Name: Uma abordagem não-sequencial para a detecção rápida da edição de RNA (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-21T13:20:00.000+00:00
Duration: 8 min 50 s
Description: Aprenda a detectar edição de RNA rapidamente usando eletroforese em gradiente de temperatura (µTGGE). Este método portátil e econômico identifica modificações de RNA sem sequenciamento direto, facilitando pesquisas em biologia molecular e doenças.

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Este trabalho foi apoiado por um Grant-in-Aid for Scientific Research da Japan Society for the Promotion of Science (17H02204 e 18K19288). Ruchika foi apoiado financeiramente pelo governo japonês (bolsa MEXT). Agradecemos à Sra. Radhika Biyani (Laboratório Takagi, JAIST) e Dr. Kirti Sharma (BioSeeds Corporation) por ajuda com experimentos relacionados à eletroforose.

1. Otimização do fragmento de destino
NOTA: Quatro genes editados foram usados no desenvolvimento deste protocolo, incluindo dois genes nucleares (AT2G16586 e AT5G02670) de A. thaliana, e os genes codificando proteína fluorescente azul (BFP) e proteína fluorescente verde aumentada (EGFP) expressa em células HEK293.
<ol><li>Para identificar fragmentos genéticos com diferentes perfis de fusão, representando regiões editadas versus não diutadas, gerar curvas de fusão previstas usando a ferramenta baseada na web uMelt HETS, uma extensão do software uMeltoriginal 13. NOTA: Esta ferramenta prevê as formas de derretimento das curvas para produtos heteroduplex e homoduplex.</li>
	<li>Para cada gene alvo, projete três pares de fragmentos genéticos (300-324 bp de comprimento). Cada par é composto por um fragmento com um local editado e um fragmento de tipo selvagem correspondente com um local não diutado, localizado na extremidade terminal de 5'terminal, posição média ou 3'-terminal final.</li>
	<li>Selecione o par não diutado/editado que mostrou a diferença máxima entre as regiões de fusão no eixo de helicidade para análise posterior. Para análise μTGGE, sintetize o fragmento genético selecionado por amplificação PCR, conforme descrito na seção 2 abaixo.</li>
	<li>Projete os primers para frente e para trás usando o software DNADynamo (https://www.bluetractorsoftware.com/DynamoDemo.htm) e verifique usando a ferramenta NCBI Primer-BLAST.</li>
	<li>Diluir os primers no buffer TE (10 mM Tris-HCl contendo 1 mM EDTA· Na2) e armazená-los a uma concentração de 100 pmol/μL. Antes de usar, diluir cada primer ajustado para uma concentração de 10 pmol/μL usando água destilada.</li>
</ol>2. Extração de RNA e amplificação RT-PCR do fragmento de destino
<ol><li>Extração de RNA<ol>
<li>Extrair RNA total da fonte de genes editados e não ditados usando métodos padrão, como a extração TRIzol14 ou kits disponíveis comercialmente.</li>
		<li>Realize a síntese do cDNA correspondente usando um protocolo RT-PCR padrão, conforme descrito na etapa 2.2.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Transcrição reversa<ol>
<li>Adicione 1 μL de primer oligo(dT), 1 μL de mistura dNTP de 10 mM, 10 μL de RNA total e 10 μL de água destilada estéril a um tubo de microcentrifuge sem nuclease.</li>
		<li>Aqueça a mistura a 65 °C por 5 min e depois incubar no gelo por pelo menos 1 min.</li>
		<li>Colete o conteúdo do tubo por centrifugação em velocidade máxima (12.000 x g) para 2-3 s, e adicione 4 μL de tampão 5x ReverTra Ace, 1 μL de 0,1 M DTT e 1 μL de M-MLV (Moloney Murine Leucemia Virus) transcrição reversa (200 U/μL, Tabela de Materiais).</li>
		<li>Misture por pipetting para cima e para baixo suavemente. Se usar primers aleatórios, incubar o tubo a 25 °C por 5 min.</li>
		<li>Incubar o tubo a 55 °C por 60 min e, em seguida, inativar a reação aquecendo a 70 °C por 15 min, em um aquecedor digital seco/bloco.</li>
		<li>Meça a concentração de cDNA usando um espectotômetro e armazene-a a -25 °C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Amplificação pcr e sequenciamento confirmatório de produtos
	<ol>
<li>Adicione os seguintes reagentes a um tubo de microcentrifuge sem nuclease: 4 μL de 5x Taq Polymerase Buffer, 2 μL de 2 mM dNTP mix, 2 μL de 25 mM MgCl2, 1,6 μL do conjunto primer (para frente e para trás; cada 10 mM), 2 μL de modelo cDNA, 0,1 μL de polimerase Taq (2,5 U/μL) e 8,3 μL de água destilada estéril (volume final, 20 μL).</li>
		<li>Realizar PCR com as seguintes condições de ciclismo: desnaturação inicial a 95 °C por 2 min; 35 ciclos de desnaturação a 95 °C por 2 min, ressarnamento a uma temperatura adequada (dependendo do conjunto específico de primer utilizado) para 30 s, e extensão a 72 °C por 2 min; e, em seguida, uma extensão final a 72 °C para 7 min.</li>
		<li>Para purificar os produtos PCR, adicione 2 U de Exonuclease I e 0,5 U de fosfatase alcalina de camarão (ExoSAP). Incubar o tubo em um cicloviário térmico a 37 °C por 1h, seguido de 80 °C por 15 min e, em seguida, manter a 4 °C até o próximo passo.</li>
		<li>Para sequenciamento confirmatório, adicione 11,5 μL de água destilada estéril, 2,5 μL de primer dianteiro ou reverso e 1 μL de produtos PCR (com ExoSAP) a um novo tubo de microcentrifuge. NOTA: Use serviços de sequenciamento de DNA (por exemplo, Genômica Eurofins) para análise de sequenciamento.</li>
		<li>Para validar a especificidade dos produtos PCR, realize o sequenciamento com primers dianteiros e invertidos. Os pares de primer utilizados na análise representativa são dados na Tabela 1.</li>
		<li>Diluir os produtos PCR purificados a uma concentração de 200 ng/μL com água deionizada. Em seguida, misture 6 μL do produto purificado com 3 μL de corante de carregamento de gel de 6x em um tubo de 250 μL e eleve o volume total para 12 μL com água estéril. Armazene o produto PCR (a -25 °C) até que esteja pronto para prosseguir com o μTGGE conforme descrito abaixo.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. análise μTGGE
NOTA: A análise μTGGE é realizada utilizando um sistema miniaturizado e econômico. Uma visão geral do sistema completo, incluindo as fitas de gel, porta-fitas de gel, plataforma horizontal de eletroforese de gel, fonte de alimentação e sistema de imagem de gel, é mostrada na Figura 2.
<ol><li>Montagem das fitas de gel<ol>
<li>O de gel usado para análise μTGGE é mostrado na Figura 2A. O design consiste em três placas de gel de 1 polegada: uma placa de gel inferior, uma placa de gel superior, e uma placa de pista anterior. Sanduiche a placa de gel superior entre as outras duas placas e monte no porta-fitas de gel para polimerização de gel.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparação de gel de poliacrilamida<ol>
<li>Adicione 7,2 g de ureia a um tubo de 50 mL e dissolva em 10 mL de água estéril. Aqueça a amostra em um micro-ondas para 20-30 s e, em seguida, leve-a à temperatura ambiente (RT).</li>
		<li>Adicione 3 mL de tampão tris/borate/EDTA (TBE) (Tabela de Materiais), 2,25 mL de 40% (w/v) acrilamida/bis (19:1), 75 μL de persulor de amônio 10x e 15 μL de tetrametilenodiamina à solução.</li>
		<li>Despeje imediatamente a solução de gel no suporte de de gel lentamente, evitando a formação de bolhas de ar.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Geração de perfis de fusão usando a unidade μTGGE<ol>
<li>Use a versão miniaturizada e econômica do aparelho μTGGE mostrado na Figura 2 com um gradiente de temperatura (25-65 °C) definido perpendicular à direção da migração de DNA.</li>
		<li>Mergulhe as almofadas tampão de eletroforese superior e inferior (0,5 cm x 2,5 cm) em 2 mL de tampão TBE 1x.</li>
		<li>Coloque o de gel na unidade horizontal de câmara de eletroforese e posicione as almofadas tampão superior e inferior em conformidade, conforme mostrado na Figura 2.</li>
		<li>Em seguida, carregue 10 μL do produto PCR no meio (mais longo) bem e 1 μL do produto PCR em cada lado bem.</li>
		<li>Após uma espera de 1 minuto, conecte a unidade de alimentação e forneça 100 V por 12 minutos a um gradiente linear de temperatura de 25-65 °C.</li>
		<li>Depois que a corrida tiver sido concluída, retire o e remova a tampa superior do vidro.</li>
		<li>Despeje 300 μL de 10x mancha de ouro SYBR no gel. Visualize os perfis de fusão usando a lanterna LED azul instalada no dispositivo eletroforético do tamanho da palma da mão. NOTA: Um arquivo macio da imagem em gel deve ser salvo para o cálculo de Pontuação de Similaridade padrão (PaSS).</li>
		<li>Repita cada experimento eletroforético 3x para confirmar a reprodutibilidade dos dados.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Cálculos pass
NOTA: Os cálculos são realizados utilizando o software μTGGE Analyzer.
<ol><li>Baixe e abra o software.</li>
	<li>Abra o arquivo JPEG contendo a imagem em gel. Observe que o software só aceitará arquivos de formato JPEG.</li>
	<li>Clique no botão Quadro e selecione a área apropriada (quadro) da imagem em gel.</li>
	<li>Clique no botão De correção de coordenadas e adicione dois pontos de referência, como mostrado na Figura 1B.</li>
	<li>Clique no botão Adição de Pontos de Recurso e adicione pontos de amostra conforme mostrado na Figura 1B. Em seguida, salve os dados de imagem de gel processados no formato μTGGE (*.tgg).</li>
	<li>Clique no botão Amostrar e selecione a opção Pesquisar por Pontos Simples para comparar duas ou mais imagens.</li>
</ol>

<ol><li>Chateigner-Boutin, A. L., Small, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+high-throughput+method+for+the+detection+and+quantification+of+RNA+editing+based+on+high-resolution+melting+of+amplicons%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">A rapid high-throughput method for the detection and quantification of RNA editing based on high-resolution melting of amplicons.</a> Nucleic Acids Research. 35 (17), 114(2007).</li>
<li>Chen, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+real-time+PCR+method+for+the+quantitative+analysis+of+RNA+editing+at+specific+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A real-time PCR method for the quantitative analysis of RNA editing at specific sites.</a> Analytical Biochemistry. 375 (1), 46-52 (2008).</li>
<li>Barbon, A., Vallini, I., La Via, L., Marchina, E., Barlati, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamate+receptor+RNA+editing%3A+a+molecular+analysis+of+GluR2%2C+GluR5+and+GluR6+in+human+brain+tissues+and+in+NT2+cells+following+in+vitro+neural+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Glutamate receptor RNA editing: a molecular analysis of GluR2, GluR5 and GluR6 in human brain tissues and in NT2 cells following in vitro neural differentiation.</a> Molecular Brain Research. 117 (2), 168-178 (2003).</li>
<li>Gallo, A., Thomson, E., Brindle, J., O'Connell, M. A., Keegan, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-processing+events+in+mRNAs+identified+by+DHPLC+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Micro-processing events in mRNAs identified by DHPLC analysis.</a> Nucleic Acids Research. 30 (18), 3945-3953 (2002).</li>
<li>Schiffer, H. H., Heinemann, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Quantitative+method+to+detect+RNA+editing+events%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A Quantitative method to detect RNA editing events.</a> Analytical Biochemistry. 276 (2), 257-260 (1999).</li>
<li>Burns, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+serotonin-2C+receptor+G-protein+coupling+by+RNA+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Regulation of serotonin-2C receptor G-protein coupling by RNA editing.</a> Nature. 387 (6630), 303-308 (1997).</li>
<li>Marian, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+bottleneck+in+genetic+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">The bottleneck in genetic testing.</a> Circulation Research. 117 (7), 586-588 (2015).</li>
<li>Bird, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+biology%3A+Not+drowning+but+waving%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Genome biology: Not drowning but waving.</a> Cell. 154 (5), 951-952 (2013).</li>
<li>Jones, B. M., Knapp, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+temperature+gradient+electrophoresis+for+detection+of+single+nucleotide+polymorphisms%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Temporal temperature gradient electrophoresis for detection of single nucleotide polymorphisms.</a> Methods in Molecular Biology. 578, Clifton, N.J. 153-165 (2009).</li>
<li>Riesner, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temperature-gradient+gel+electrophoresis+of+nucleic+acids%3A+analysis+of+conformational+transitions%2C+sequence+variations%2C+and+protein-nucleic+acid+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Temperature-gradient gel electrophoresis of nucleic acids: analysis of conformational transitions, sequence variations, and protein-nucleic acid interactions.</a> Electrophoresis. 10 (5-6), 377-389 (1989).</li>
<li>Biyani, M., Nishigaki, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hundred-fold+productivity+of+genome+analysis+by+introduction+of+micro-temperature+gradient+gel+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Hundred-fold productivity of genome analysis by introduction of micro-temperature gradient gel electrophoresis.</a> Electrophoresis. 22 (1), 23-28 (2001).</li>
<li>Rathore, H., Biyani, R., Kato, H., Takamura, Y., Biyani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Palm-size+and+one-inch+gel+electrophoretic+device+for+reliable+and+field-applicable+analysis+of+recombinase+polymerase+amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Methods%22%5BJournal%5D)">Palm-size and one-inch gel electrophoretic device for reliable and field-applicable analysis of recombinase polymerase amplification.</a> Analytical Methods. 11 (39), 4969-4976 (2019).</li>
<li>Dwight, Z., Palais, R., Wittwer, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((uMELT%3A+prediction+of+high-resolution+melting+curves+and+dynamic+melting+profiles+of+PCR+products+in+a+rich+web+application%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">uMELT: prediction of high-resolution melting curves and dynamic melting profiles of PCR products in a rich web application.</a> Bioinformatics. 27 (7), 1019-1020 (2011).</li>
<li>Rio, D. C., Ares, M., Hannon, G. J., Nilsen, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+RNA+using+TRIzol+%28TRI+Reagent%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Purification of RNA using TRIzol (TRI Reagent).</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (6), (2010).</li>
<li>Bhakta, S., Sakari, M., Tsukahara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+editing+of+BFP%2C+a+point+mutant+of+GFP%2C+using+artificial+APOBEC1+deaminase+to+restore+the+genetic+code%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">RNA editing of BFP, a point mutant of GFP, using artificial APOBEC1 deaminase to restore the genetic code.</a> Scientific Reports. 10 (1), 17304(2020).</li>
<li>Azad, T. A., Qulsum, U., Tsukahara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+activity+of+adenosine+deaminase+acting+on+RNA+%28ADARs%29+isoforms+for+correction+of+genetic+code+in+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Comparative activity of adenosine deaminase acting on RNA (ADARs) isoforms for correction of genetic code in gene therapy.</a> Current Gene Therapy. 19 (1), 31-39 (2019).</li>
<li>Ruchika, O. C., Sakari, M., Tsukahara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+identification+of+U-To-C+RNA+editing+events+for+nuclear+genes+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Genome-wide identification of U-To-C RNA editing events for nuclear genes in Arabidopsis thaliana.</a> Cells. 10 (3), 635(2021).</li>
<li>Tsukahara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+U-to-C+RNA+editing+affects+the+mRNA+stability+of+nuclear+genes+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">The U-to-C RNA editing affects the mRNA stability of nuclear genes in Arabidopsis thaliana.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 571, 110-117 (2021).</li>
</ol>

Os autores não declaram conflitos de interesse.

A edição de RNA desempenha um papel importante na biologia; no entanto, os métodos atuais de detecção da edição de RNA, como cromatografia e sequenciamento, apresentam vários desafios devido ao seu alto custo, exigências de tempo excessivo e complexidade. O protocolo descrito aqui é um método simples, rápido e econômico de detectar a edição de RNA que usa um sistema portátil, microdimensionado, baseado em TGGE. Este sistema pode ser usado para diferenciar entre genes editados e não dilatados antes do sequenciamento de Sa...

Variantes de nucleotídeos únicos (SNVs) em RNA genômica, incluindo variantes A-to-I, C-to-U e U-to-C, podem indicar eventos de edição de RNA. No entanto, a detecção de SNVs no RNA continua sendo uma tarefa tecnicamente desafiadora. Convencionalmente, a razão de RNA editado para RNA não diquedado é determinada por sequenciamento direto, reação em cadeia de polimerase em tempo real (PCR) específica de alelo ou cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC) se aproximade 1,2,3,4,5,6. No entanto, essas abordagens não são particularmente tempo ou custo-benefício, e suas baixas precisãos, causadas por altos níveis de ruído, representam gargalos tecnológicos para a detecção de SNV baseada em RNA 7,8. Aqui, descrevemos um protocolo baseado na eletroforese de gel gradiente de temperatura (TGGE) para identificar polimorfismos de nucleotídeos únicos (SNPs) como um método alternativo que elimina a necessidade de abordagens diretas de sequenciamento de RNA para análises de edição de RNA.
A eletroforese é um método preferido para a separação e análise de biomoléculas em laboratórios de ciências da vida. O TGGE permite a separação de fragmentos de DNA de duplas vertentes que têm o mesmo tamanho, mas têm sequências diferentes. A técnica conta com diferenças relacionadas à sequência nas temperaturas de fusão dos fragmentos de DNA e mudanças subsequentes em suas mobilidades em géis porosos com um gradiente linear de temperatura 9,10. O derretimento de fragmentos de DNA gera perfis específicos de fusão. Uma vez que o domínio com a menor temperatura de fusão atinge a temperatura correspondente em uma posição particular no gel, a transição de uma estrutura helicoidal para uma estrutura parcialmente derretida ocorre, e a migração da molécula praticamente parará. Portanto, o TGGE utiliza tanto a mobilidade (informação de tamanho) quanto transições estruturais induzidas pela temperatura de fragmentos de DNA (informações dependentes de sequências), tornando-se uma abordagem poderosa para a caracterização de fragmentos de DNA. Os pontos de característica em um padrão de fusão TGGE, que correspondem a três transições estruturais da molécula de DNA, são o ponto de dissociação inicial da cadeia, o ponto de dissociação do fio médio e o ponto de dissociação final do fio (Figura 1). Variações sequenciais dentro dos domínios, mesmo diferenças de base única, afetam a temperatura de fusão, portanto, moléculas com diferentes sequências mostrarão padrões discretos de fusão (desnaturação) nas análises TGGE. Portanto, o TGGE pode ser usado para analisar SNVs no RNA genômico e pode ser um método inestimável de alto rendimento de detectar edição de RNA. Este ganho de alta produtividade é perdido quando o TGGE tradicional baseado em eletroforese em gel é usado. No entanto, uma versão miniaturizada de TGGE, chamada microTGGE (μTGGE), pode ser usada para encurtar o tempo eletroforético do gel e acelerar a análise com um aumento de 100 vezes na produtividade11. A simplicidade e compactação do método μTGGE foram melhoradas com a introdução do PalmPAGE12, um sistema de eletroforese gel aplicável em campo, portátil e acessível.
Aqui, um novo protocolo baseado em TGGE é usado para examinar três tipos de sites de edição de RNA (A-to-I, C-to-U e U-to-C) em quatro genes, incluindo dois de tecidos arabidopsis thaliana e dois expressos em células de mamíferos HEK293 (Figura 1A). O protocolo integra o uso do PalmPAGE (hardware), um sistema portátil para detecção rápida de edição de RNA e uMelt (software)13. Com um tempo médio de execução de 15-30 minutos, este protocolo permite uma identificação rápida, confiável e fácil da edição de RNA sem a necessidade de abordagens diretas de sequenciamento de RNA.

<table><tbody><tr><td>2U ExoI</td><td>Takara</td><td>2650A</td><td>Exonuclease I</td></tr><tr><td>40(v/v)%-acrilamida/bis (19:1)</td><td>Thermo fisher</td><td>AM9022</td><td></td></tr><tr><td>Persulfato de amônio (APS)</td><td>Thermo Fisher</td><td>17874</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge Mini spin</td><td>eppendorf</td><td>5452000034</td><td></td></tr><tr><td>Banho seco/aquecedor digital</td><td>Thermo fisher</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Mistura Master de Polimerase Gold Taq</td><td>Promega</td><td>M7122</td><td></td></tr><tr><td>DNA polimerase LATaq</td><td>TAKARA</td><td>RR002A</td><td>Taq Polimerase</td></tr><tr><td>micro-TGGE&nbsp; Suporte para</td><td>BioSeeds Corp.</td><td>BS-GE-CH</td><td></td></tr><tr><td>Aparelho micro-TGGE</td><td>Lifetech Corp.</td><td>TG</td><td></td></tr><tr><td>micro-TGGE gel</td><td>BioSeeds Corp.</td><td>BS-TGGE-C</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 1000</td><td>Thermo fisher</td><td>ND-1000</td><td>Espectrofotômetro</td></tr><tr><td>Kit Plant Rneasy Mini</td><td>Qiagen</td><td>74904</td><td></td></tr><tr><td>ReverTra Ace Master Mix</td><td>TOYOBO</td><td>TRT101</td><td>M-MLV (Vírus da Leucemia Moloney Murina) transcriptase reversa</td></tr><tr><td>Kit Rneasy Mini</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>Fosfatase alcalina de camarão</td><td>Takara</td><td>2660B</td><td></td></tr><tr><td>Coloração em gel de ácido nucleico de ouro SYBR</td><td>Thermo fisher</td><td>S11494</td><td></td></tr><tr><td>Buffer TBE</td><td>Thermo fisher</td><td>B52</td><td></td></tr><tr><td>Tetrametiletilediamina (TEMED)</td><td>Tesque de Nacalai</td><td>33401-72</td><td></td></tr><tr><td>Ureia, nuclease e protease testadas</td><td>Tesque de Nacalai</td><td>35940-65</td><td></td></tr></tbody></table>

uma abordagem não-sequencial para a detecção rápida da edição de rna

A Nonsequencing Approach for the Rapid Detection of RNA Editing

A edição de RNA é um processo que leva a alterações de sequência pós-transcricional em RNAs. A detecção e quantificação da edição de RNA dependem principalmente de técnicas de sequenciamento de Sanger e sequenciamento de RNA. No entanto, esses métodos podem ser caros e demorados. Neste protocolo, um sistema portátil de eletroforese de gel de microtemperature (μTGGE) é usado como uma abordagem de não-sequenciamento para a rápida detecção da edição de RNA. O processo é baseado no princípio da eletroforese, que usa altas temperaturas para desnaturar amostras de ácido nucleico enquanto se movem através de um gel de poliacrilamida. Através de uma série de temperaturas, um fragmento de DNA forma um gradiente de DNA totalmente duplo para fios parcialmente separados e, em seguida, para DNA totalmente separado de uma única cadeia. Sites editados por RNA com bases nucleotídeas distintas produzem diferentes perfis de fusão em análises μTGGE. Utilizamos a abordagem baseada em μTGGE para caracterizar as diferenças entre os perfis de fusão de quatro fragmentos de RNA editados e seus fragmentos não ditados correspondentes (tipo selvagem). Os Escores de Similaridade do Padrão (PaSSs) foram calculados comparando-se os padrões de banda produzidos pelas RNAs editadas e não diutadas e foram utilizados para avaliar a reprodutibilidade do método. No geral, a plataforma descrita aqui permite a detecção de mutações de base única em RNAs de forma simples, simples e econômica. Espera-se que esta ferramenta de análise ajude novas descobertas de biologia molecular.

Uso de μTGGE para identificar mudanças de base de nucleotídeos únicos em eventos de edição de RNA Quatro genes editados foram usados para este protocolo (Tabela 1), incluindo o gene BFP produzido em células HEK293 (com edição de RNA C-to-U pelas enzimas desaminase do complexo de enzimas de edição de mRNA apolipoproteína B; APOBEC115), o gene EGFP contendo o codon ocre stop (TAA) produzido em células HEK293 (com edição de RNA A-to-I por adenosina deaminase atuan...

A detecção rápida e a quantificação confiável dos eventos de edição de RNA em escala genômica permanecem desafiadoras e atualmente dependem de métodos de sequenciamento direto de RNA. O protocolo descrito aqui usa a eletroforese de gel de gradiente de microtemperatura (μTGGE) como um método simples, rápido e portátil de detectar a edição de RNA.

Uma abordagem não-sequencial para a detecção rápida da edição de RNA

RNA editing is a process that leads to posttranscriptional sequence alterations in RNAs. Detection and quantification of RNA editing rely mainly on Sanger ...

A edição de RNA tem um papel crítico na doença humana. Cientistas estão encontrando aplicação sem fim nos medicamentos. Este protocolo demonstra a aplicação da tecnologia de eletroforese de temperatura portátil como uma abordagem não sequenciamento para a identificação rápida e confiável da modificação do RNA na edição de RNA sem a necessidade de sequenciamento direto do RNA.A abordagem baseada em micro tTG foi utilizada para caracterizar as diferenças entre o perfil de fusão de quatro fragmentos de RNA editados e seus fragmentos não editados correspondentes. Os escores de similaridade padrão foram utilizados para avaliar a reprodutibilidade do método. Esta plataforma permite a detecção de uma substituição única em RNAs, de forma simples, simples e econômica.Espera-se que esta ferramenta analítica ajude a nova descoberta na biologia molecular Comece identificando fragmentos genéticos com diferentes perfis de fusão e gere curvas de fusão previstas usando a ferramenta baseada na web Umelt HETS. Projete três pares de 300 a 324 fragmentos genéticos de par de base para cada gene alvo. Selecione o par não editado ou editado que mostre a diferença máxima entre as regiões de fusão no eixo

a-nonsequencing-approach-for-the-rapid-detection-of-rna-editing

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Bioengineering

Bioengenharia

Devido à natureza transitória do pré-mRNA, pode ser difícil isolar e...

Um método rápido de alta capacidade para Ribonucleoproteínas Mapping (RNPs) no pré-mRNA Humanos

Um ensaio baseado em ribozima altamente sensível, aplicável à triagem de alto rendimento de produtos químicos direcionados ao processo exclusivo de edição de RNA em patógenos tripanossomatídeos, é descrito neste artigo. Os inibidores podem ser usados como ferramentas para análise orientada por hipóteses do processo de edição de RNA e, finalmente, como terapêutica.

RNA Catalisador como repórter para Triagem Drogas contra edição de RNA em Tripanossomas

Aqui nós descrevemos um protocolo teve como objetivo investigar o impacto do splicing aberrante na resistência aos medicamentos em tumores sólidos e doenças malignas hematológicas. Para este objetivo, foram analisados os perfis transcriptomic de modelos parentais e resistentes in vitro através de RNA-seq e estabeleceu um método baseado qRT-PCR para validar genes candidatos.

Usando RNA-sequenciação para detectar Novel Splice variantes relacionadas à resistência aos medicamentos em<em&gt; In Vitro</em&gt; modelos de cancro

Sequenciamento de próxima geração (NGS) é uma poderosa ferramenta para a caracterização do genoma que é limitada pela taxa de erro elevada da plataforma (~0.5–2.0%). Descrevemos os nossos métodos de sequenciamento de correção de erro que permitam obviar a taxa de erro NGS e detectar mutações em fracções de alelo variante tão raras como 0,0001.

Deteção de evento raro usando o DNA de correção de erro e a sequenciação do ARN

Aqui nós apresentamos um protocolo para o clivagem dnazyme-dependente do RNA. Isto permite a análise rápida e local-dependente do RNA 2 '-O-methylation. Esta aproximação pode ser usada para a avaliação preliminar ou principal da atividade do snoRNA.

Análise DNAzyme-dependente de rRNA 2 '-O-methylation

Nós apresentamos um protocolo pequeno detalhado da reparação da biblioteca do RNA com menos viés do que métodos padrão e uma sensibilidade aumentada para 2 '-O-methyl RNAs. Este protocolo pode ser seguido usando reagentes caseiros para economizar custos ou usar kits para conveniência.

Melhorando O RNA-Seq pequeno: menos polarização e melhor deteção de 2 '-O-methyl RNAs

Aqui, descrevemos um protocolo detalhado para um método de sequenciamento baseado em LC-MS que pode ser usado como um método direto para sequenciar RNA curto (&lt;35 nt por execução) sem um intermediário de cDNA e como um método geral para sequenciar diferentes modificações de nucleotídeos em um único estudo com precisão de base única.

2D-HELS MS Seq: Um método geral baseado em LC-MS para sequenciamento direto e de novo de misturas de RNA com diferentes modificações de nucleotídeos

O splicing alternativo (AS) e a poliadenilação alternativa (APA) expandem a diversidade de isoformas de transcritos e seus produtos. Aqui, descrevemos protocolos de bioinformática para analisar ensaios de RNA-seq em massa e sequenciamento final de 3' para detectar e visualizar AS e APA variando entre condições experimentais.

Identificação de Splicing Alternativo e Poliadenilação em Dados de RNA-seq

A entrega de editores genômicos como RNAs é um meio particularmente potente de modificar os genomas das células primárias e linhagens celulares de mamíferos. O objetivo desse protocolo é entregar editores genômicos como mRNA em células e linhagens celulares primárias de mamíferos, seguido por sequenciamento e análise direcionados da Illumina para quantificar os resultados da edição.

Edição do Genoma em Células Primárias de Mamíferos por Eletroporação do RNA Editor

Detecção biomolecular quantitativos, de alto rendimento, em tempo real, sem rótulo e (DNA, proteínas, etc) em...

Detecção de Biomolecular empregando o sensor de imagem Interferometric Reflectância (IRIS)

Aprenda a detectar edição de RNA rapidamente usando eletroforese em gradiente de temperatura (µTGGE). Este método portátil e econômico identifica modificações de RNA sem sequenciamento direto, facilitando pesquisas em biologia molecular e doenças.

Uma abordagem não-sequencial para a detecção rápida da edição de RNA

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