Name: Cromatografia de Exclusão de Tamanho para Separação de Vesículas Extracelulares de Meios de Cultura Celular Condicionada (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 46 s
Description: Aprenda a separar vesículas extracelulares de meios de cultura celular condicionada usando cromatografia de exclusão de tamanho. Este método eficiente permite caracterizar o conteúdo vesicular e estudar mecanismos de comunicação intercelular.

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Os autores gostariam de agradecer à Penn State Behrend e à Hamot Health Foundation pelo financiamento, bem como à Penn State Microscopy Facility em University Park, PA.

<ol><li>Pan, B. T., Teng, K., Wu, C., Adam, M., Johnstone, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+microscopic+evidence+for+externalization+of+the+transferrin+receptor+in+vesicular+form+in+sheep+reticulocytes%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Electron microscopic evidence for externalization of the transferrin receptor in vesicular form in sheep reticulocytes.</a> The Journal of Cell Biology. 101 (3), 942-948 (1985).</li>
<li>Harding, C., Heuser, J., Stahl, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Receptor-mediated+endocytosis+of+transferrin+and+recycling+of+the+transferrin+receptor+in+rat+reticulocytes%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Receptor-mediated endocytosis of transferrin and recycling of the transferrin receptor in rat reticulocytes.</a> The Journal of Cell Biology. 97 (2), 329-339 (1983).</li>
<li>Valadi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosome-mediated+transfer+of+mRNAs+and+microRNAs+is+a+novel+mechanism+of+genetic+exchange+between+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Exosome-mediated transfer of mRNAs and microRNAs is a novel mechanism of genetic exchange between cells.</a> Nature Cell Biology. 9 (6), 654-659 (2007).</li>
<li>Raposo, G., Stoorvogel, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles%3A+Exosomes%2C+microvesicles%2C+and+friends%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles: Exosomes, microvesicles, and friends.</a> The Journal of Cell Biology. 200 (4), 373-383 (2013).</li>
<li>Rontogianni, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+profiling+of+extracellular+vesicles+allows+for+human+breast+cancer+subtyping%5BTitle%5D)+AND+%22Communications+Biology%22%5BJournal%5D)">Proteomic profiling of extracellular vesicles allows for human breast cancer subtyping.</a> Communications Biology. 2 (1), 1-13 (2019).</li>
<li>Lane, R. E., Korbie, D., Hill, M. M., Trau, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles+as+circulating+cancer+biomarkers%3A+opportunities+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles as circulating cancer biomarkers: opportunities and challenges.</a> Clinical and Translational Medicine. 7 (1), 14(2018).</li>
<li>Thompson, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles+in+neurodegenerative+disease-pathogenesis+to+biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neurology%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles in neurodegenerative disease-pathogenesis to biomarkers.</a> Nature Reviews Neurology. 12 (6), 346-357 (2016).</li>
<li>O'Brien, K., Ughetto, S., Mahjoum, S., Nair, A. V., Breakefield, X. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uptake%2C+functionality%2C+and+re-release+of+extracellular+vesicle-encapsulated+cargo%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Uptake, functionality, and re-release of extracellular vesicle-encapsulated cargo.</a> Cell Reports. 39 (2), 110651(2022).</li>
<li>Joshi, B. S., de Beer, M. A., Giepmans, B. N. G., Zuhorn, I. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocytosis+of+extracellular+vesicles+and+release+of+their+cargo+from+endosomes%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Endocytosis of extracellular vesicles and release of their cargo from endosomes.</a> ACS Nano. 14 (4), 4444-4455 (2020).</li>
<li>Théry, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+exosomes+from+cell+culture+supernatants+and+biological+fluids%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids.</a> Current Protocols in Cell Biology. 30 (1), 3-22 (2006).</li>
<li>Willms, E., Cabañas, C., Mäger, I., Wood, M. J. A., Vader, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicle+heterogeneity%3A+Subpopulations%2C+isolation+techniques%2C+and+diverse+functions+in+cancer+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicle heterogeneity: Subpopulations, isolation techniques, and diverse functions in cancer progression.</a> Frontiers in Immunology. 9, 738(2018).</li>
<li>Tzaridis, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicle+separation+techniques+impact+results+from+human+blood+samples%3A+Considerations+for+diagnostic+applications%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicle separation techniques impact results from human blood samples: Considerations for diagnostic applications.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (17), 9211(2021).</li>
<li>Liangsupree, T., Multia, E., Riekkola, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modern+isolation+and+separation+techniques+for+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatography+A%22%5BJournal%5D)">Modern isolation and separation techniques for extracellular vesicles.</a> Journal of Chromatography A. 1636, 461773(2021).</li>
<li>Gámez-Valero, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Size-exclusion+chromatography-based+isolation+minimally+alters+extracellular+vesicles%27+characteristics+compared+to+precipitating+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Size-exclusion chromatography-based isolation minimally alters extracellular vesicles' characteristics compared to precipitating agents.</a> Scientific Reports. 6 (1), 1-9 (2016).</li>
<li>Mol, E. A., Goumans, M. J., Doevendans, P. A., Sluijter, J. P. G., Vader, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Higher+functionality+of+extracellular+vesicles+isolated+using+size-exclusion+chromatography+compared+to+ultracentrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomedicine%3A+Nanotechnology%2C+Biology%2C+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Higher functionality of extracellular vesicles isolated using size-exclusion chromatography compared to ultracentrifugation.</a> Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine. 13 (6), 2061-2065 (2017).</li>
<li>Campos-Silva, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+sensitivity+detection+of+extracellular+vesicles+immune-captured+from+urine+by+conventional+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">High sensitivity detection of extracellular vesicles immune-captured from urine by conventional flow cytometry.</a> Scientific Reports. 9 (1), 2042(2019).</li>
<li>Norman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((L1CAM+is+not+associated+with+extracellular+vesicles+in+human+cerebrospinal+fluid+or+plasma%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+methods%22%5BJournal%5D)">L1CAM is not associated with extracellular vesicles in human cerebrospinal fluid or plasma.</a> Nature methods. 18 (6), 631-634 (2021).</li>
<li>Théry, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimal+information+for+studies+of+extracellular+vesicles+2018+%28MISEV2018%29%3A+a+position+statement+of+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles+and+update+of+the+MISEV2014+guidelines%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750(2018).</li>
<li>Mathieu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specificities+of+exosome+versus+small+ectosome+secretion+revealed+by+live+intracellular+tracking+of+CD63+and+CD9%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Specificities of exosome versus small ectosome secretion revealed by live intracellular tracking of CD63 and CD9.</a> Nature Communications. 12 (1), 1-18 (2021).</li>
<li>Guo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+a+simplified+dichotomic+size-exclusion+chromatography+for+isolating+extracellular+vesicles+toward+clinical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Establishment of a simplified dichotomic size-exclusion chromatography for isolating extracellular vesicles toward clinical applications.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 10 (11), 12145(2021).</li>
<li>Benedikter, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrafiltration+combined+with+size+exclusion+chromatography+efficiently+isolates+extracellular+vesicles+from+cell+culture+media+for+compositional+and+functional+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Ultrafiltration combined with size exclusion chromatography efficiently isolates extracellular vesicles from cell culture media for compositional and functional studies.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1-13 (2017).</li>
<li>Eslami, A., Lujan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Western+blotting%3A+sample+preparation+to+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Western blotting: sample preparation to detection.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (44), e2359(2010).</li>
<li>Grassucci, R. A., Taylor, D. J., Frank, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+macromolecular+complexes+for+cryo-electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Preparation of macromolecular complexes for cryo-electron microscopy.</a> Nature Protocols. 2 (12), 3239(2007).</li>
<li>Williams, R. L., Urbé, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+emerging+shape+of+the+ESCRT+machinery%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The emerging shape of the ESCRT machinery.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (5), 355-368 (2007).</li>
<li>Willms, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cells+release+subpopulations+of+exosomes+with+distinct+molecular+and+biological+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Cells release subpopulations of exosomes with distinct molecular and biological properties.</a> Scientific Reports. 6 (1), 1-12 (2016).</li>
<li>Lehrich, B. M., Liang, Y., Fiandaca, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Foetal+bovine+serum+influence+on+in+vitro+extracellular+vesicle+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Foetal bovine serum influence on in vitro extracellular vesicle analyses.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 10 (3), 12061(2021).</li>
<li>Kornilov, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+ultrafiltration-based+protocol+to+deplete+extracellular+vesicles+from+fetal+bovine+serum%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Efficient ultrafiltration-based protocol to deplete extracellular vesicles from fetal bovine serum.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1422674(2018).</li>
<li>Böing, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-step+isolation+of+extracellular+vesicles+by+size-exclusion+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Single-step isolation of extracellular vesicles by size-exclusion chromatography.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 3 (1), (2014).</li>
<li>Zhang, X., Borg, E. G. F., Liaci, A. M., Vos, H. R., Stoorvogel, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+three+step+protocol+to+isolate+extracellular+vesicles+from+plasma+or+cell+culture+medium+with+both+high+yield+and+purity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">A novel three step protocol to isolate extracellular vesicles from plasma or cell culture medium with both high yield and purity.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 9 (1), 1791450(2020).</li>
<li>Guerreiro, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+extracellular+vesicle+isolation+by+combining+cell+media+modifications%2C+ultrafiltration%2C+and+size-exclusion+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Efficient extracellular vesicle isolation by combining cell media modifications, ultrafiltration, and size-exclusion chromatography.</a> PLoS ONE. 13 (9), 02024276(2018).</li>
<li>Onódi, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+high-purity+extracellular+vesicles+by+the+combination+of+iodixanol+density+gradient+ultracentrifugation+and+bind-elute+chromatography+from+blood+plasma%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Isolation of high-purity extracellular vesicles by the combination of iodixanol density gradient ultracentrifugation and bind-elute chromatography from blood plasma.</a> Frontiers in Physiology. 9, 1479(2018).</li>
<li>Yuana, Y., Levels, J., Grootemaat, A., Sturk, A., Nieuwland, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-isolation+of+extracellular+vesicles+and+high-density+lipoproteins+using+density+gradient+ultracentrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Co-isolation of extracellular vesicles and high-density lipoproteins using density gradient ultracentrifugation.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 3 (1), (2014).</li>
</ol>

Os autores declaram não haver conflitos de interesse.

SEC é um método fácil de usar para separar adequadamente EVs de CCM condicionado. A fim de isolar especificamente os EVs derivados de células, deve-se levar em conta uma consideração cuidadosa do tipo de CCM e seus suplementos. Muitos meios de cultura celular precisam ser suplementados com FBS, que contém EVs derivados do animal em que o soro foi colhido. Esses EVs séricos podem saturar e mascarar qualquer sinal produzido por EVs derivados de células em cultura26. Portanto, ao realizar experimento...

A explosão de interesse no estudo de vesículas extracelulares (EVs) tem sido acompanhada por grandes avanços nas tecnologias e técnicas usadas para separar e estudar essas partículas heterogêneas de tamanho nano. No tempo desde sua descoberta, há quase quatrodécadas1,2, descobriu-se que essas pequenas estruturas membranosas contêm lipídios, ácidos nucleicos e proteínas bioativos e desempenham papéis importantes na comunicação intercelular 3,4. Os EVs são liberados de todos os tipos de células e, portanto, estão presentes em todos os fluidos biológicos, incluindo plasma sanguíneo e soro, saliva e urina. Os EVs dentro desses fluidos são uma grande promessa de servir como biomarcadores não invasivos para várias doenças, incluindo doenças neuroinflamatórias e neurodegenerativas, cânceres e distúrbios autoimunes 5,6,7. Além disso, estudos mecanicistas in vitro podem ser realizados por meio de técnicas de cultura celular, separando EVs liberados no meio de cultura 3,8,9.
Para entender o papel dos EVs na fisiopatologia da doença, a separação adequada do fluido em que eles são encontrados é primordial. O padrão-ouro para a separação de EV tem sido a ultracentrifugação diferencial (dUC)10, no entanto, técnicas mais sofisticadas surgiram para alcançar uma melhor separação de EVs de outros componentes extracelulares. Algumas dessas técnicas incluem gradientes de densidade, fração de fluxo assimétrico de campo-fluxo (A4F), citometria de fluxo, imunocaptura, precipitação de polietilenoglicol e cromatografia de exclusão de tamanho (SEC)11,12,13. Cada técnica tem seu próprio conjunto de vantagens e desvantagens; no entanto, a SEC, em particular, demonstrou separar os EVs de fluidos biológicos e sobrenadantes de cultura celular de forma bastante eficaz 8,14,15. A SEC também tem o bônus adicional de ser relativamente direta e fácil de usar.
SEC é um método que separa componentes de um fluido com base no tamanho. Com esta técnica, uma coluna de resina (feita internamente ou comprada comercialmente) é usada para fracionar uma amostra. Pequenas partículas na amostra ficam presas entre as contas dentro da resina, enquanto partículas maiores são capazes de passar pela resina mais livremente e, assim, eluir no início do processo. Como os EVs são maiores em tamanho do que muitas proteínas extracelulares e agregados proteicos, os EVs passam pela coluna mais rapidamente e eluem em frações mais precoces do que as proteínas extracelulares14.
Neste artigo de métodos, o uso de SEC para a separação de EVs de meios de cultura celular (CCM) de oligodendrócitos humanos sob condições de estresse de controle e retículo endoplasmático (RE) é descrito. Usando este protocolo, mostra-se que os EVs separados com esta técnica são encontrados dentro de frações específicas que podem ser agrupadas e concentradas para caracterização a jusante, e que os EVs separados são derivados de células e não de uma fonte exógena, como o soro fetal bovino (FBS) usado para complementar o CCM. A presença dos marcadores canônicos de EV, CD63, CD81 e CD916,17,18,19 nas frações EV, e sua ausência nas frações proteicas é demonstrada com western blotting. Usando microscopia eletrônica de transmissão (MET), os EVs são visualizados e exibem a morfologia esperada e são observados apenas na fração EV. As partículas também são contadas nas frações EV e proteína das condições de tensão de controle e ER, e um grande número de partículas dentro da faixa de tamanho esperada de 50-200 nm de diâmetro é observado nas amostras de EV. Juntos, esses dados apoiam a noção de que a SEC é um método eficiente e eficaz para separar os VEs dos meios de cultura celular.

<table><tbody><tr><td>2-Mercaptoetanol</td><td>VWR</td><td>97064-588</td><td></td></tr><tr><td>4X Tampão de Amostra Laemmli</td><td>Unidade</td><td></td> de Filtro Centrífugo BioRad 1610747 <td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra-15, Ultracel, 3 KDa, 15mL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>UFC900308</td> 3 <td>kDa de corte</td></tr> Unidade de <tr><td>Filtro Centrífugo Amicon Ultra-2 com membrana Ultracel-3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>UFC200324</td><td>3 kDa de corte de</td></tr><tr><td>amônio Persulfato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3678-100G</td><td></td></tr><tr><td>Anti coelho IgG, HRP ligado Anticorpo</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>7074V</td><td>1:1000 Diluição</td></tr><tr><td>Anti-Calnexina</td><td>anticorpo Abcam</td><td>&nbsp; ab22595</td><td>1:500 Anticorpo</td></tr><tr><td>monoclonal de camundongo anti-CD9</td> diluição <td>BioLegend</td><td>312102</td><td>1:500</td></tr><tr><td>anticorpo anti-GM130 de diluição [EP892Y] - cis-Golgi Marcador</td><td>Abcam</td><td>ab52649</td><td>1:500 Diluição</td></tr><tr><td>Anti-camundongo IgG, HRP-linked Anticorpo</td><td>Tecnologia de sinalização celular</td><td>7076V</td><td>1:1000 Diluição</td></tr><tr><td>Coletor automático de frações</td><td>Izon Science</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kit de ensaio BCA</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CCD câmera</td><td>Gatan Orius SC200</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cd63 Mouse anti BD humano</td><td></td><td>556019</td><td>1:1000 Diluição</td></tr><tr><td>CD81 Anticorpo</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-23962</td><td>1:1000 Diluição</td></tr><tr><td>Cellstar Filter Cap Frascos de cultura de células</td><td>Greiner Bio-One</td><td>660175</td><td></td></tr><tr><td>ChemiDoc MP Imager</td><td>BioRad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Clarity Western ECL Substrate</td><td>BioRad</td><td>1705061</td><td></td></tr><tr><td>desoxicolato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6750-10G</td><td></td></tr><tr><td>ditiotreitol</td><td>Sigma</td><td>3483-12-3</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/Alta glicose com L-glutamina; sem sódio</td><td>Cytiva</td><td>SH300022. </td><td></td></tr><tr><td>Soro bovino fetal FS Soro bovino premium</td><td>VWR</td><td>97068-085</td><td></td></tr><tr><td>Soro bovino fetal, esgotado com exossomo</td><td>Thermo Scientific</td><td>A2720801</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>BioRad</td><td>1610718</td><td></td></tr><tr><td>Leite em pó desnatado de grande valor</td><td>Amazon</td><td>B076NRD2TZ</td><td></td></tr><tr><td>HOG Linha celular de oligodendroglioma humano</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SCC163</td><td></td></tr><tr><td>Izon Science Usa Ltd qev Colunas de Exclusão de Tamanho 5pk</td><td>Izon Science</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Metanol >99,8% ACS</td><td>VWR</td><td>BDH1135-4LP</td><td></td></tr><tr><td>Placas de vidro Mini-PROTEAN</td><td>BioRad</td><td>1653310</td><td>com espaçadores de 0,75 mm</td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN Placas curtas</td><td>BioRad</td><td>1653308</td><td></td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>492016</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina, Solução</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4458-100mL</td><td></td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato PBS</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP66150</td><td></td></tr><tr><td>Pierce BCA Kits de ensaio de proteína e reagentes</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>23227</td><td></td></tr><tr><td>Pierce PVDF Membranas de transferência Thermo</td><td>Scientific</td><td>88518</td><td></td></tr><tr><td>Pierce Western Blotting Filter Paper</td><td>Thermo Scientific</td><td>84783</td><td></td></tr><tr><td>Polioxietileno-20 (TWEEN 20), 500mL</td><td>Bio Basic</td><td>TB0560</td><td></td></tr><tr><td>Coquetel Inibidor de Protease/fosfatase (100X)</td><td>Tecnologia de Sinalização Celular</td><td>5872S</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo Anti-TSG101 Recombinante [EPR7130(B)]</td><td>ABCam</td><td>ab125011</td><td>diluição 1:1000</td></tr><tr><td>Hidróxido de eslódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SX0603</td><td></td></tr><tr><td>Azida de sódio</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP922I-500</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de Sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888-500G</td><td></td></tr><tr><td>Dodecil sulfato de sódio,&ge; 99,0% (GC), pellets sem poeira</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>75746-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Tetrametiletilenodiamina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9281-25ML</td><td></td></tr><tr><td>TGX Kit de acrilamida FastCast sem manchas, 10%</td> <td>BioRad</td><td>1610183</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio eletrônico de transmissão</td><td>FEI Tecnai 12 Biotwin</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>BioRad</td><td>1610716</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina 0,25% protease com tripsina suína, HBSS, EDTA; sem cálcio, magnésio</td><td>Cytiva</td><td>SH30042.01</td><td></td></tr><tr><td>Tunicamicina</td><td>Tocris</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>Zeta Ver software</td><td>Analytik</td><td></td><td>NTA software</td></tr></tbody></table>

cromatografia de exclusão de tamanho para separação de vesículas extracelulares de meios de cultura celular condicionada

Size Exclusion Chromatography for Separating Extracellular Vesicles from Conditioned Cell Culture Media

As vesículas extracelulares (EVs) são estruturas ligadas à membrana lipídica de tamanho nanométrico que são liberadas de todas as células, estão presentes em todos os biofluidos e contêm proteínas, ácidos nucleicos e lipídios que refletem a célula-mãe da qual são derivadas. A separação adequada de EVs de outros componentes em uma amostra permite a caracterização de sua carga associada e fornece informações sobre seu potencial como comunicadores intercelulares e biomarcadores não invasivos para inúmeras doenças. No presente estudo, os EVs derivados de oligodendrócitos foram isolados de meios de cultura celular usando uma combinação de técnicas de ponta, incluindo ultrafiltração e cromatografia de exclusão de tamanho (SEC) para separar os EVs de outras proteínas extracelulares e complexos proteicos. Usando colunas SEC comercialmente disponíveis, os EVs foram separados de proteínas extracelulares liberadas de células de oligodendroglioma humano sob condições de estresse de controle e retículo endoplasmático (RE). Os marcadores canônicos de EV CD9, CD63 e CD81 foram observados nas frações 1-4, mas não nas frações 5-8. GM130, uma proteína do aparelho de Golgi, e a calexina, uma proteína integral do RE, foram utilizadas como marcadores negativos de EV, e não foram observadas em nenhuma fração. Além disso, ao agrupar e concentrar as frações 1-4 como fração EV e as frações 5-8 como fração proteica, observou-se expressão de CD63, CD81 e CD9 na fração EV. A expressão de GM130 ou calexina não foi observada em nenhum dos tipos de fração. As frações agrupadas das condições de estresse de controle e ER foram visualizadas com microscopia eletrônica de transmissão e vesículas foram observadas nas frações EV, mas não nas frações proteicas. Partículas no EV e frações proteicas de ambas as condições também foram quantificadas com análise de rastreamento de nanopartículas. Juntos, esses dados demonstram que a SEC é um método eficaz para separar EVs de meios de cultura de células condicionadas.

Western blotting revela separação adequada de EVs de CCM Para avaliar a efetividade da SEC na separação de EVs dos meios de cultura celular, foi realizado um western blot utilizando cada fração individual das amostras controle para sondar a expressão dos três marcadores canônicos de EV, CD9, CD63 e CD81, bem como GM130 e calexina18, que foram utilizados como controles negativos (Figura 3). A expressão da albumina18 também fo...

O protocolo aqui demonstra que as vesículas extracelulares podem ser adequadamente separadas de meios de cultura celular condicionados usando cromatografia de exclusão de tamanho.

Cromatografia de Exclusão de Tamanho para Separação de Vesículas Extracelulares de Meios de Cultura Celular Condicionada

Extracellular vesicles (EVs) are nano-sized lipid-membrane bound structures that are released from all cells, are present in all biofluids, and contain ...

A separação de vesículas extracelulares de fluidos como meios de cultura de células de condição pode permitir que os pesquisadores caracterizem a carga vesticular e explorem seus mecanismos de comunicação intracelular. Esta técnica permite uma separação suficiente de EVs e proteínas extracelulares de meios de cultura de células condicionadas que é simples e fácil de usar. Para começar, coloque o PBS em um banho de água de 37 graus Celsius.Observe os frascos de cultura celular tratados com tunicamicina sob um microscópio composto com lente objetiva de 10 x e 100 x. Tome nota das eventuais diferenças entre os frascos. Retire o meio do balão e coloque-o num tubo de 50 mililitros.Em seguida, centrifugar o tubo a 500 G por cinco minutos a quatro graus Celsius e transferir o super nadante para um novo tubo. Centrifugar o tubo a 2000 G durante 20 minutos a quatro graus Celsius. Transfira o super natante para um novo tubo e coloque o tubo no gelo.Pegue quatro unidades de ultrafiltração de corte de 15 mililitros e três quilodaltons e adicione cinco mililitros de PBS a cada tubo. Prepare os filtros centrifugando as unidades a 4.000 G por 10 minutos a quatro graus Celsius. Depois de remover o PBS das unidades, divida o sobrenadante das condições de controle e tratamento em duas unidades de ultrafiltração, cada uma com aproximadamente 12,5 mililitros de meio em cada.Centrifugar os tubos a 4 000 g durante uma hora e 45 minutos a quatro graus Celsius ou até que o meio concentrado ou a retenção em cada unidade esteja concentrado a 250 microlitros ou menos. Transfira o retentado de ambas as unidades de controle para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro rotulado e das unidades tratadas para outro tubo. Meça o volume total do retentado em cada micro tubo de centrífuga.Se o volume for inferior a 500 microlitros, adicione 0,22 mícron filtrado PBS até que o volume final seja de 500 microlitros. Coloque os tubos em um congelador de menos 80 graus Celsius. Ligue o coletor automático de frações ou AFC.Remova a coluna de quatro graus Celsius e permita que a coluna aqueça até a temperatura ambiente. Remova as amostras de retentado do congelador de menos 80 graus Celsius e coloque-as no gelo para descongelar, enquanto espera, coloque oito tubos rotulados de 1,5 mililitro no carrossel AFC com tampas voltadas para dentro. Insira a coluna no AFC com o código de barras voltado para o leitor e ajuste as configurações para coletar oito frações de 500 microlitros cada e buffer de volume para o padrão.Em seguida, verifique as instruções na tela para iniciar a coleção. Depois que o buffer de armazenamento é completamente absorvido pela parte superior da matriz da coluna. Comece a lavar a coluna adicionando 15 mililitros de PBS à coluna.Não adicione PBS muito cedo, pois ele diluirá o buffer de armazenamento e evitará a lavagem adequada. Pouco antes de todos os 15 mililitros de PBS serem absorvidos pela matriz, clique em OK para parar a descarga e remover qualquer PBS residual do topo da matriz da coluna com uma micropipeta. Não toque na matriz.Adicione 500 microlitros de amostra ao centro da coluna e clique em OK para iniciar a execução. Depois que a amostra for totalmente absorvida pela matriz, adicione imediatamente oito mililitros de PBS à coluna. O AFC dissipa automaticamente o volume vazio para o centro do carrossel antes de coletar todas as oito frações de 500 microlitros cada.Após a corrida, retire as frações do carrossel e coloque-as no gelo. Em seguida, remova o volume vazio do centro do carrossel. Em seguida, adicione 10 mililitros de PBS à coluna para lavar qualquer amostra residual da coluna.E uma vez que a amostra arrependida tenha sido totalmente lavada, adicione 15 mililitros de PBS à coluna. Como o PBS final está sendo absorvido pela matriz, adicione 500 microlitros de hidróxido de sódio 0,5 molar ao centro da matriz da coluna. Em seguida, à medida que o hidróxido de sódio é absorvido, adicione 30 mililitros de PBS à coluna e deixe-o lavar.Uma vez feito com todas as amostras, preserve a coluna para uso posterior, adicionando 15 mililitros de azida de sódio a 0,05% à coluna. Deixe aproximadamente cinco mililitros de azida de sódio no topo da matriz da coluna. Remova a coluna do AFC e prenda as tampas superior e inferior antes de colocar a coluna a quatro graus Celsius para armazenamento.Construa a unidade de ultrafiltração. Obter dois mililitros, três unidades de ultrafiltração de corte de quilodalton por amostra. Cada unidade é composta por três partes, cone, filtro e fluxo através do cilindro.Rotule cada peça corretamente. Adicione um mililitro de PBS à porção do filtro e tampe com a peça do cone. Centrifugar o cone da unidade de ultrafiltração de lado para cima a 3.500 G por 10 minutos a quatro graus Celsius e remover o PBS filtrado do fluxo através do cilindro.Vire a unidade de ultrafiltração de cabeça para baixo e centrifugar por dois minutos a 1000 G a quatro graus Celsius para remover qualquer PBS restante. Combine quatro 500 microlitros de cada fração e adicione-os à unidade de ultrafiltração. Em seguida, as colunas de centrífuga coincidem por uma hora, 45 minutos a 3.500 G a quatro graus Celsius ou até que o nível de retentado esteja em 100 microlitros.Remova o fluxo através do cilindro e descarte o fluxo através de. Vire a unidade de ultrafiltração de cabeça para baixo e centrifugar por dois minutos a 1000 XG a quatro graus Celsius. Transfira o retentado no cone para um tubo de 1,5 mililitro e faça o volume da amostra para 150 microlitros com PBS filtrado de 0,22 mícron antes de colocar os tubos em menos 80 graus Celsius congelador.Um bloco ocidental representativo de frações individuais mostrou forte expressão de CD9, CD63 e CD81. Infrações de um a quatro com pouca ou nenhuma expressão infrações de cinco a oito. Nenhuma expressão de GM130 ou calexina foi observada em nenhuma fração.A albumina só estava presente nas frações seis a oito. A eficácia da concentração das frações EV e proteica também foi avaliada. A expressão de CD9 e CD63 foi observada nos lisatos celulares.Todas as três proteínas CD estavam presentes nas frações EV das amostras de controle e tratadas com tunicamicina, mas não nas frações proteicas. O gene de suscetibilidade tumoral 101 estava presente em lisatos celulares, mas não em frações EV ou proteicas. O GM130 e a calexina foram observados apenas nos lisatos celulares.No western blot de meios de cultura celular esgotados por exossomos, os marcadores EV estavam presentes nos lisados celulares, mas não nas amostras de meios. A expressão de albumina foi observada nas frações proteicas e a expressão mínima nos lisados celulares. As observações do MET demonstraram estruturas esféricas nas frações EV das amostras tratadas com tunicamicina.Essas estruturas não foram observadas em nenhuma das frações proteicas do tipo amostral. A análise de rastreamento de nanopartículas revela diferenças nas concentrações de partículas de controle e frações tratadas em frações EV em comparação com o controle, um pouco mais de partículas estavam presentes no tratamento com tunicamicina. No entanto, nas frações proteicas, menos partículas foram detectadas em relação aos EVs.É importante ter o mesmo volume de amostra para as condições de controle e tratadas, permitindo uma fácil comparação de EVs dos diferentes tratamentos. Após a separação dos EVs do meio de cultura celular da condição, podemos caracterizar o conteúdo de proteínas, RNA e lipídios das vesículas com sequenciamento de RNA proteômico e lipidômica.

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Fonte: Watson, D. C., et al. Isolamento e purificação escaláveis de vesículas extracelulares de Escherichia coli e outras bactérias. J. Vis. Exp. (2021)Este vídeo demonstra o uso da cromatografia de exclusão de tamanho com esferas de resina porosa para isolar vesículas extracelulares bacterianas (EVs) de um filtrado de cultura bacteriana. EVs maiores eluem cedo, contornando os poros da resina, enquanto proteínas menores entram nos poros e eluem mais tarde.

Isolamento de Vesículas Extracelulares Bacterianas Usando Cromatografia de Exclusão de Tamanho 

Este vídeo descreve um método baseado em cromatografia de exclusão de tamanho (SEC) para isolar vesículas extracelulares ou EVs derivadas das células imunológicas do cérebro - a microglia. Os EVs atuam como carga molecular para fornecer mediadores, que regulam uma resposta imune. Portanto, os EVs isolados podem ser usados como um modelo in vitro para estudar a interferência microglia-neurônio durante uma resposta imune neuronal.

Isolamento baseado em SEC de vesículas extracelulares derivadas de microglia: uma técnica para isolar vesículas extracelulares de meios de cultura condicionados por microglia

Este vídeo demonstra o método de purificação baseado em ultracentrifugação com gradiente de densidade para isolar subpopulações de vesículas extracelulares adequadas para estudos de caracterização.

Purificação de subpopulações de vesículas extracelulares: uma técnica para purificar subpopulações de vesículas extracelulares usando ultracentrifugação com gradiente de densidade

Neste vídeo, demonstramos uma técnica - cromatografia de exclusão de tamanho - para separar uma população heterogênea de vesículas de membrana externa ou OMVs derivadas de bactérias. Essas vesículas são estruturas esféricas nanométricas e são separadas em subpopulações grandes e pequenas com base em seu tamanho por meio de cromatografia de exclusão de tamanho.

Separação baseada em cromatografia de exclusão de tamanho de vesículas extracelulares bacterianas: uma técnica para separar a população heterogênea de vesículas bacterianas da membrana externa gram-negativas com base em seu tamanho

Este vídeo demonstra a técnica de cromatografia de exclusão de tamanho (SEC) para purificar vesículas extracelulares bacterianas (EVs) do filtrado de cultura de Mycobacterium tuberculosis (Mtb). A técnica utiliza uma coluna porosa embalada com resina para obter frações purificadas de EVs. As partículas porosas permitem seletivamente que proteínas menores entrem nos poros, resultando em eluição mais lenta. Ao mesmo tempo, os EVs são excluídos de entrar nos poros devido ao seu tamanho maior e são...

Uma técnica de cromatografia de exclusão de tamanho para purificar vesículas extracelulares micobacterianas

Este artigo apresenta métodos para gerar, purificar e quantificar vesículas extracelulares de Caenorhabditis elegans.

Purificação e Análise de Catadores Elegans Extracelulares

As vesículas bacterianas desempenham papéis importantes na patogênese e têm aplicações biotecnológicas promissoras. A heterogeneidade das vesículas complica a análise e o uso; portanto, é necessário um método simples e reprodutível para separar diferentes tamanhos de vesículas. Aqui, demonstramos o uso da cromatografia de exclusão de tamanho para separar vesículas heterogêneas produzidas por Aggregatibacter actinomycetemcomitans.

Cromatografia de exclusão de tamanho para analisar heterogeneidade vesícula de membrana externa bacteriana

As bactérias secretam vesículas extracelulares (EVs) de tamanho nanométrico que transportam moléculas biológicas bioativas. A pesquisa EV se concentra na compreensão de sua biogênese, papel nas interações micróbio-micróbio e hospedeiro-micróbio e doença, bem como suas potenciais aplicações terapêuticas. Um fluxo de trabalho para isolamento escalável de EVs de várias bactérias é apresentado para facilitar a padronização da pesquisa de EV.

Isolamento escalável e purificação de vesículas extracelulares de Escherichia coli e outras bactérias

As vesículas extracelulares são imensamente promissoras para aplicações biomédicas, mas os métodos de isolamento atuais são demorados e impraticáveis para uso clínico. Neste estudo, apresentamos um dispositivo microfluídico que permite o isolamento direto de vesículas extracelulares de grandes volumes de biofluidos de forma contínua com passos mínimos.

Isolamento em Etapa Única de Vesículas Extracelulares de Amostras de Grande Volume com Dispositivo Microfluídico A4F Bifurcado

Este protocolo fornece uma descrição detalhada da classificação de vesículas extracelulares (EVs) liberadas por células estromais mesenquimais. Em particular, ele se concentra na configuração do instrumento e na otimização das condições de classificação. O objetivo é classificar as vesículas extracelulares, preservando suas características.

Configurando uma classificação bem-sucedida para isolamento de vesículas extracelulares

Este protocolo descreve o isolamento de pequenas vesículas extracelulares de músculos esqueléticos murinos e medula óssea usando digestão enzimática e cromatografia de exclusão de tamanho, permitindo a recuperação reprodutível de frações enriquecidas com vesículas de tecidos estruturalmente complexos e de baixo rendimento para análise molecular posterior.

Isolamento de Pequenas Vesículas Extracelulares do Músculo Esquelético Murino e Medula Óssea por Cromatografia de Exclusão de Tamanho

Aprenda a separar vesículas extracelulares de meios de cultura celular condicionada usando cromatografia de exclusão de tamanho. Este método eficiente permite caracterizar o conteúdo vesicular e estudar mecanismos de comunicação intercelular.

Cromatografia de Exclusão de Tamanho para Separação de Vesículas Extracelulares de Meios de Cultura Celular Condicionada

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