que o experimentador correlacione padrões de atividade de cálcio com perfis de expressão genética em um nível unicelular.

Imagem fluorescente de cálcio e subsequente hibridização em Situ para caracterização do precursor neuronal em xenopus laevis

A microscopia de fluorescência à base de folha de luz é a ferramenta mais valiosa na biologia do desenvolvimento. Um grande problema em estudos comparativos é a variância ambiente. Nosso protocolo descreve uma estrutura experimental para imagens ao vivo simultâneas de múltiplos espécimes e, portanto, aborda essa questão de forma pró-ativa.

Imagens ao vivo simultâneas de embriões múltiplos de insetos em microscópios de fluorescência baseados em folha de luz da amostra

Zebrafish visando eletrófilos reativos e oxidantes (Z-REX) é um método baseado em biologia química para a investigação da sinalização de pequenas moléculas reativas. Esta técnica pode ser aplicada a peixes vivos de diferentes estágios de desenvolvimento. Aqui, acoplamos ensaios padrão em zebrafish com Z-REX para análise de vias de sinalização.

Monitoramento de respostas de sinalização no alvo em larvas de peixe-zebra - Z-REX desmascara mecanismos precisos de drogas eletrofílicas e metabólitos

Apresentamos aqui um protocolo eficaz de perfusão rápida de sangue para preparar amostras de tecido de rãs africanas com garras para estudos transcriptômicos e proteômicos.

Perfusão sanguínea rápida eficaz em Xenopus

Aprenda análise proteômica guiada por linhagem celular em embriões de Xenopus laevis usando espectrometria de massas. Este método revela mecanismos moleculares do desenvolvimento com resolução espacial e temporal.

Proteômica por Espectrometria de Massas Guiada por Linhagem Celular no Embrião em Desenvolvimento (Rã)

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