Name: Absorção de dose de exposição composta à base de platina e rutênio em zebrafish por espectrometria de massa de plasma indutivamente acoplado com aplicações mais amplas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-21T13:10:00.000+00:00
Duration: 8 min 46 s
Description: Aprenda a quantificar a absorção de metais em larvas de zebrafish usando espectrometria de massa ICPMS após digestão tecidual. Este método valida respostas de dose em estudos toxicológicos e farmacológicos.

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Financiamento: NJAES-Rutgers NJ01201, NIEHS Training Grant T32-ES 007148, NIH-NIEHS P30 ES005022. Além disso, Brittany Karas é apoiada pela concessão de treinamento T32NS115700 da NINDS, NIH. Os autores reconhecem Andreia Valente e a Fundação Portuguesa de Ciência e Tecnologia (FCT); PTDC/QUI-QIN/28662/2017) para o fornecimento de PMC79.

O zebrafish de cepa AB (Danio rerio) foi utilizado para todos os experimentos (ver a Tabela de Materiais), e o protocolo de criação (#08-025) foi aprovado pelo Comitê de Cuidados e Instalações de Animais da Universidade Rutgers.
1. Criação de zebrafish
<ol><li>Procriar e manter o zebrafish em um sistema de habitat aquático recirculante em um ciclo escuro de 14 horas:10 h.<ol>
<li>Purificar a água da torneira municipal através da areia e filtragem de carbono para obter água do sistema de peixes. Mantenha a água do sistema aquático a 28 °C, <0,05 ppm de nitrito, <0,2 ppm de amônia e pH entre 7,2 e 7,7.</li>
		<li>Alimente o zebrafish uma dieta de cistos de Artemia eclodidos, camarão de salmoura e alimentos de flocos de dieta de peixe.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Protocolo de dose-resposta de zebrafish (Figura 1)
<ol><li>Prepare a solução de água de ovo de zebrafish, seja a água média E3 ou a água de ovo feita de sal marinho de estoque a uma concentração de 60 μg/mL dissolvida em água desionizada18. Evite o uso de azul metileno. NOTA: Através do ICPMS, foi identificada interferência isobárica da água de ovos de zebrafish para óxidos de estrôncio, que se sobrepuseram com um isótopo de rutênio. Lavagem cuidadosa das larvas antes da análise a jusante amenizar essa questão. O meio E3 pode ser uma escolha mais fácil para alguns devido à composição proprietária dos sais marinhos comerciais.</li>
	<li>Dissolva os compostos metálicos ou metálicos em E3 ou água de ovo. Vórtice para quebrar qualquer material agregado e homogeneizar a solução. NOTA: No experimento descrito abaixo, PMC79 e cisplatina foram dissolvidos em concentrações máximas de 12,4 mg/L e 60 mg/L com concentração máxima de 0,5% de sulfoxida de dimetil (DMSO) para resistir à precipitação.<ol>
<li>Diluir compostos de metal pesado ou metal, como PMC79 e cisplatina, com E3 ou água de ovo, preparando pelo menos 5 doses de concentração.<ol>
<li>Comece com baixas concentrações de soluções de estoque em veículo puro (ou seja, DMSO), depois diluir com E3 ou água de ovo. Considere cuidadosamente as concentrações finais do veículo. NOTA: Certos compostos à base de metal, como cisplatina, se degradam rapidamente, e suas soluções devem ser feitas diariamente. ATENÇÃO: Manuseie metais pesados e quimioterápicos com cuidado. Revise a ficha técnica específica de segurança do material (MSDS) para o metal de interesse. A cisplatina pode causar irritação nos olhos e na pele, ser fatal se engolida, e pode causar toxicidade nos rins, sangue, órgãos formados por sangue e tecido fetal. Evite respirar vapores e contato com olhos, pele e roupas. Use luvas e roupas impermeáveis, e óculos de segurança ou óculos19.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Configure tanques de reprodução na tarde anterior ao experimento na proporção ideal de 2 fêmeas para 1 macho com um divisor entre os sexos20.<ol>
<li>Puxe o divisor quando as luzes se acenderem para o ciclo da manhã.</li>
		<li>Permita que o zebrafish se reproduza. NOTA: O tempo de reprodução depende do estágio inicial de exposição necessário. Para 3h de pós-fertilização, deixe a reprodução por aproximadamente 2 h. Os ovos chegarão a 3 hpf após a limpeza e segregação de ovos.</li>
		<li>Mova o peixe de criação para um tanque limpo.</li>
		<li>Recolhe os ovos derramando água do tanque através de um coador.</li>
		<li>Inverta o coador sobre uma placa de Petri e use uma garrafa de esguicho cheia de E3 ou água de ovo para enxaguar os ovos no prato.</li>
		<li>Limpe o prato de alimentos e resíduos antes do uso experimental.</li>
	</ol></li>
	<li>Randomize aproximadamente 23 embriões por dose em frascos de vidro individuais usando uma pipeta de transferência e uma pequena quantidade de água.</li>
	<li>Depois de todos os embriões estarem em frascos, remova toda a água dos ovos e substitua por solução de dosagem suficiente para que haja aproximadamente 1 polegada de solução acima da altura do ovo. NOTA: A necessidade de descorção deve ser cuidadosamente considerada. Consulte a seção de discussão para mais detalhes.</li>
	<li>Observe os embriões diariamente para lesões ou letalidade. Devido ao rápido desenvolvimento de zebrafish embrionários, obtenha imagens diárias usando qualquer configuração de microscópio/câmera de campo brilhante para identificar lesões menores entre os dias.</li>
	<li>Ao término da resposta à dose (4-5 dias após a fertilização [dpf], conforme a diretriz de Cooperação e Desenvolvimento Econômico da Organização [OCDE]21), combine 3-5 larvas antes da eutanásia para amostragem composta. Eutanize por resfriamento rápido por congelamento de snap em nitrogênio líquido. NOTA: A eutanásia por overdose de MS-222 ou metanosulfonato de tricaínfina pode potencialmente interferir na análise do ICPMS rio abaixo. Métodos de eutanásia de resfriamento rápido são encorajados para este protocolo para reduzir a possibilidade de interferência.</li>
	<li>Conduza 3 lavagens de tecido com água de alta pureza (como osmose reversa) para remover o composto em excesso do exterior do tecido.</li>
	<li>Mova as amostras para tubos de centrífugo de polipropileno de 15 mL com segurança de ácido e micro-ondas. Tenha cuidado para remover todo o excesso de água , pois qualquer líquido restante pode diluir o ácido nítrico e, portanto, o potencial oxidante do ácido durante a degradação tecidual. NOTA: Neste ponto, o tecido pode ser armazenado a -20 °C até uma análise mais aprofundada. Para metais naturalmente abundantes, limpar os tubos em um banho de ácido nítrico de 5% antes do uso amenizará os níveis de fundo ambiente.</li>
</ol>3. Digestão tecidual e avaliação de ICPMS (Figura 2)
<ol><li>Adicione aproximadamente 0,25 mL aos tubos de centrífugas de polipropileno de 15 mL para até 10 larvas (~100 μg) de ácido nítrico de alta pureza (69%). Ultrassonicato por 1h para prenizar as amostras usando as seguintes configurações: saída de banho ultrassônico: 85 W; 42 kHz ± 6%; faixa de temperatura: 19-27 °C. ATENÇÃO: Use proteção de ouvido durante a sonicação. O ácido nítrico causa queimaduras graves no trato respiratório, olho e pele. Use equipamentos de proteção completos e trabalhe no capô da fumaça ou em locais com ventilação adequada. Pode ser inflamável com outros materiais. O ácido nítrico deve ser manuseado exclusivamente em uma capa de fumaça para evitar a exposição a vapores produzidos durante a digestão. Não inspire ou ingera.<ol>
<li>Realize ciclos curtos de digestão tecidual (intervalos de 5 minutos) em um digestor de micro-ondas seguro para ácido até que todo o tecido esteja visivelmente oxidado (ou seja, solução uniforme e amarelo-claro). NOTA: Recomenda-se que o protocolo de micro-ondas na Tabela 1 seja realizado três vezes e inclua um intervalo de 5 minutos de recarga entre cada etapa de aquecimento.</li>
		<li>Monitore a integridade dos tubos cuidadosamente para evitar a ruptura e realize pequenos giros na centrífuga (313 × g por 1 min) entre os ciclos para mover condensação ácida para o fundo do tubo. NOTA: Se o tecido for difícil de digerir (especialmente corões), peróxido de hidrogênio de 30% de alta pureza pode ser usado após a digestão do ácido. Use o peróxido de hidrogênio (6,75 mL) para diluir a concentração de ácido para 3,5%, e permitir que as amostras fiquem durante a noite em um capô de fumaça. Peróxido de hidrogênio se decomporá a H2O e é adequado para análise de ICPMS. Além disso, metais alternativos podem dissolver-se melhor em ácido clorídrico ou uma mistura de ácido clorídrico e ácido nítrico (ou seja, aqua regia). Peróxido de hidrogênio é prejudicial se engolido e causa sérios danos oculares. Use proteção de pele e olhos22,23.</li>
	</ol></li>
	<li>Uma vez que o tecido esteja visivelmente oxidado (ou seja, solução uniforme, amarelo-claro), dilua as amostras em uma capa de fumaça para 3,5% de ácido nítrico usando 6,75 mL de água de alta pureza e vórtice para misturar completamente. NOTA: Neste ponto, as amostras podem ser armazenadas à temperatura ambiente. Esta etapa é desnecessária se o peróxido de hidrogênio foi adicionado para auxiliar a digestão na etapa 3.1.</li>
	<li>Conduzir uma curva de calibração de 7 pontos (faixa de concentração de 0,001-10 ppb) com um padrão elementar certificado (ou seja, Pt ou Ru, dependendo do ensaio) com o metal de interesse e isótopo ideal para responder por eventuais interferências isobáricas.<ol>
<li>Utilizando uma concentração de estoque do padrão elementar aquoso e certificado (Ru, Pt = 1000 ppb), leve uma alíquota de 0,1 mL e pipeta em um novo tubo de centrífuga de 15 mL. Diluir com ácido nítrico de 3,5% a um volume final de 10 mL para produzir uma solução padrão de 10 ppb.</li>
		<li>Utilizando o estoque de 10 ppb, faça as seguintes diluições seriais: 0,1, 1,0 e 5,0 ppb de soluções padrão em ácido nítrico de 3,5%.</li>
		<li>Utilizando o estoque de 0,1, faça as seguintes diluições seriais: 0,001, 0,005 e 0,01 ppb de soluções padrão em ácido nítrico de 3,5%.</li>
	</ol></li>
	<li>Prepare o instrumento ICPMS (veja o Tabela de Materiais) para análise amostral da seguinte forma:<ol><li>Antes de iniciar o instrumento, certifique-se de que a válvula de gás Argon esteja aberta, todas as tubulações estejam conectadas com segurança e o ácido nítrico limpo esteja aberto para enxaguar tubos e vidros entre as análises da amostra.</li>
		<li>Verifique as condições da tocha e dos cones e certifique-se de que a caixa da tocha está bem travada e o tubo de drenagem da câmara de pulverização está devidamente conectado ao peripoco.</li>
		<li>Abra o software (veja a Tabela de Materiais).</li>
		<li>Verifique as leituras de vácuo e certifique-se de que todas as bombas turbo estejam funcionando a 100%.</li>
		<li>Clique em START na janela Status do sistema de controle de plasma para iniciar a sequência inicial, ligue a bomba de plasma, esfrie o plasma, purgue o nebulizador e acenda o plasma. Aguarde que o plasma esteja aceso e estável quando a janela de status indicar que a sequência de inicialização está completa. Neste ponto, observe os pontos verdes na janela do Estado do Sistema que indicam que todas as fontes de energia estão em jogo.</li>
		<li>Na barra de menu, clique em Control | autosampler no menu suspenso. Digite a posição do rack do autosampler para o tubo contendo 5% de ácido nítrico. Deixe o ácido entrar no plasma.</li>
		<li>Na barra de menus, clique em Scans | Ímã no menu suspenso. Na janela MagnetScan , digite 115 na Posição de Massa do Marcador e clique em enter. Deixe o ímã escanear através da faixa de massa para 115In (114,6083 a 115,3749) por 30 minutos enquanto o instrumento se aquece.</li>
		<li>Após 30 min, use o controle do autosampler para passar para a posição de uma solução de ajuste multielement de 1 ppb. Aspire a solução de sintonia e sintonize o instrumento para otimizar a leitura do sinal. Ajuste a posição da tocha (X, Y, Z) de modo que a tocha esteja alinhada com o centro dos cones e da taxa de fluxo de nebulizadores (~ 30 psi) na janela de controle de plasma . Faça os ajustes necessários na janela de ajuste de óptica de íons para a fonte, detector e analisador.</li>
		<li>Uma vez que a leitura do sinal seja otimizada (~1,2 × 106 contagens/s para 1 ppb em 115In), clique em Parar na janela Magnet Scan .<ol>
<li>Clique em Calibrar Magnet e selecione Baixa Resolução na janela pop-up.</li>
			<li>Clique em OK e abra o arquivo "Mass Calibration (Baixa Resolução).smc" para calibrar o Magneto. NOTA: A calibração do ímã medirá as contagens/s e encaixará uma curva através da seguinte faixa de massa: 7Li a 238U.</li>
			<li>Clique em Salvar | Use para aplicar a calibração do ímã atual às análises. Se medir amostras desconhecidas com uma enorme gama de concentrações, realize uma Calibração do Detector para comparar sinais de contagem de pulsos de íons em baixas concentrações com sinais de íons atenuados produzidos em concentrações mais altas. Analise as amostras quando a sintonia e calibração estiverem completas.</li>
		</ol></li>
		<li>Na barra de menu, clique em Aquisição de Dados.<ol>
<li>Clique na configuração do método no menu suspenso. Use um método existente fornecido pelo fabricante ou crie um método baseado nos elementos de interesse. Se necessário, ajuste o modo de análise, o tempo de moradia, o atraso do switch, o número de varreduras/ciclos, a resolução, o modo de detecção e a massa do parque para as configurações do defletor.</li>
			<li>Clique em Salvar para gravar as configurações do método. Otimize os parâmetros para cada metal e isótopo. Consulte a Tabela 2 para obter os parâmetros de operação específicos utilizados neste estudo.</li>
		</ol></li>
		<li>Na barra de menu, clique em Aquisição de Dados.<ol>
<li>Clique em Batch Run no menu suspenso. Como alternativa, clique no ícone BATCH abaixo da barra de menu. Importe os parâmetros do lote de uma planilha ou crie uma sequência na janela Batch Run . Digite o tipo de amostra, a posição do rack do autosampler, o tempo de transferência, o tempo de lavagem, as réplicas, o ID da amostra e o arquivo do método.</li>
		</ol></li>
		<li>Organize a execução do lote na seguinte ordem: soluções padrão para a curva de calibração (0,001-10 ppb Pt ou Ru), seguidas por um padrão de controle de qualidade e, em seguida, amostras desconhecidas. NOTA: As soluções padrão são medidas como contagens/s no ICPMS, e uma regressão linear é encaixada através dos padrões com um desvio padrão relativo (RSD) > 0,999. As incógnitas também são medidas como contagens/s e resolvidas para concentração em ppb utilizando a regressão linear da curva de calibração, y = mx + b. O processamento de dados também pode ser concluído usando o software referenciado.</li>
		<li>Monitore a deriva do instrumento e a reprodutibilidade da amostra, incluindo um padrão de controle de qualidade de 0,5 ppb a cada 5-10 amostras. NOTA: Os padrões adequados de controle de qualidade devem ser um material de referência padrão certificado diferente do padrão utilizado na curva de calibração.</li>
	</ol></li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Watts</td>
			<td>Poder</td>
			<td>Ata</td>
		</tr>
<tr>
<td>300</td>
			<td>50%</td>
			<td>5</td>
		</tr>
<tr>
<td>300</td>
			<td>75%</td>
			<td>5</td>
		</tr>
<tr>
<td>300</td>
			<td>0%</td>
			<td>5</td>
		</tr>
<tr>
<td>300</td>
			<td>75%</td>
			<td>5</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 1: Protocolo de digestão de micro-ondas para massa de tecido larval. As amostras larval de zebrafish foram digeridas em 0,25 mL de ácido nítrico. Esta tabela foi modificada a partir de 24.

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<li>Henn, K., Braunbeck, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dechorionation+as+a+tool+to+improve+the+fish+embryo+toxicity+test+%28FET%29+with+the+zebrafish+%28Danio+rerio%29%5BTitle%5D)+AND+%22Comparative+Biochemistry+and+Physiology.+Toxicology+%26+Pharmacology%3A+CBP%22%5BJournal%5D)">Dechorionation as a tool to improve the fish embryo toxicity test (FET) with the zebrafish (Danio rerio).</a> Comparative Biochemistry and Physiology. Toxicology & Pharmacology: CBP. 153 (1), 91-98 (2011).</li>
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<li>Karas, B. F., Hotz, J. M., Buckley, B. T., Cooper, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cisplatin+alkylating+activity+in+zebrafish+causes+resistance+to+chorionic+degradation+and+inhibition+of+osteogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Aquatic+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Cisplatin alkylating activity in zebrafish causes resistance to chorionic degradation and inhibition of osteogenesis.</a> Aquatic Toxicology. 229, 105656(2020).</li>
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Não há conflitos de interesse a serem divulgados por nenhum dos autores.

O protocolo aqui descrito foi implementado para determinar a entrega e a absorção de drogas anticancerígenas baseadas em metal contendo Pt ou Ru. Embora esses métodos já tenham sido publicados, este protocolo discute considerações e detalhes importantes para adaptar essa metodologia para uma variedade de compostos. O protocolo da OCDE, juntamente com a digestão tecidual e a análise do ICPMS, nos permitiu determinar que o PMC79 era mais potente que a cisplatina e resultou em acúmulo de tecidos díspares, sugerindo mecanism...

Metais e compostos metálicos continuam a ter relevância farmacológica e toxicológica. A prevalência de exposição ao metal pesado e seu impacto na saúde aumentou exponencialmente a investigação científica desde a década de 1960 e atingiu um recorde em 2021. As concentrações de metais pesados na água potável, poluição do ar e exposição ocupacional excedem os limites regulatórios em todo o mundo e permanecem um problema para arsênico, cádmio, mercúrio, cromo, chumbo e outros metais. Novos métodos para quantificar a exposição ambiental e analisar o desenvolvimento patológico continuam em alta demanda 1,2,3.
Por outro lado, a área médica tem aproveitado as propriedades fisioquímicas de vários metais para tratamento clínico. Drogas à base de metal ou metalúrgicos têm uma rica história de fins medicinais e têm mostrado atividade contra uma série de doenças, com o maior sucesso como quimioterapia4. O mais famoso dos metalodrogas, cisplatina, é um medicamento anticâncer baseado em Pt considerado pela Organização Mundial da Saúde (OMS) como uma das drogas essenciais do mundo5. Em 2010, a cisplatina e seus derivados do Pt tiveram até 90% de sucesso em diversos cânceres e foram utilizadas em aproximadamente 50% dos regimes de quimioterapia 6,7,8. Embora a quimioterapia baseada em PT tenha tido sucesso irrefutável, a toxicidade limitante de dose iniciou investigações de drogas à base de metal alternativo com entrega biológica refinada e atividade. Dessas alternativas, os compostos baseados em Ru tornaram-se os 9,10,11,12 mais populares.
Novos modelos e metodologia são necessários para acompanhar a taxa de necessidade de estudos farmaco-farmaco e toxicolíticos metálicos. O modelo de zebrafish está na intersecção de complexidade e throughput, sendo um vertebrado de alta fecundidade com 70% de homologia genética conservada13. Este modelo tem sido um ativo em farmacologia e toxicologia, com extensas triagens para vários compostos para descoberta de chumbo, identificação de alvos e atividade mecanicística 14,15,16,17. No entanto, a triagem de alto rendimento de produtos químicos normalmente depende de exposições transmitidas pela água. Dado que a absorção pode ser variável com base nas propriedades físico-químicas do composto na solução (ou seja, fotodegradação, solubilidade), isso pode ser uma grande limitação de correlacionar a entrega e a resposta das doses.
Para superar essa limitação para comparação da dose com vertebrados mais elevados, foi projetada uma metodologia para analisar as concentrações metálicas de traço no tecido larval de zebrafish. Aqui, curvas de dose-resposta de pontos finais letais e subletais foram avaliadas para cisplatina e novos compostos anticancerígenos baseados em Ru. A letalidade e o eclosão retardado foram avaliados para concentrações nominais de 0, 3,75, 7,5, 15, 30 e 60 mg/L cisplatina. O acúmulo de PT no tecido do organismo foi determinado pela análise do ICPMS, e a absorção de organismos das respectivas doses foi de 0,05, 8,7, 23,5, 59,9, 193,2 e 461,9 ng (Pt) por organismo. Além disso, as larvas de zebrafish foram expostas a 0, 3.1, 6.2, 9.2, 12,4 mg/L de PMC79. Estas concentrações foram analiticamente determinadas para conter 0, 0,17, 0,44, 0,66 e 0,76 mg/L de Ru. Este protocolo também permitiu a distinção das concentrações de Pt sequestrado no acorde das larvas em comparação com o tecido zebrafish. Essa metodologia foi capaz de fornecer dados confiáveis e robustos para comparações da atividade farmaco-e toxicolética entre um quimioterápico bem estabelecido e um novo composto. Este método pode ser aplicado a uma ampla gama de metais e compostos à base de metal.

<table><tbody><tr><td>AB Strain Zebrafish (Danio reri)</td><td>Zebrafish International Resource Center</td><td>Wild-Type AB</td><td>Wild-Type AB</td></tr><tr><td>Zebrafish ACS Grade Ácido Nítrico</td><td>VWR BDH Chemicals</td><td>BDH3130-2.5LP</td><td>Ácido Nítrico (68-70%); usado para fazer solução de banho de ácido HNO3 a 10% para tubos de centrífuga de imersão/pré-celaning</td></tr><tr><td>Aquatox Fish Diet (Flake)</td><td>Zeigler Bros, Inc.</td><td></td><td>Alimento em flocos para ser misturado em uma proporção de 1:4 de Aquatox Fish Diet para TetraMin Tropical Flakes e usado como ração</td></tr><tr><td>Cistos de Artemia, artêmia Ovos de artêmia</td><td>PentairAES</td><td>BS90</td><td>vendidos em latas de 15 ozz embaladas a vácuo para serem chocadas e usadas como ração</td></tr><tr><td>ASX-510 Amostrador automático para ICPMS</td><td>Teledyne CETAC</td><td></td><td>Amostrador automático com movimento XYZ conifgurável, estação de enxágue de fluxo e sonda de dimensão interna de 0,3 mm. Compatível com o software Nu AttoLab para análises de lotes programáveis. &nbsp;</td></tr><tr><td>Centrífuga</td> de <td>bancada compacta Thermo Scientific CL 2 com faixa de velocidade variável de até 5200 rpm; usada para trazer amostras e condensado ácido para o fundo do tubo da centrífuga entre intervalos de digestão por micro-ondas; auxilia na retenção de amostras</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga</td><td>VWR</td><td>21008-105 Tubos de</td><td>centrífuga de polipropileno de ultra alto desempenho com tampa plana; volume de 15 mL; à prova de vazamentos com fundo</td></tr> <tr>cônico<td>Frascos roscados de vidro transparente classe A</td><td>Fisherbrand</td><td>03-339-25B</td><td>Frascos de vidro individuais para contenção</td></tr><tr><td>de exposição Dimetilsulfóxido Millipore</td><td>Sigma</td><td>D8418</td><td>Solvente ou veículo para compostos hidrofóbicos</td></tr><tr><td>Misturador de vórtice de velocidade fixa</td><td>VWR</td><td>10153-834</td><td>Misturador de vórtice; usado para homogeneizar a amostra após digestão ácida e diluição</td></tr><tr><td>Peróxido de hidrogênio de alta pureza</td><td>Merk KGaA, EDM Millipore</td><td>1.07298.0250</td><td>Suprapur Peróxido de hidrogênio (30%); usado para digestão de amostras</td></tr><tr><td>Ácido nítrico de alta pureza</td><td>EDM Millipore</td><td>NX0408-2</td><td>Omni Trace Ultra Ácido nítrico (69%); usado para digestão de amostras</td></tr><tr><td>Instant Ocean Sea Salt</td><td>Spectrum Brands, Inc.</td><td>Oceano Instantâneo&reg; A</td><td>solução de água de ovo de sal marinho contém sal marinho oceânico com uma concentração final de 60 &micro; g/ml</td></tr><tr><td>Sistema de digestão por microondas Mars X</td><td>CEM, Matthews, NC</td><td></td><td>Sistema de digestão ácida por microondas usado para digerir e homogeneizar amostras sob condições uniformes. Para esta metodologia, o método de digestão em vaso aberto foi concluído usando tubos de centrífuga de polipropileno de uso único em baixa potência (300 W).&nbsp;</td></tr><tr><td>Solução multielemento 3</td><td>SPEX CertiPREP</td><td>CLMS-3</td><td>Contém 10 mg/L Au, Hf, Ir, Pd, Pt, Fu, Sb, Sr, Te, Sn em 10% HCl/1% HNO3; usado como padrão de controle de qualidade para análises de Pt e Ru</td></tr><tr><td>Nu Instruments AttoM High Resolution Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometer (HR-ICP-MS)Nu</td> <td>Instruments/Amatek</td><td></td><td>Espectrômetro de massa de plasma indutivamente acoplado de setor magnético de foco duplo com sistema de fenda flexível de baixa a alta resolução e sistema detector de faixa dinâmica. O processamento e a quantificação de dados são feitos usando o software complementar NuQuant.&nbsp;</td></tr><tr><td>Solução padrão de platina (Pt), NIST 3140</td><td>Instituto Nacional de Padrões e Tecnologia</td><td>3140</td><td>Preparado a partir de ampola contendo 9,996 mg/g de Pt em 10% de HCl; ; usado como padrão de controle de qualidade para análises de Pt</td></tr><tr><td>Solução padrão de platina (Pt), elemento único</td><td>Padrões de alta pureza</td><td>100040-2</td><td>Contém 1000 mg/L de Pt em 5% de HCl</td></tr><tr><td>Solução padrão de rutênio (Ru), elemento único</td><td>Padrões</td> <td>de alta pureza100046-2</td><td>Contém 1000 mg/L de Ru em 2% de HCl</td></tr><tr><td>TetraMin Tropical Flakes</td><td>Tetra</td><td>77101</td><td>Alimento em flocos a ser misturado numa proporção de 1:4 de Aquatox Fish Diet para TetraMin Tropical Flakes e utilizado como alimentação</td></tr><tr><td>Ácido nítrico de grau metálico</td><td>VWR BDH Chemicals</td><td>87003-261</td><td>Aristar Plus Ácido nítrico (67-70%); utilizado para solução de enxaguamento em ASX-510 Amostrador automático</td></tr><tr><td>Banho-maria ultrassónico</td><td>VWR</td><td>B2500A-DTH</td><td>Banho-maria ultrassônico usado para auxiliar na digestão ácida antes da digestão por microondas</td></tr></tbody></table>

absorção de dose de exposição composta à base de platina e rutênio em zebrafish por espectrometria de massa de plasma indutivamente acoplado com aplicações mais amplas

Dose Uptake of Platinum- and Ruthenium-based Compound Exposure in Zebrafish by Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry with Broader Applications

Metais e compostos à base de metal compreendem xenobióticos farmaco-ativos e toxicológicos multifásicos. Da toxicidade do metal pesado à quimioterapia, os toxicokinetics desses compostos têm relevância histórica e moderna. Os zebrafish tornaram-se um organismo modelo atraente na elucidação da farmaco e toxicopinatics em estudos de exposição ambiental e tradução clínica. Embora os estudos de zebrafish tenham o benefício de serem mais bem-colocados do que os modelos de roedores, existem várias restrições significativas ao modelo.
Uma dessas limitações é inerente ao regime de dosagem aquaviário. As concentrações de água desses estudos não podem ser extrapoladas para fornecer doses internas confiáveis. Medições diretas dos compostos à base de metal permitem uma melhor correlação com respostas moleculares e biológicas relacionadas a compostos. Para superar essa limitação para metais e compostos à base de metal, desenvolveu-se uma técnica para digerir tecido larval de zebrafish após exposição e quantificar concentrações metálicas dentro de amostras de tecido por espectrometria de massa plasmática indutivamente acoplada (ICPMS).
Métodos ICPMS foram usados para determinar as concentrações metálicas de platina (Pt) de cisplatina e rutênio (Ru) de várias quimioterapias baseadas em Ru em tecido de zebrafish. Além disso, este protocolo distinguiu concentrações de Pt que foram sequestradas no acorde da larva em comparação com o tecido zebrafish. Estes resultados indicam que este método pode ser aplicado para quantificar a dose metálica presente nos tecidos larvais. Além disso, este método pode ser ajustado para identificar metais específicos ou compostos à base de metal em uma ampla gama de estudos de exposição e dosagem.

Esses resultados foram publicados anteriormente24. Estudos de absorção de tecidos foram realizados com exposições transmitidas pela água de cisplatina e um novo composto anticâncer baseado em Ru, PMC79. A letalidade e o eclosão retardado foram avaliados para concentrações nominais de cisplatina 0, 3,75, 7,5, 15, 30 e 60 mg/L cisplatina. O acúmulo de PT no tecido do organismo foi determinado pela análise do ICPMS, e o tecido do organismo continha as respectivas doses de 0,05, 8,7, 23,5, 59,9, 193,2...

O aumento da taxa de análises farmaco-e toxicoléticas de metais e compostos à base de metal em zebrafish pode ser vantajoso para estudos de tradução ambiental e clínica. A limitação da absorção de exposição transmitida pela água desconhecida foi superada pela realização de análises metálicas de traços no tecido de zebrafish digerido usando espectrometria de massa plasmática indutivamente acoplada.

Absorção de dose de exposição composta à base de platina e rutênio em zebrafish por espectrometria de massa de plasma indutivamente acoplado com aplicações mais amplas

Metals and metal-based compounds comprise multifarious pharmaco-active and toxicological xenobiotics. From heavy metal toxicity to chemotherapeutics, the ...

O zebrafish é um modelo atraente, mas os cientistas não sabem o quanto o organismo está se levantando com a dosagem transmitida pela água. Desenvolvemos uma técnica para digerir tecido após exposição e quantificar metais via ICPMS. Esta técnica nos permite quantificar com precisão e validar a resposta da dose usando ICPMS.Este método tem muito potencial. Exposições farmacológicas ou ambientais de metais podem ser aplicadas do nível celular até sistemas inteiros de órgãos em modelos animais. Adicione aproximadamente 0,25 mililitros de ácido nítrico de alta pureza aos tubos de centrífugas de polipropileno de 15 mililitros para até 10 larvas.Ultrassonicar por uma hora para prenípulo as amostras. Para a ultrassonificação, realize ciclos curtos de digestão tecidual com intervalos de cinco minutos em um digestor de micro-ondas seguro ácido até que todo o tecido esteja visivelmente oxidado, produzindo uma solução amarela uniforme e clara. Monitore cuidadosamente a integridade dos tubos para evitar rupturas e faça pequenos giros na centrífuga entre os ciclos.Uma vez que o tecido esteja visivelmente oxidado, dilua as amostras em uma capa de fumaça para 3,5% de ácido nítrico usando 6,75 mililitros de água de alta pureza e vórtice para misturar completamente. Em seguida, para conduzir uma curva de calibração de 7 pontos combinada com matriz para explicar quaisquer possíveis interferências isobáricas. Usando uma concentração de estoque do padrão elementar certificado aquoso, pegue uma alíquota de 0,1 mililitro e, por pipeto, em um novo tubo de centrífuga de 15 mililitros.Diluir com ácido nítrico de 3,5% a um volume final de 10 mililitros para produzir 10 partes por bilhão de soluções padrão. Usando as 10 partes por bilhão de ações, faça com que as diluições seriais 0,1, 1,0 e 5,0 partes por bilhão de soluções padrão em ácido nítrico de 3,5%. Usando o estoque de 0,1, faça as diluições seriais 0,001, 0,005 e 0,01 partes por bilhão de soluções padrão em ácido nítrico de 3,5%.Em seguida, antes de preparar o instrumento ICPMS para análise de amostras, certifique-se de que a válvula de gás argônio está aberta, toda a tubulação está conectada e limpa, 5% de ácido nítrico está aberto para enxaguar tubos e vidros entre as análises amostrais. Verifique as condições da tocha e dos cones e certifique-se de que a caixa da tocha está bem travada. E o tubo de drenagem da câmara de pulverização está conectado corretamente ao peripump.Abra o software, verifique as leituras de vácuo e certifique-se de que todas as bombas turbo estejam funcionando a 100% Clique em INICIAR na janela de status do sistema plasma control para iniciar a sequência inicial. Ligue a bomba de plasma e o refrigerador de plasma, coloque o nebulizador e acenda o plasma. Aguarde que o plasma esteja aceso e estável quando a janela Status indicar que a sequência de inicialização está completa.Neste ponto, observe os pontos verdes na janela do estado do sistema que indicam que todas as fontes de alimentação estão desligada. Na barra de menu, clique em Control, Autosampler no menu suspenso. Digite a posição do rack do autosampler para o tubo contendo ácido 5% nítrico, deixe o ácido entrar no plasma.Na barra de menu, clique em Scans, Magnet no menu suspenso. Na janela MagnetScan, digite 115 na Posição de Massa do Marcador e clique em enter. Deixe o ímã escanear toda a faixa de massa por 30 minutos enquanto o instrumento se aquece.Após 30 minutos, use o controle do autosampler para passar para a posição de uma solução de ajuste multielement de uma peça por bilhão de litros. Aspire a solução de sintonia e sintonize o instrumento para otimizar a leitura do sinal. Ajuste a posição da tocha para coordenadas X, Y, Z, de modo que a tocha se alinhe com o centro dos cones e a vazão de nebulizadores na janela de controle de plasma.Faça os ajustes necessários na janela de ajuste de óptica de íons para a fonte, detector e analisador. Uma vez que a leitura do sinal seja otimizada, clique em Parar na janela Magnet Scan, clique em Calibrar Magnet e selecione uma Baixa Resolução na janela pop-up. Clique em OK E abra o arquivo smc de calibração de massa para calibrar o ímã.Clique em Salvar, Use para aplicar a calibração do ímã atual às análises. Ao medir amostras desconhecidas com uma enorme gama de concentrações, realize uma calibração do detector para comparar sinais de contagem de pulsos de íons em baixas concentrações com sinais de íons atenuados produzidos em concentrações mais altas. Inicie a análise da amostra clicando em Aquisição de Dados e clique em Configuração de método no menu suspenso.Use um método existente fornecido pelo fabricante ou crie um método baseado nos elementos de interesse. Se necessário, ajuste o Modo de Análise, Tempo de Moradia, Atraso do Interruptor, Número de Varreduras e Ciclos, Resolução, Modo de Detecção e a Massa do Parque para configurações de defletor. Clique em Salvar para gravar as configurações do método.Otimize os parâmetros para cada metal e isótipo. Na barra de menu, clique em Aquisição de Dados. Clique em Batch Run no menu suspenso.Como alternativa, clique no ícone BATCH abaixo da barra de menu, importe os parâmetros do lote de uma planilha ou crie uma sequência na janela Batch Run. Digite o tipo de amostra, a posição do rack do autosampler, o tempo de transferência, o tempo de lavagem, as réplicas, o ID da amostra e o arquivo do método. Organize a execução do lote para soluções padrão para curva de calibração, seguido por um padrão de controle de qualidade e, em seguida, amostras desconhecidas.Monitore a deriva do instrumento e a reprodutibilidade da amostra, incluindo um padrão de controle de qualidade de 0,5 partes por bilhão a cada 5 a 10 amostras. Estudos de absorção de tecidos foram realizados com exposições transmitidas pela água de cisplatina e um novo composto anticâneo baseado em rutênio PMC79. A letalidade e o eclosão retardado foram avaliados para concentrações nominais de cisplatina.0, 3,75, 7,5 15, 30 e 60 miligramas por litro de cisplatina. O acúmulo de platina no tecido do organismo foi determinado pela análise do ICPMS e o tecido do organismo continha respectivas doses de 0,05, 8,7, 23,5, 59,9, 193,2 e 461,9 nanogramas por organismo. A eclosão retardada foi observada em todas as concentrações de cisplatina.Pós-descorção, os acordes foram coletados e analisados para platina separadamente. Doses não letais de cisplatina utilizadas para estudos de descorção determinaram que 93 a 96% da dose total entregue de cisplatina haviam se acumulado no acorde, com a dose restante dentro do tecido larval. As larvas de zebrafish foram expostas a 0, 3,1, 6,2, 9,2 e 12,4 miligramas por litro de PMC79.Essas concentrações foram analiticamente determinadas para conter 0, 0,17, 0,44, 0,66 e 0,76 miligramas por litro de rutênio. Ao contrário dessa cisplatina, o eclosão retardado não foi observado nas larvas expostas do PMC79. Os acordes não foram incluídos na análise de rutênio, pois naturalmente degradaram-se antes da coleta de larvas.O metal maciço dentro dos tecidos larvais analisados em cada concentração foi de 0,19, 0,41 e 0,68 nanogramas de rutênio por larva. Qualquer um dos reagentes adicionados ao protocolo de exposição dá o potencial de interferências isobáricas. Quando possível, considere alternativas como resfriamento rápido em comparação com tricaine.Este método permite quantificação de dose metálica para toxicidade, eficácia, experimentos a serem comparados entre vertebrados mais altos. Estávamos especialmente entusiasmados que nossa dose limiar estava dentro de uma ordem de magnitude dada aos pacientes.

dose-uptake-platinum-ruthenium-based-compound-exposure-zebrafish

Research

JoVE Journal

Chemistry

Química

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Absorção de dose de exposição composta à base de platina e rutênio em zebrafish por espectrometria de massa de plasma indutivamente acoplado com aplicações mais amplas (Vídeo) | JoVE Journal

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