Preparação e caracterização de biotinta de hidrogel biohíbrido 3D à base de grafeno para neuroengenharia periférica

O sistema de células-tronco está sob a influência de seus importantes componentes. A preservação e diferenciação das células-tronco é impensável sem a presença de seu microambiente. Esse microambiente, chamado de nicho de células-tronco, é composto por células e arcabouços.

A neuropatia periférica pode ser e, ocasionalmente, pode ser como lesão do plexo braquial, vários traumas, tumores, anomalias autonômicas, definição imunológica e doença metabólica. Vários métodos de cultura 3D foram desenvolvidos para fornecer um nicho melhor e mais natural para as células-tronco. A formação de esferoides e a bioimpressão 3D são métodos relativamente novos e promissores para culturas 3D.

A bioimpressão 3D também pode ser usada em estudos de neuroengenharia. Consequentemente, dentro deste estudo, biotintas à base de grafeno e à base de alginato/gelatina foram desenvolvidas e estudadas por suas características regenerativas. Para começar, cultive células-tronco mesenquimais gelatinosas ou WJMSCs em meio DMEM F12 contendo 10% de soro fetal de bezerro ou FBS, 1% de pena/estreptococo e 1% de L-glutamina sob um fluxo laminar estéril à temperatura ambiente.

Quando as células cultivadas estiverem 80% confluentes no frasco, despeje o meio e lave as células com cinco mililitros de PBS. Em seguida, adicione cinco mililitros de 0,25% de tripsina e 2,21 milimolares de sódio EDTA e incube a 37 graus Celsius. Após cinco minutos, adicionar 10 mililitros de meio DMEM F12 contendo 10% de FBS às células.

Suspender as células, coletar o meio e transferi-lo para um tubo centrífugo. Em seguida, centrifugar as células e descartar o sobrenadante antes de ressemear as células em um novo frasco com um meio nutriente fresco contendo 10% de SFB. Para preparar a biotinta do grupo controle sem grafeno, pesar 4,5 miligramas de alginato e 1,5 miligramas de gelatina e transferi-los para um tubo de centrífuga.

Em seguida, adicione 50 mililitros de meio DMEM F12 contendo 10% FBS ao tubo. Novamente, pese 4,5 miligramas de alginato e 1,5 miligramas de gelatina e transfira-os para um tubo de centrífuga. Em seguida, adicione 50 microlitros de grafeno a 0,1% ao tubo e faça o volume de 50 mililitros com meio DMEM F12 contendo 10% de FBS.

Misture as biotintas por pipetagem e vórtice antes de autoclavar a 121 graus Celsius sob 1,5. pressão atmosférica por 20 minutos. Após a autoclavagem, centrifugar a solução para remover as bolhas formadas e colocar as biotintas a 37 graus Celsius até que as células estejam preparadas.

Para a interação de biotinta celular, crie os grupos de biotinta. O grupo um inclui impressão 3D-B e 3D-G com biotinta para bioimpressão. O grupo dois inclui biotintas 3D-BS e 3D-GS nas quais esferoides foram formados após bioimpressão.

Para o grupo um, conte as células de uma por 10 até a sétima célula em 0,5 mililitros de meio. Em seguida, adicione 4,5 mililitros de biotinta. Transfira a mistura para os cartuchos no armário estéril usando seringas.

Instale os cartuchos na seção da extrusora correspondente da bioimpressora. Para o segundo grupo, pegue cinco mililitros de biotinta de cada um dos grupos de biotinta e transfira-os para cartuchos estéreis com a ajuda de um injetor. Use a bioimpressora com duas cabeças de impressão coaxiais e a tecnologia de extrusão acionada pneumática.

Defina a resolução XYZ por micropasso para 1,25 micrômetros, a largura de extrusão para 400 micrômetros e a altura de extrusão para 200 micrômetros. Use uma grade de 20 por 20 por 5 milímetros para criar modelos 3D. Crie modelos 3D usando programas CAD baseados na web de código aberto.

Para o processo de bioimpressão 3D, ajuste a pressão média da impressora para 7,5 psi. Em seguida, defina a temperatura do cartucho e da cama para 37 graus Celsius e a velocidade para 60% Coloque o sistema na posição inicial durante a fase de escrita. Posicione os eixos automaticamente e selecione e ajuste a extrusora antes de iniciar o processo de bioimpressão.

Após a impressão, retire a amostra e coloque-a sob um gabinete de fluxo laminar. Em seguida, borrife as biotintas com solução de cloreto de cálcio normal 0,1 ou adicione uma solução de mililitro com uma pipeta à temperatura ambiente e aguarde de 10 a 20 segundos. Em seguida, lave os padrões impressos duas vezes com PBS contendo cálcio e magnésio.

Adicione dois mililitros de meio DMEM F12 com 10%FBS em cima de cada célula contendo grupo de biotinta e incube as placas a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono por 30 minutos. Em seguida, adicione dois mililitros de meio de suspensão contendo uma por 10 até a sexta célula a cada grupo e incube as placas. Após 24 horas, observar e fotografar todos os lotes de biotinta para formação de esferoides em microscópio invertido para diferenciação de WJMSCs em células semelhantes a neurônios, exceto o grupo controle.

Adicione dois mililitros de meio de diferenciação neurogênica por poço e refresque a cada dois dias. Seguir por sete dias para observar a diferenciação neural. Em seguida, usando imagens de timelapse, examine os efeitos do grafeno em células-tronco e monitore as interações celulares dentro da biotinta.

O efeito da concentração de grafeno sobre a proliferação celular é demonstrado aqui. Em relação ao controle, observou-se decréscimo significativo para a concentração de 0,001% de grafeno. Não houve diferenças significativas entre os demais grupos e o controle.

As interações celulares com grafeno mostraram que o grafeno foi tolerado no sistema 2D e foi absorvido pelas células através de endocitose. Imagens de timelapse mostraram que as células que sobreviveram no meio de grafeno 3D mantiveram suas vitalidades através do brilho da GFP até o final da incubação. Imagens de MEV e análise FIIR dos grupos de biotintas 3D-B e 3D-G são mostradas aqui.

As interações celulares com biotinta foram demonstradas tanto na superfície quanto internamente. As células estavam morfologicamente redondas e aderidas ao material. Na diferenciação neuronal 3D, considerou-se que as bordas das células esferoides em ambos os grupos eram transparentes e vivas, e os esferoides no grupo grafeno eram relativamente maiores e aprisionavam o grafeno dentro da célula.

A imunomarcação de células 2D e 3D é mostrada aqui. As imagens verdes representam estruturas semelhantes a neurônios. A amostra de controle positivo 2D expressou menos marcadores de estrutura semelhante a neurônios do que as amostras 3D.

Descobrimos que as biotintas à base de grafeno foram mais bem-sucedidas em termos de diferenciação de células-tronco em células semelhantes a neurônios. Propomos que as biotintas à base de grafeno seriam excelentes ferramentas para o tratamento de distúrbios nervosos periféricos em estudos futuros. Hoje, o sistema de células-tronco pode ser criado por engenharia de tecidos com biomateriais naturais e sintéticos A criação de tecidos artificiais que podem substituir tecidos vivos que podem ser usados na regeneração desses tecidos, removendo o dano, e fornecendo função é fornecida pela engenharia de tecidos.