A genotipagem rápida de tecido Mouse Usando Extract-N-Amp Tissue Sigma PCR Kit

Olá, meu nome é Linda e trabalho no laboratório do Dr. Edwin Niki na Universidade da Califórnia em Irvine. Hoje vou mostrar como utilizo o kit de extração de tecido PCR com SYBR Green da Stigma para genotipar rapidamente camundongos transgênicos. Normalmente uso este kit para genotipar nossos camundongos embrionários quando estou realizando culturas de células dissociadas agudamente e preciso descobrir rapidamente o genótipo do nosso camundongo.

Mas, para os fins de hoje, temos caudas de camundongos adultos nas quais posso mostrar como uso este kit. Este protocolo envolve uma digestão com ale rápido e extração de DNA, seguido por uma etapa rápida de neutralização. E utilizamos o DNA extraído em uma PCR em tempo real, na qual podemos monitorar nossos amplicons de PCR.

Então, se você estiver pronto, vamos começar. Antes de iniciarmos, precisamos garantir que nosso bloco térmico esteja ajustado a 95 graus Celsius, que nosso cyber green esteja descongelado e mantido sobre gelo até o momento de uso, e que nossos outros reagentes estejam descongelando à temperatura ambiente. No meu recipiente de gelo, tenho os dois iniciadores que usaremos para genotipagem, os quais foram especificamente desenhados para nosso gene de interesse e validados para qPCR.

Eu também tenho meu controle positivo para o gene de interesse e meu controle negativo, além de uma amostra de tecido que já coletei de um camundongo adulto. Agora, quando você coletar sua amostra de tecido, é muito importante ser extremamente rigoroso. Quando coletamos caudas de camundongos embrionários, sempre lavamos nossa pinça com etanol 70% antes e entre cada coleta de tecido.

E nós sempre lavamos as amostras de cauda primeiro em TBS; é necessário preparar uma mistura mestra da preparação do tecido e extração de DNA para cada cauda. Você precisará de 100 microlitros da solução de extração e 25 microlitros da solução de preparação do tecido. Vou usar minha pipeta P 200 e ponteiras de pipeta com filtro para medir 100 microlitros da solução de extração e 25 microlitros da solução de preparação do tecido em um novo tubo eppendorf. Você deverá misturar bem a solução da mistura mestra pipetando para cima e para baixo.

E então você vai querer adicionar 125 microlitros da sua mistura-mestra ao seu tubo de interesse, certificando-se de que, se for uma cauda de camundongo adulto, a extremidade cortada esteja completamente submersa na solução da mistura-mestra, podendo agitar levemente com o dedo e incubando-a à temperatura ambiente por 10 minutos. Durante a incubação de 10 minutos, prepararei minha mistura-mestra verde favorita, que envolve a mistura-mestra verde cider incluída no kit, água milli Q ou de grau PCR e nossos iniciadores, um pouco de água de grau PCR e nossos iniciadores direto e reverso. É só isso.

Agora que o tempo de incubação de 10 minutos terminou, precisaremos aquecer e ativar a reação a 95 graus por três minutos. Nosso tempo de inativação de três minutos terminou e agora vamos adicionar a solução de neutralização fornecida no kit, adicionando cem microlitros por reação, e você deverá misturar isso por vortexagem. Após adicionar o tampão de neutralização, suas amostras de DNA podem ser armazenadas a quatro graus Celsius até que você esteja pronto para usá-las.

Na verdade, queremos nosso genótipo imediatamente. Então seguimos diretamente para a PCR em tempo real; minhas caudas estão neutralizadas e prontas. Meu mix mestre de PCR com SYBR Green está pronto, e tenho meus tubos de PCR montados em um bloco frio.

Tudo o que vou fazer agora é adicionar 16 microlitros da minha mistura-mestre a cada poço e, em seguida, adicionar quatro microlitros do extrato neutralizado ou quatro microlitros do controle positivo ou negativo a cada um. Bem, tudo o que estou fazendo é adicionar 16 microlitros de uma mistura-mestre a cada um dos poços. Em seguida, adicionarei quatro microlitros do extrato neutralizado aos 60 microlitros da mistura-mestre no poço, resultando em um volume total de reação de 20 microlitros.

E farei a mesma coisa para o controle positivo e negativo. Adicionando quatro microlitros a 16 microlitros com uma mistura mestra PPR. Depois que todos forem adicionados, você pode tampá-los com uma tira de oito tampas opticamente transparentes.

Você deve ter cuidado para não tocar na parte opticamente transparente das tampas que estão sobre suas amostras. Por isso, estou usando uma toalha de papel Kim para pressionar as tampas e garantir que estejam bem fechadas. Agitei suavemente a mistura de PCR e DNA em vórtex e as centrifuguei, e agora estamos prontos para colocá-las na máquina de QPCR.

O que vamos fazer é, primeiro, carregar nossas amostras na máquina de PCR Opticon e vou montar uma nova placa, na qual nosso primeiro poço será nossa amostra. Nosso segundo poço será o controle positivo e nosso terceiro poço será o controle negativo. Especificamos que nosso volume de reação é de 20 microlitros no total. Em seguida, vou carregar um protocolo que foi projetado para genotipagem rápida.

Este protocolo envolve uma etapa de desnaturação de três minutos, seguida por um ciclo de 15 segundos de desnaturação, 15 segundos de hibridização primária e então 20 segundos de extensão primária. Agora, o tempo da etapa de extensão primária pode realmente ser reduzido para cerca de 10 segundos, totalizando apenas 40 segundos por ciclo. Para cada ciclo, essas três etapas são repetidas cerca de 40 vezes, como em uma PCR normal, e ao final realizamos uma curva de dissociação.

Então, temos nossa placa preparada e nosso protocolo carregado. Tudo o que precisamos fazer agora é executar nossa QPCR, e ela está iniciando na etapa de desnaturação de três minutos. Com base na minha experiência, utilizando os iniciadores que estou usando e as amostras de cauda, além de procurar pelos genes que estou analisando, sei que meus resultados positivos começarão a aparecer por volta de 25 ciclos, cruzando um limiar de ciclo de significância.

Agora, o momento em que isso ocorre depende muito da sua amostra de tecido, do que você está procurando e da quantidade inicial de DNA presente. Assim, já podemos observar que nosso controle positivo já apareceu e parece que nossa amostra também é positiva. Como você pode ver, ela está começando a surgir um pouco após o nosso controle positivo.

Ainda teremos que esperar um pouco porque está apenas no ciclo 27, mas esperançosamente, em alguns ciclos a mais, poderemos ter certeza de que a nossa amostra é positiva e, então, poderei prosseguir com o meu experimento. Neste momento, você pode ver o controle negativo começando a aparecer, e isso ocorre porque coletei um excesso de cauda. Isso ajuda a garantir que qualquer resultado que apareça antes desse excesso da cauda negativa será positivo.

Portanto, nesse ponto, qualquer coisa que apareça antes do negativo, considero positiva e prossigo com meu experimento. Após a conclusão dos ciclos de PCR, a máquina realiza uma análise de curva de dissociação. Isso ajudará você a determinar a composição e a pureza do seu produto.

Com isso, é possível verificar se você escolheu corretamente as amostras positivas e negativas. Por exemplo, a amostra positiva apresentará um pico específico e acentuado de temperatura de fusão, correspondente a um produto específico de PCR amplificado. Quaisquer amostras negativas terão um pico amplo e inespecífico de temperatura de fusão, correspondente ao DNA inespecífico que foi amplificado durante a PCR.

Então, acabei de mostrar como utilizamos o extrator de amplicons Cyber Green da Sigma para genotipar rapidamente caudas de camundongos adultos. No entanto, este kit pode ser usado com diversos tecidos animais, pelos, saliva, e eu o utilizo para genotipar caudas de embriões de camundongos. Gostamos de usar este kit porque é rápido.

Posso obter meu genótipo de volta em uma hora, e é muito conveniente e simples. Então, obrigado por assistir e boa sorte.